本發(fā)明是關(guān)于一種馬蹄腎動(dòng)物模型的創(chuàng)建方法，具體而言，本發(fā)明是關(guān)于一種通過給孕期動(dòng)物注射視黃酸來構(gòu)建馬蹄腎動(dòng)物模型的方法。

背景技術(shù)：

先天性腎臟和尿路異常(congenital anomalies of the kidney and urinary tract，CAKUT)包括胚胎腎臟發(fā)育過程中的各種結(jié)構(gòu)畸形。CAKUT占全部先天性畸形的20％-30％，國(guó)外文獻(xiàn)報(bào)告CAKUT的患病率為3‰-6‰；國(guó)內(nèi)回顧性分析近7年北京市140余萬胎嬰兒出生缺陷的監(jiān)測(cè)資料，發(fā)現(xiàn)北京市先天性腎臟畸形所占比例為1.25‰。歐洲透析登記數(shù)據(jù)顯示CAKUT是兒童終末期腎病的主要原因，約41.3％的兒童接受了腎臟替代治療。歐洲有＞20萬病人經(jīng)歷過腎移植，其中CAKUT患者腎移植的中位年齡是31歲，非CAKUT患者的中位年齡是61歲。提示CAKUT是常見的、有害的。

馬蹄腎是CAKUT的一種，是最常見的先天性腎臟融合畸形。90％以上的馬蹄腎患者表現(xiàn)為下極融合，以腎實(shí)質(zhì)或纖維組織構(gòu)成峽部。馬蹄腎常常合并泌尿系感染、結(jié)石、腎積水、腎囊腫、腎腫瘤以及腎小球疾病等并發(fā)癥。由于腎臟結(jié)構(gòu)復(fù)雜，外科手術(shù)及內(nèi)科經(jīng)皮腎活檢等操作困難，甚至用常規(guī)的同位素腎圖評(píng)價(jià)馬蹄腎的腎小球?yàn)V過率都嚴(yán)重低估、不準(zhǔn)確。長(zhǎng)期以來，對(duì)于馬蹄腎的發(fā)生發(fā)展機(jī)制及藥物和手術(shù)的干預(yù)研究沒有突破性進(jìn)展，其重要原因是沒有適合的馬蹄腎動(dòng)物模型。由于沒有馬蹄腎的動(dòng)物模型，至今發(fā)病機(jī)制不清、缺乏有效的干預(yù)措施。因此，創(chuàng)建馬蹄腎的動(dòng)物模型，研究其發(fā)生發(fā)展的詳細(xì)過程和確切的分子機(jī)制，對(duì)于解密馬蹄腎等CAKUT的形成機(jī)制、最終減少CAKUT等出生缺陷的發(fā)生，具有重要的意義。

文獻(xiàn)“Robo2調(diào)控小鼠腎臟發(fā)育信號(hào)通路機(jī)制的研究”(劉穎，《南昌大學(xué)》2013年)記載了孕鼠喂食視黃酸后胚腎和輸尿管發(fā)育異常，腎臟體積減小，腎臟腎盂擴(kuò)張，輸尿管彎曲擴(kuò)張畸形，輸尿管與腎臟連接異常，輸尿管與膀胱連接異常，還可出現(xiàn)“馬蹄腎”畸形。其中出現(xiàn)馬蹄腎畸形純屬偶然，按照該文獻(xiàn)記載的方法重復(fù)實(shí)驗(yàn)，出現(xiàn)馬蹄腎畸形的概率低，重復(fù)性差。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種馬蹄腎動(dòng)物模型的創(chuàng)建方法，為馬蹄腎的機(jī)制研究提供技術(shù)平臺(tái)，為有效治療馬蹄腎提供科學(xué)依據(jù)。

本案發(fā)明人在研究中發(fā)現(xiàn)，在小鼠受孕的特定時(shí)間點(diǎn)，給孕鼠一次性注射特定濃度和劑量的視黃酸溶液，可誘發(fā)馬蹄腎。受孕時(shí)間過早或過晚、視黃酸劑量過少或過大，都不會(huì)形成馬蹄腎。

據(jù)此，本發(fā)明提供了馬蹄腎動(dòng)物模型的創(chuàng)建方法，該方法包括：

在受孕動(dòng)物的妊娠早期一次性注射一定量的視黃酸溶液，飼養(yǎng)分娩，得到馬蹄腎動(dòng)物模型。

視黃酸是維生素A的活性代謝產(chǎn)物，視黃酸過量或嚴(yán)重缺乏可以導(dǎo)致馬蹄腎在內(nèi)的多種畸形，甚至死胎。這在國(guó)內(nèi)外早有報(bào)告，但均具有偶然性。本案發(fā)明人通過大量的實(shí)驗(yàn)研究，使原來的“視黃酸可能誘發(fā)馬蹄腎”這一意外的、不可控、不能量化、不能重復(fù)的客觀“現(xiàn)象”，變成一種可控、可量化、可重復(fù)的馬蹄腎動(dòng)物模型的創(chuàng)建方法。

根據(jù)本發(fā)明的具體實(shí)施方案，本發(fā)明的馬蹄腎動(dòng)物模型的創(chuàng)建方法中，所述動(dòng)物選自：小鼠或大鼠。

本發(fā)明的具體實(shí)施方案表明，在小鼠受孕的特定時(shí)間點(diǎn)給孕期小鼠注射特定量的視黃酸可以導(dǎo)致胎鼠馬蹄腎，且重復(fù)性好，為馬蹄腎的機(jī)制研究提供了新的技術(shù)平臺(tái)。此外，本發(fā)明的技術(shù)也可以采用與小鼠類似的方法，構(gòu)建大鼠的馬蹄腎模型。本發(fā)明的技術(shù)可為外科手術(shù)和藥物干預(yù)提供便于操作和評(píng)價(jià)的動(dòng)物模型，為有效治療馬蹄腎提供科學(xué)依據(jù)。

在本發(fā)明的一具體實(shí)施方案中，所述動(dòng)物為小鼠或大鼠，本發(fā)明的馬蹄腎動(dòng)物模型的創(chuàng)建方法中，可在母鼠懷孕第6.5～10.5天，一次性注射視黃酸溶液12.5～50mg/kg，創(chuàng)建視黃酸誘發(fā)馬蹄腎小鼠或大鼠模型。優(yōu)選地，所述動(dòng)物為小鼠，在母鼠懷孕第8～9天一次性注射視黃酸溶液20～30mg/kg，創(chuàng)建視黃酸誘發(fā)馬蹄腎小鼠模型。更優(yōu)選地，在小鼠懷孕第8.5天一次性注射視黃酸溶液。更優(yōu)選地，創(chuàng)建視黃酸誘發(fā)馬蹄腎小鼠模型時(shí)，一次性注射視黃酸溶液25mg/kg。

換而言之，本發(fā)明還提供了視黃酸在采用上述方法創(chuàng)建馬蹄腎動(dòng)物模型中的應(yīng)用。具體應(yīng)用時(shí)，視黃酸是配制成特定濃度的視黃酸水溶液，按照特定量在受孕動(dòng)物的妊娠早期一次性注射給予動(dòng)物。之后按照常規(guī)飼養(yǎng)分娩，即可得到馬蹄腎動(dòng)物模型。

另一方面，本發(fā)明還提供了一種馬蹄腎，其是按照上述本發(fā)明的方法創(chuàng)建馬蹄腎動(dòng)物模型而得到的。

本發(fā)明的馬蹄腎動(dòng)物模型的創(chuàng)建方法，實(shí)驗(yàn)重復(fù)性好。

綜上所述，本發(fā)明提供了一種馬蹄腎動(dòng)物模型的創(chuàng)建方法，可高效率重復(fù)性創(chuàng)建視黃酸誘發(fā)馬蹄腎的動(dòng)物模型，為馬蹄腎等腎臟發(fā)育異常提供用于機(jī)制研究的實(shí)驗(yàn)工具和平臺(tái)，為腎臟發(fā)育異?；蚧渭捌涑霈F(xiàn)合并癥或并發(fā)癥時(shí)的外科手術(shù)操作及藥物評(píng)價(jià)提供與人極為接近的、便利的實(shí)驗(yàn)工具平臺(tái)和科學(xué)依據(jù)。

附圖說明

圖1A顯示了視黃酸所致馬蹄腎的小鼠模型的馬蹄腎，圖1B為正常對(duì)照。

具體實(shí)施方式

下面通過實(shí)施例的方式進(jìn)一步說明本發(fā)明，但并不因此將本發(fā)明限制在所述的實(shí)施例范圍之中。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，按照常規(guī)方法和條件，或按照商品說明書選擇。

在進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)前，實(shí)驗(yàn)用動(dòng)物均通過實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

實(shí)施例、視黃酸誘發(fā)馬蹄腎小鼠模型的創(chuàng)建與完善

1)選用8周齡性成熟ICR小鼠，每籠4雌1雄，使雌雄交配。每天檢查雌鼠，如發(fā)現(xiàn)雌鼠有陰道栓，視為妊娠，做好標(biāo)識(shí)、記錄妊娠時(shí)間，轉(zhuǎn)為單籠飼養(yǎng)。

2)將妊娠的雌鼠根據(jù)時(shí)間順序，依時(shí)分為3個(gè)大組、9個(gè)小組，分別在母鼠懷孕第6.5天、8.5天和10.5天，一次性腹腔注射視黃酸溶液(分三個(gè)劑量12.5mg/kg、25mg/kg和50mg/kg)。做好小鼠注射視黃酸的時(shí)間和劑量標(biāo)志。

3)在母鼠懷孕第17天時(shí)解剖孕鼠取出胎鼠，觀察胎鼠腎臟形態(tài)及全身各器官大體形態(tài)，并做好記錄。結(jié)果如圖1A和圖1B以及表1所示。圖1A顯示了視黃酸所致馬蹄腎的小鼠模型的馬蹄腎，圖1B為正常對(duì)照。以在受孕小鼠的妊娠第8.5天，一次性注射25mg/kg的視黃酸溶液，單純馬蹄腎的成模率最高。在受孕時(shí)間過早或過晚給予視黃酸、或視黃酸劑量過少或過大，都不容易形成單純的馬蹄腎，時(shí)間過早或劑量過大容易導(dǎo)致雙腎缺失或無腦等嚴(yán)重畸形及死胎。

表1視黃酸誘發(fā)馬蹄腎小鼠模型的造模情況

最后說明的是：以上實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明的實(shí)施過程和特點(diǎn)，而非限制本發(fā)明的技術(shù)方案，盡管參照上述實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)說明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解：依然可以對(duì)本發(fā)明進(jìn)行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明的精神和范圍的任何修改或局部替換，均應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的保護(hù)范圍當(dāng)中。