本發(fā)明涉及類(lèi)酵母真菌抑制霜霉病的應(yīng)用，屬于微生物應(yīng)用技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

霜霉病是由真菌中的霜霉菌引起的植物病害。

葡萄霜霉病是一種真菌病害，它是葡萄上的一類(lèi)重要的病害。葡萄霜霉病的普遍發(fā)生造成了果實(shí)的大量減產(chǎn)，嚴(yán)重影響了果實(shí)的食用價(jià)值和市場(chǎng)價(jià)值，導(dǎo)致了果農(nóng)的經(jīng)濟(jì)收入降低，嚴(yán)重制約了我國(guó)葡萄產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。無(wú)論在發(fā)達(dá)國(guó)家，還是在發(fā)展中國(guó)家，由于缺少必要的有效防控藥劑，葡萄霜霉病引起的損失量占總量的20％以上。葡萄霜霉病的發(fā)生已給現(xiàn)代葡萄生產(chǎn)尤其是高端葡萄產(chǎn)品生產(chǎn)與加工造成了嚴(yán)重影響。

葡萄霜霉病主要危害葉片，也能侵染新梢幼果等幼嫩組織。葉片被害，初生淡黃色水漬狀邊緣不清晰的小斑點(diǎn)，以后逐漸擴(kuò)大為褐色不規(guī)則形或多角形病斑，數(shù)斑相連變成不規(guī)則形大斑。天氣潮濕時(shí)，于病斑背面產(chǎn)生白色霜霉?fàn)钗铮床【逆吣夜：玩咦幽?。發(fā)病嚴(yán)重時(shí)病葉早枯早落。嫩梢受害，形成水漬狀斑點(diǎn)，后變?yōu)楹稚园枷莸牟“?，潮濕時(shí)病斑也產(chǎn)生白色霜霉。病重時(shí)新梢扭曲，生長(zhǎng)停止，甚至枯死。卷須、穗軸、葉柄有時(shí)也能被害，其癥狀與嫩梢相似。幼果被害，病部褪色，變硬下陷，上生白色霜霉，很易萎縮脫落。果粒半大時(shí)受害，病部褐色至暗色，軟腐早落。果實(shí)著色后不再侵染。

葡萄霜霉病病原為葡萄霜霉菌，屬鞭毛菌亞門(mén)，卵菌綱霜霉目，單軸霉屬。葡萄霜霉病菌以卵孢子在病組織中越冬，或隨病葉殘留于土壤中越冬。次年在適宜條件下卵孢子萌發(fā)產(chǎn)生芽孢囊，再由芽孢囊產(chǎn)生游動(dòng)孢子，借風(fēng)雨傳播，自葉背氣孔侵入，進(jìn)行初次侵染。經(jīng)過(guò)7-12天的潛育期，在病部產(chǎn)生孢囊梗及孢子囊，孢子萌發(fā)產(chǎn)生游動(dòng)孢子進(jìn)行再次侵染。孢子囊萌發(fā)適宜溫度為10℃～15℃。游動(dòng)孢子萌發(fā)的適宜溫度為18℃-24℃。秋季低溫，多雨多露，易引起病害流行。果園地勢(shì)低洼、架面通風(fēng)不良樹(shù)勢(shì)衰弱，有利于病害發(fā)生。

2014年我國(guó)葡萄栽培面積已經(jīng)超過(guò)80萬(wàn)公頃，僅次于西班牙，超過(guò)法國(guó)是世界上葡萄有效種植面積第二大國(guó)，而且葡萄種植面積還在逐步增加。目前，葡萄霜霉病的普遍發(fā)生已成為制約我國(guó)葡萄產(chǎn)業(yè)發(fā)展的一個(gè)重要因素。應(yīng)用殺菌劑防治葡萄霜霉病是降低果品損失的重要手段；目前國(guó)內(nèi)應(yīng)用于葡萄霜霉病防治的有效化學(xué)藥劑較少，且其使用后殘效期較長(zhǎng)，不易降解，會(huì)影響一些高端果品的對(duì)外出口，更重要的是，化學(xué)藥劑的大范圍應(yīng)用容易使得一些病原菌產(chǎn)生抗藥性。因此，亟需開(kāi)發(fā)和應(yīng)用新型環(huán)保型殺菌劑。

生物殺菌劑相對(duì)于化學(xué)農(nóng)藥而言有著天然優(yōu)勢(shì),避免了農(nóng)藥殘留、環(huán)境污染、抗藥性等問(wèn)題，而且低毒、環(huán)保、持效且自然界生態(tài)兼容性較好。目前，國(guó)內(nèi)生物農(nóng)藥開(kāi)發(fā)主要集中在Bt殺蟲(chóng)劑、農(nóng)用抗生素、細(xì)菌源生防制劑等幾個(gè)方面，防治對(duì)象多集中于大田作物病害。但是針對(duì)葡萄霜霉病防治方面，生防應(yīng)用研究進(jìn)行的相對(duì)較少，且目前國(guó)內(nèi)還沒(méi)有能夠用于葡萄霜霉病防治的生防菌劑產(chǎn)品。較之產(chǎn)抗生素類(lèi)細(xì)菌和有絲真菌類(lèi)生防菌，以類(lèi)酵母菌或酵母菌為主體開(kāi)發(fā)的殺菌劑在防治果實(shí)病害上，顯得更為安全、環(huán)保。

酵母菌及類(lèi)酵母真菌源生物殺菌劑有著獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)：(1)與一些生防細(xì)菌相比較，不產(chǎn)生抗生素，對(duì)環(huán)境的負(fù)面影響較??；(2)與一些有絲真菌類(lèi)生防菌相比，不產(chǎn)生致敏孢子；(3)生長(zhǎng)要求簡(jiǎn)單，易于大規(guī)模發(fā)酵生產(chǎn)。因此，開(kāi)發(fā)采后病害酵母源殺菌劑成為近年來(lái)國(guó)際果實(shí)病害防治和果品食品安全研究領(lǐng)域中一個(gè)新的方向和趨勢(shì)。

類(lèi)酵母真菌Pseudozyma fusiformata來(lái)自于自然環(huán)境中，主要存在于含糖量較為豐富的果實(shí)表面和花上，是植物微生態(tài)系統(tǒng)中的優(yōu)勢(shì)微生物種群之一。類(lèi)酵母真菌Pseudozyma fusiformata SF6，保藏號(hào)為：CGMCC No.8577，為本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)、分離并保藏，其在中國(guó)專(zhuān)利文獻(xiàn)CN103937689A中公開(kāi)。該菌生長(zhǎng)速度快，營(yíng)養(yǎng)簡(jiǎn)單，生長(zhǎng)力強(qiáng)。在作為生防菌應(yīng)用方面，它擁有自己獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)：1)該菌對(duì)環(huán)境的污染較少，不產(chǎn)生毒素；2)該菌不產(chǎn)生抗生素，對(duì)人類(lèi)相對(duì)比較安全；3)相對(duì)于其他真菌而言，該菌不產(chǎn)生致敏孢子；4)該菌所需營(yíng)養(yǎng)比較簡(jiǎn)單；5)該菌適合商業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)。因此，它具有很好的應(yīng)用前景。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供類(lèi)酵母真菌Pseudozyma fusiformata SF6，保藏號(hào)為：CGMCC No.8577的在抑制霜霉病中的新應(yīng)用。

為此，本發(fā)明的技術(shù)方案如下：

類(lèi)酵母真菌的下述任一應(yīng)用：

(1)在抑制霜霉病病害中的應(yīng)用；

(2)在制備霜霉病病害抑制劑中的應(yīng)用；

所述類(lèi)酵母真菌為Pseudozyma fusiformata SF6，保藏號(hào)為：CGMCC No.8577。

上述應(yīng)用中，所述霜霉病為葡萄霜霉病。

類(lèi)酵母真菌的下述任一應(yīng)用：

(1)在抑制霜霉病病菌中的應(yīng)用；

(2)在制備霜霉病病菌抑制劑中的應(yīng)用；

所述類(lèi)酵母真菌為Pseudozyma fusiformata SF6，保藏號(hào)為：CGMCC No.8577。

上述應(yīng)用中，所述霜霉病病菌為葡萄霜霉病病原菌。

上述應(yīng)用中，所述葡萄霜霉病病原菌為Plasmopara viticola。

一種葡萄霜霉病病原菌抑制劑，含有類(lèi)酵母真菌Pseudozyma fusiformata SF6或其菌液，其中所述類(lèi)酵母真菌的濃度大于10⁶cfu/ml。

上述抑制劑中，所述葡萄霜霉病病原菌為Plasmopara viticola。

一種葡萄霜霉病病害抑制劑，含有類(lèi)酵母真菌Pseudozyma fusiformata SF6或其菌液，其中所述類(lèi)酵母真菌的濃度大于10⁶cfu/ml。

所述類(lèi)酵母真菌(Pseudozyma fusiformata)SF6菌液為所述類(lèi)酵母真菌(Pseudozyma fusiformata)SF6的發(fā)酵液或生長(zhǎng)液或培養(yǎng)基。

可按照如下方法制備：在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述類(lèi)酵母真菌(Pseudozyma fusiformata)SF6，除去液體培養(yǎng)物(發(fā)酵液)中的所述類(lèi)酵母真菌(Pseudozyma fusiformata)SF6即得到所述類(lèi)酵母真菌的菌液。

本發(fā)明的有益效果為：

本發(fā)明中提供的類(lèi)酵母真菌(Pseudozyma fusiformata)SF6的一種新的應(yīng)用，即對(duì)霜霉病病害和病原菌的抑制作用；尤其是對(duì)于葡萄霜霉病的抑制作用。葉盤(pán)法生物測(cè)定實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，類(lèi)酵母真菌Pseudozyma fusiformata SF6可以有效抑制葡萄霜霉病，將類(lèi)酵母真菌Pseudozyma fusiformata SF6應(yīng)用于抑制葡萄霜霉病或制備葡萄霜霉病抑制劑可以減少化學(xué)制劑帶來(lái)的環(huán)境污染，該菌生長(zhǎng)速度快，營(yíng)養(yǎng)簡(jiǎn)單，生長(zhǎng)力強(qiáng)，不產(chǎn)生毒素，不產(chǎn)生抗生素，相對(duì)比較安全；該菌不產(chǎn)生致敏孢子；所需營(yíng)養(yǎng)比較簡(jiǎn)單；適合商業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)，并且成本低。

附圖說(shuō)明

圖1.類(lèi)酵母真菌(Pseudozyma fusiformata)SF6在葡萄葉盤(pán)上對(duì)葡萄霜霉病菌(Plasmopara viticola)的抑制效果:a)SF6-10⁸cfu/ml濃度下對(duì)葡萄霜霉病菌(Plasmopara viticola)的抑制效果；b)SF6-10⁷cfu/ml濃度下對(duì)葡萄霜霉病菌(Plasmopara viticola)的抑制效果；c)SF6-10⁶cfu/ml濃度下對(duì)葡萄霜霉病菌(Plasmopara viticola)的抑制效果；d)僅接種葡萄霜霉病菌(Plasmopara viticola)的對(duì)照組發(fā)病情況。

具體實(shí)施方式

以下的實(shí)施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。

下述實(shí)施例中所用的材料和試劑，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑得到。

下述實(shí)施例中所用到的病原菌，公眾可從野外采集，也可從北京市農(nóng)林科學(xué)院獲得，以重復(fù)本申請(qǐng)實(shí)驗(yàn)：

葡萄霜霉病病原菌(Plasmopara viticola)-為北京市農(nóng)林科學(xué)院植物保護(hù)環(huán)境保護(hù)研究所張殿朋博士田間采集、鑒定和保藏。

實(shí)施例1、類(lèi)酵母真菌(Pseudozyma fusiformata)SF6和植物霜霉病病原菌的培養(yǎng)

類(lèi)酵母真菌(Pseudozyma fusiformata)SF6可以從有機(jī)水果上分離菌株，采用常規(guī)梯度稀釋涂布分離，用PDA(含有硫酸鏈霉素)和YPD瓊脂(含有硫酸鏈霉素)共2種培養(yǎng)基分別在28℃條件下培養(yǎng)，挑取菌落形態(tài)差異較大并可純培養(yǎng)的菌菌落，在YPD瓊脂培養(yǎng)基上純化保存。

類(lèi)酵母真菌(Pseudozyma fusiformata)SF6可以在YPD瓊脂培養(yǎng)基上和PDA培養(yǎng)基上28℃下生長(zhǎng)，生長(zhǎng)48小時(shí)后，菌落為奶油狀、乳白色不透明，扁平或圓形，邊緣整齊，菌落無(wú)褶皺。

供試病植物霜霉病病原菌：

葡萄霜霉病菌(Plasmopara viticola)。

具體操作如下：

類(lèi)酵母真菌(Pseudozyma fusiformata)SF6菌株在PDA培養(yǎng)基上28℃恒溫培養(yǎng)48h。然后接種于YPD液體培養(yǎng)基中，28℃恒溫?fù)u床培養(yǎng)48h，備用。用蒸餾水或培養(yǎng)基調(diào)至菌液濃度分別為10⁵cfu/ml，10⁶cfu/ml，10⁷cfu/ml，10⁸cfu/ml。

葡萄霜霉病菌(Plasmopara viticola)由田間采集的發(fā)病葡萄葉片上分離經(jīng)再次接種健康葡萄葉片進(jìn)行擴(kuò)繁而成，擴(kuò)繁的病原菌懸浮液，在-20℃下保存，使用時(shí)用蒸餾水制成孢子懸浮液，濃度為10⁴cfu/ml。

實(shí)施例2、類(lèi)酵母真菌(Pseudozyma fusiformata)SF6抑菌活性的測(cè)定

選擇易感葡萄品種(紅乳)葉片進(jìn)行葉盤(pán)法測(cè)定。

供試病原菌：

葡萄霜霉病菌(Plasmopara viticola)。

選擇易感葡萄品種(紅乳)葉片進(jìn)行葉盤(pán)法測(cè)定。

把采集的葡萄葉片先用自來(lái)水沖洗干凈，然后用75％乙醇消毒30秒，再用無(wú)菌水徹底沖洗干凈，然后用打孔器，獲取直徑1.5cm的葉盤(pán)。然后，把葉盤(pán)放置于鋪有一層滅過(guò)菌紗布(2-3層)的培養(yǎng)皿中，無(wú)菌操作臺(tái)中，吹4-5分鐘，然后把葉盤(pán)浸泡于類(lèi)酵母真菌(Pseudozyma fusiformata)SF6發(fā)酵液中30-60秒，然后取出葉盤(pán)回放置于含有滅菌紗布的培養(yǎng)皿中，葉盤(pán)背面向上。無(wú)菌操作臺(tái)中，吹1-2分鐘，然后，從4度冰箱中，取出葡萄霜霉病病菌孢子懸浮液(10⁴cfu/ml),用移液器，取20μl分別接種于每個(gè)葉盤(pán)背面，放置5-10分鐘，然后防治于相對(duì)濕度為80-90％，溫度為22度，黑暗交替的培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。以?xún)H接種病原菌的葉盤(pán)為對(duì)照，每個(gè)處理三次重復(fù)，培養(yǎng)7-10天，觀察葉盤(pán)葡萄霜霉病發(fā)病情況。

根據(jù)發(fā)病葉盤(pán)數(shù)占總接種葉盤(pán)數(shù)的多少，計(jì)算發(fā)病率，未發(fā)病的葉盤(pán)數(shù)占總接種葉盤(pán)數(shù)的多少，計(jì)算病害抑制率，結(jié)果見(jiàn)表1和圖1。

表1.類(lèi)酵母真菌(Pseudozyma fusiformata)SF6對(duì)葡萄霜霉病的抑制效果

上述結(jié)果說(shuō)明，類(lèi)酵母真菌(Pseudozyma fusiformata)SF6對(duì)葡萄霜霉病具有較好的抑制功能。