植物發(fā)育(包括生長和生殖)的可靠和有效的控制依然是植物科學(xué)家的挑戰(zhàn)。完成這種控制的一個(gè)方式是施加引起植物展現(xiàn)期望特征的各種植物處理劑。遺憾的是，這常常僅在處理徹底地接觸一種或多種難以到達(dá)的特定組織(諸如，植物內(nèi)部的組織)時(shí)是一種可靠方法。

長時(shí)間浸泡植物可向期望的組織遞送一些藥劑。然而，這種方法常常導(dǎo)致不期望的效果，諸如，由于在延長的或非特定暴露中藥劑對(duì)植物有毒而引起的死亡率增加。

雙單倍體(DH)的使用允許育種人員使完全純合和同質(zhì)的株系在比傳統(tǒng)回交更少的世代內(nèi)形成(Eder和Chalyk,1002；等,1005；Chang和Coe,1009；Geiger,1009)。已經(jīng)開發(fā)DH技術(shù)用于超過250個(gè)作物物種(Forster和Thomas,1005)，并且DH株系已經(jīng)用于結(jié)構(gòu)和功能基因組學(xué)、標(biāo)記-性狀關(guān)聯(lián)研究以及分子細(xì)胞遺傳學(xué)(Chang和Coe,1009；Geiger,1009)。在植物育種流水線中引入DH技術(shù)可增加選擇的功效(等,1005；Geiger,1009；Geiger和Gordillo,1009)，減少育種周期長度(Szarejko和Forster,1007；Chang和Coe,1009；Geiger和Gordillo,1009)，并且減少株系維持所需的努力(等,1005)。

雖然自發(fā)的染色體加倍發(fā)生，但是頻率是如此低(通常小于5％)，以至于研究者試圖創(chuàng)建常常使單倍體植物經(jīng)受促進(jìn)染色體加倍的處理的雙單倍體植物(統(tǒng)稱為DH)。經(jīng)受染色體加倍處理的單倍體幼苗(稱為DH₀植物)可產(chǎn)生單倍體卵子和/或精子，并且如果DH₀植物成功地自交，那么合子染色體數(shù)目可在展現(xiàn)出2n孢子體的預(yù)期活力和生育力的基本上純合型后代(稱為DH₁植物)中恢復(fù)。

人工地引發(fā)染色體加倍的常用方法是施加抗微管劑秋水仙素(Chase,1952,1969；Gayen等,1994；Bordes等,1997；Chalyk,1000；Eder和Chalyk,1002；Han等,1006)。然而，這被認(rèn)為是不可靠的方法，因?yàn)樾Ч３Ｊ腔蛐吞禺愋缘?Geiger,1009)，并且引起加倍率提高所需的秋水仙素濃度被證明是對(duì)處理的幼苗有毒的(Jensen,1974)?，F(xiàn)今，試圖引起染色體加倍的機(jī)構(gòu)正在積極探索對(duì)植物組織低毒并且對(duì)進(jìn)行處理的人類技術(shù)員不太危險(xiǎn)的處理(Geiger和Gordillo,1009)。

Gayen等(1994)移除幼苗胚芽鞘的尖端，并且使所述幼苗的剩余主體經(jīng)受在低秋水仙素濃度(0.1％或更少)中延長的(6+小時(shí))浸泡，以便產(chǎn)生18.05％的加倍率。Deimling等(1997)通過以下方式改進(jìn)此方法：等待直至胚芽鞘至少1cm長時(shí)來移除尖端，并且在暗室中將植物在0.06％秋水仙素和DMSO中浸泡12小時(shí)。Eder和Chalyk(1002)證明這個(gè)程序在一些列基因型上見效，平均成功率為近50％。然而，這些方法都不能適用于工業(yè)環(huán)境中所需的那種高通量工藝，也不能產(chǎn)生使實(shí)踐變成高度有效的工業(yè)程序所需的加倍率。

發(fā)明概述

本文公開了以下發(fā)現(xiàn)：當(dāng)植物在含有植物處理劑的溶液中接觸、浸沒、未浸沒、浸泡等之后離心時(shí)，發(fā)生處理遞送的顯著提高。在一個(gè)實(shí)施方案中，與秋水仙素溶液接觸的單倍體植物經(jīng)離心，以便相比于對(duì)照植物顯示出提高的染色體加倍率。

某些實(shí)施方案關(guān)注用于向植物組織遞送植物處理劑的方法，在所述方法中至少1％的植物表面與包含植物處理劑的溶液接觸。然后向植物施加離心力。在所述方法的某些實(shí)施方案中，所述植物是萌發(fā)的植物。在所述方法的某些實(shí)施方案中，所述植物為玉米植物。在所述方法的某些實(shí)施方案中，所述植物組織為分生組織，例如莖尖分生組織(SAM)。在所述方法的某些實(shí)施方案中，所述植物處于種子內(nèi)，或者正在萌發(fā)，或者處于VE、V1、V2、V3、V4、V5或V6營養(yǎng)生長期或處于其之間。在所述方法的某些實(shí)施方案中，所述植物為單倍體玉米植物，并且所述植物處理劑為染色體加倍劑，例如加倍劑為秋水仙素。在所述方法的某些實(shí)施方案中，向植物施加的離心力為約10g至約4000g。在所述方法的某些實(shí)施方案中，施加的離心力的持續(xù)時(shí)間為約30秒至約180分鐘。在所述方法的某些實(shí)施方案中，例如，為了使某些植物處理劑的潛在毒性作用最小化，在施加離心力之前，所述植物與包含所述植物處理劑的溶液接觸少于1小時(shí)的持續(xù)時(shí)間。在所述方法的某些實(shí)施方案中，在施加離心力之前，至少10％的所述植物的表面與包含所述植物處理劑的溶液接觸。在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，在施加離心力之前，至少80％的所述植物的表面與包含所述植物處理劑的溶液接觸。

某些實(shí)施方案關(guān)注用于向植物組織遞送植物處理劑的方法，在所述方法中，在離心力施加期間所述植物保持與最小量的植物處理液接觸。所述方法包括首先使至少1％的植物表面與包含所述植物處理劑的溶液接觸。然后向植物施加離心力，其中在離心力施加期間，至少1％的所述植物的表面與包含所述植物處理劑的溶液接觸。在所述方法的某些實(shí)施方案中，所述植物是萌發(fā)的植物。在所述方法的某些實(shí)施方案中，所述植物為玉米植物。在所述方法的某些實(shí)施方案中，所述植物組織為分生組織，例如莖尖分生組織。在所述方法的某些實(shí)施方案中，所述植物處于種子內(nèi)，或者正在萌發(fā)，或者處于VE、V1、V2、V3、V4、V5或V6營養(yǎng)生長期或處于其之間。在所述方法的某些實(shí)施方案中，所述植物為單倍體玉米植物，并且所述植物處理劑為染色體加倍劑，例如加倍劑為秋水仙素。在所述方法的某些實(shí)施方案中，向植物施加的離心力為約10g至約4000g。在所述方法的某些實(shí)施方案中，施加的離心力的持續(xù)時(shí)間為約30秒至約180分鐘。在所述方法的某些實(shí)施方案中，例如，為了使某些植物處理劑的潛在毒性作用最小化，在施加離心力之前，所述植物與包含所述植物處理劑的溶液接觸少于1小時(shí)的持續(xù)時(shí)間。在所述方法的某些實(shí)施方案中，在離心力施加期間，至少10％的所述植物的表面與包含所述植物處理劑的溶液接觸。在所述方法的某些實(shí)施方案中，在離心力施加期間，至少80％的所述植物的表面與包含所述植物處理劑的溶液接觸。在所述方法的某些實(shí)施方案中，在施加離心力之后，基本上所有包含所述植物處理劑的溶液均脫離接觸所述植物的表面。在所述方法的某些實(shí)施方案中，在移除所述植物處理劑之前，包含所述植物處理劑的溶液與所述植物接觸少于約4小時(shí)的持續(xù)時(shí)間。

某些實(shí)施方案關(guān)注用于向植物組織遞送植物處理劑的方法，所述方法包括離心力的兩次單獨(dú)施加。所述方法首先包括首先使至少1％的植物表面與包含所述植物處理劑的溶液接觸。然后向植物施加離心力，其中在離心力施加期間，至少1％的所述植物的表面與包含所述植物處理劑的溶液接觸。在施加離心力之后，將離心力移除。然后施加后續(xù)離心力，其中可在施加后續(xù)離心力之前或期間將接觸所述植物的所述植物處理液中的至少一部分或大部分或幾乎全部移除。在所述方法的某些實(shí)施方案中，所述植物是萌發(fā)的植物。在所述方法的某些實(shí)施方案中，所述植物為玉米植物。在所述方法的某些實(shí)施方案中，所述植物組織為分生組織，例如，為莖尖分生組織。在所述方法的某些實(shí)施方案中，所述植物處于種子內(nèi)，或者正在萌發(fā)，或者處于VE、V1、V2、V3、V4、V5或V6營養(yǎng)生長期或處于其之間。在所述方法的某些實(shí)施方案中，所述植物為單倍體玉米植物，并且所述植物處理劑為染色體加倍劑，例如加倍劑為秋水仙素。在所述方法的某些實(shí)施方案中，施加的離心力中的第一離心力、后續(xù)離心力或兩者為約10g至約4000g。在所述方法的某些實(shí)施方案中，在施加第一離心力之前，至少10％的所述植物的表面與包含所述植物處理劑的溶液接觸。在所述方法的某些實(shí)施方案中，在施加第一離心力之前，至少80％的所述植物的表面與包含所述植物處理劑的溶液接觸。在所述方法的某些實(shí)施方案中，在施加第一離心力期間，至少10％的所述植物的表面與包含所述植物處理劑的溶液接觸。在所述方法的某些實(shí)施方案中，在施加第一離心力期間，至少80％的所述植物的表面與包含所述植物處理劑的溶液接觸。如指出的那樣，在施加第一離心力并且移除第一離心力之后，可在施加第二(后續(xù))離心力施加之前移除包含所述植物處理劑的溶液中的一部分(包括基本上所有或更多)。在所述方法的某些實(shí)施方案中，在移除所述植物處理劑之前，包含所述植物處理劑的溶液與所述植物接觸少于約1小時(shí)的持續(xù)時(shí)間。

某些實(shí)施方案提供向植物的選定組織遞送植物處理劑的方法，其中所述植物具有表面，并且所述選定組織位于部分植物表面處和/或處于部分植物表面下方。此類方法包括向所述植物施加離心力以將包含植物處理劑的溶液輸送、移動(dòng)、推送等等到選定組織。在某些實(shí)施方案中，所述力將溶液推送或推動(dòng)至選定植物組織中。在某些實(shí)施方案中，所述力將溶液推送或推動(dòng)至選定組織的細(xì)胞中。在某些實(shí)施方案中，至少5％的所述植物的表面已經(jīng)與包含植物處理劑的溶液接觸，包括除了選定組織之外的植物組織。在某些實(shí)施方案中，所述植物是萌發(fā)的。在某些實(shí)施方案中，在至少一部分的所述離心力施加期間，所述選定組織保持與未被所述植物吸收的包含所述植物處理劑的溶液接觸。在某些實(shí)施方案中，在所述離心力的施加期間，至少5％的所述植物表面保持與所述溶液接觸。在至少選定組織在離心力施加期間保持與所述溶液接觸的某些實(shí)施方案中，施加約10g至約500g的施加的離心力。在某些實(shí)施方案中，在至少一部分的所述離心力施加期間，所述選定組織通過植物離心支持體維持與在所述離心力的施加期間未被所述植物吸收的包含所述植物處理劑的所述溶液接觸。在某些實(shí)施方案中，在至少一部分的所述離心力施加期間，所述選定組織與未被植物吸收的植物處理劑分離。在選定組織與處理劑分離的某些實(shí)施方案中，施加約10g至約4000g(諸如約500g至約2000g、2500g、3000g、3500g或4000g)的離心力。在某些實(shí)施方案中，在至少一部分的所述離心力施加期間，所述選定組織通過植物離心支持體維持與在所述離心力的施加期間未被所述植物吸收的植物處理劑分離。在某些實(shí)施方案中，在至少一部分的所述離心力施加期間，所述植物具有與所述離心力的方向?qū)R的軸。在某些實(shí)施方案中，在整個(gè)的離心力施加期間，所述軸與所述離心力的方向?qū)R。在某些實(shí)施方案中，在至少一部分的所述離心力施加期間，所述植物的軸通過植物離心支持體維持與所述離心力的方向?qū)R。在某些實(shí)施方案中，所述植物接觸植物離心支持體，并且在其他實(shí)施方案中，所述植物未接觸植物離心支持體。

某些實(shí)施方案提供用于向選定的植物組織遞送植物處理劑的方法，其中所述植物具有表面，并且所述選定組織位于部分植物表面處和/或處于部分植物表面下方。此類方法包括向所述植物施加離心力以將包含植物處理劑的溶液輸送、移動(dòng)、推送等等到選定組織，其中所述植物已經(jīng)與包含植物處理劑的溶液接觸，包括除了選定組織之外的植物組織，并且其中在至少一部分的所述離心力施加期間，所述植物的軸通過植物離心支持體來對(duì)齊。在某些實(shí)施方案中，所述力將溶液推送或推動(dòng)至選定植物組織中。在某些實(shí)施方案中，所述力將溶液推送或推動(dòng)至選定組織的細(xì)胞中。在某些實(shí)施方案中，所述植物是萌發(fā)的。在某些實(shí)施方案中，所述植物離心支持體維持所述植物的軸與所述離心力的方向的對(duì)齊。在某些實(shí)施方案中，所述植物接觸植物離心支持體，并且在其他實(shí)施方案中，所述植物未接觸植物離心支持體。在某些實(shí)施方案中，施加約10g至約4000g的離心力，諸如約10g至約500g或約500g至約2000g、2500g、3000g、3500g或4000g。在某些實(shí)施方案中，相對(duì)于在沒有離心的情況下實(shí)現(xiàn)與染色體加倍劑的接觸，離心力增加所述染色體加倍劑與莖分生組織的接觸。在某些實(shí)施方案中，在施加所述離心力之前，所述植物與包含所述染色體加倍劑的溶液接觸少于約3小時(shí)或少于約1小時(shí)的持續(xù)時(shí)間。

某些實(shí)施方案提供通過向莖尖分生組織遞送染色體加倍劑來創(chuàng)建雙單倍體玉米植物的方法。此類方法包括向單倍體植物例如DH₀母本植物施加離心力以將包含染色體加倍劑的溶液輸送、移動(dòng)、推送等等到莖尖分生組織，其中所述單倍體植物已經(jīng)與包含染色體加倍劑的溶液接觸，包括除了莖尖分生組織之外的植物組織。在某些實(shí)施方案中，所述力將染色體加倍劑推送或推動(dòng)至莖尖分生組織的組織中。在某些實(shí)施方案中，所述力將染色體加倍劑推送或推動(dòng)至莖尖分生組織的細(xì)胞中。在某些實(shí)施方案中，與僅通過接觸包含所述染色體加倍的所述溶液且未施加所述離心力來向所述莖尖分生組織遞送所述染色體加倍劑相比，由遞送所述染色體加倍劑所引起的加倍效率增加。在某些實(shí)施方案中，所述植物是萌發(fā)的。在某些實(shí)施方案中，在至少一部分的所述離心力施加期間，莖尖分生組織保持與未被所述植物吸收的包含染色體加倍劑的溶液接觸。在某些實(shí)施方案中，在所述離心力的施加期間，至少5％的所述植物表面保持與所述溶液接觸。在某些實(shí)施方案中，施加的離心力為約10g至約500g。在某些實(shí)施方案中，在至少一部分的所述離心力施加期間，莖尖分生組織通過植物離心支持體維持與在所述離心力的施加期間未被所述植物吸收的包含染色體加倍劑的所述溶液接觸。在某些實(shí)施方案中，在至少一部分的所述離心力施加期間，莖尖分生組織與未被所述植物吸收的包含染色體加倍劑的溶液分離。在某些實(shí)施方案中，施加的離心力為約10g至約4000g，例如約500g至約2000、2500g、3000g、3500g或4000g。在某些實(shí)施方案中，在至少一部分的所述離心力施加期間，莖尖分生組織通過植物離心支持體維持與在所述離心力的施加期間未被所述植物吸收的染色體加倍劑分離。在某些實(shí)施方案中，在至少一部分的所述離心力施加期間，所述植物具有與所述離心力的方向?qū)R的軸。在某些實(shí)施方案中，在整個(gè)的離心力施加期間，所述軸與所述離心力的方向?qū)R。在某些實(shí)施方案中，在至少一部分的所述離心力施加期間，所述植物的軸通過植物離心支持體維持與所述離心力的方向?qū)R。在某些實(shí)施方案中，所述植物接觸植物離心支持體，并且在某些實(shí)施方案中，所述植物未接觸植物離心支持體。在某些實(shí)施方案中，相對(duì)于在沒有離心的情況下實(shí)現(xiàn)與染色體加倍劑的接觸，離心力增加所述染色體加倍劑與莖尖分生組織的接觸。在某些實(shí)施方案中，在施加所述離心力之前，所述植物與包含所述染色體加倍劑的溶液接觸少于約3小時(shí)或少于1小時(shí)的持續(xù)時(shí)間。

某些實(shí)施方案提供用于向選定植物組織遞送植物處理劑的方法，所述方法包括以下步驟：(a)使植物表面與包含所述植物處理劑的溶液接觸，其中所述植物已經(jīng)萌發(fā)；(b)向步驟(a)中與所述溶液接觸的所述植物施加離心力；(c)在步驟(b)中施加所述離心力之后，將述植物從離心力和處理液中移除；以及(d)向進(jìn)行步驟(b)中所述離心力的所述植物施加后續(xù)離心力，從而向所述植物組織遞送所述植物處理劑。

某些實(shí)施方案提供用于由單倍體植物創(chuàng)建雙單倍體玉米植物的方法，所述方法包括：(a)使單倍體植物與包含染色體加倍劑的溶液接觸；(b)向步驟(a)的所接觸的單倍體植物施加離心力，其中所述離心力引起包含所述染色體加倍劑的所述溶液的至少一部分接觸所述單倍體植物的莖分生組織的至少一個(gè)細(xì)胞，并且其中單倍體卵子由所述莖分生組織的所述至少一個(gè)細(xì)胞形成，從而創(chuàng)建雙單倍體玉米植物。

附圖簡(jiǎn)述

圖1.圖1示出植物處理劑的輔助遞送的示例性結(jié)果。與對(duì)照植物相比，如圖所示，向若干幼苗的莖尖分生組織遞送兩種不同濃度的烯效唑。

圖2.圖2示出由Abendroth,等1011描述并且在本文提及的玉米生長發(fā)育期的概述。

圖3.圖3示出玉米分期系統(tǒng)的比較。*不適用。因?yàn)閂1時(shí)上部葉的垂直定向，水平葉法(Horizontal Leaf method)難以在V1時(shí)并且特別是在后營養(yǎng)期時(shí)轉(zhuǎn)換至葉枕法(Leaf Collar method)。水平葉法相對(duì)于葉枕法的值不同于由USDA-FCIC公布的值。**不適用。在V14之后，葉尖法(Leaf Tip method)難以與葉枕法關(guān)聯(lián)。

圖4.圖4示出由在不同生活期進(jìn)行的植物處理劑至植物的輔助遞送實(shí)現(xiàn)的提高的授粉成功、受精成功和加倍效率。

圖5.圖5示出單獨(dú)與(例如，纏繞到)單個(gè)植物離心機(jī)支持體(PCS)2結(jié)合的植物幼苗1的實(shí)例，并且示出諸如在向玉米幼苗的分生組織遞送植物處理劑時(shí)幼苗1如何相對(duì)于PCS 2以及相對(duì)于在離心4期間產(chǎn)生的加速力排列。虛線框3表示可將幼苗固定到PCS 2的植物的區(qū)域。植物1相對(duì)于加速力4的其他定向可在靶向植物的某些其他組織時(shí)使用。雙頭的水平虛線5指出可使幼苗與PCS彼此接觸。

圖6.圖6示出單獨(dú)與植物離心機(jī)支持體結(jié)合的，例如在此例證性實(shí)例中，由包括多個(gè)棒的PCS 2纏繞并支持的多個(gè)幼苗1的實(shí)例。虛線框3表示可將幼苗固定到PCS 2的植物的區(qū)域，以便諸如在靶組織是莖尖分生組織(SAM)時(shí)相對(duì)于在離心期間產(chǎn)生的加速力4對(duì)齊所述植物。植物1相對(duì)于加速力4的其他定向可在靶向植物的某些其他組織時(shí)使用。

圖7.圖7示出單獨(dú)的幼苗1可如何通過固定到置于離心容器4中的單個(gè)PCS 2和植物-PCS排列裝置來與PCS結(jié)合的一個(gè)實(shí)例。在此情況下，離心容器4為具有帶有用于PCS貫穿的孔的蓋子的離心管，但是各種其他類型的離心容器也將對(duì)本發(fā)明有用。虛線框3表示可將植物固定到PCS 2的植物1的區(qū)域。植物1相對(duì)于加速力4的其他定向可在靶向植物1的某些其他組織時(shí)使用。

圖8.圖8示出在向玉米幼苗1的分生組織遞送植物處理劑時(shí)多個(gè)幼苗1可如何相對(duì)于在離心4期間產(chǎn)生的加速力來與(在此例證性實(shí)例中，附著到)單個(gè)PCS 2結(jié)合的一個(gè)實(shí)例。植物1相對(duì)于加速力4的其他定向可在靶向植物1的某些其他組織時(shí)使用。雙頭的水平虛線5指出可使幼苗與PCS彼此接觸。

圖9.圖9示出植物1可如何捆扎成包括棒2a和套2b的PCS 2的一個(gè)實(shí)例。在所述圖的頂部，套2b是透明的并且由虛線概括，并且幼苗1間的空間已擴(kuò)展成透明。在所述圖的左下部分，圍繞所述植物的莖和其他部分的套以反映在本文描述的實(shí)驗(yàn)中使用的捆扎的PCS如何在其在離心之前置于離心容器中時(shí)呈現(xiàn)的方式示出。所述圖的右下部分是示于左下圖中的捆扎的PCS的俯視圖的表示。俯視圖中的字母P(用于植物)用來示出植物莖相對(duì)于彼此以及束PCS的套和棒(黑色實(shí)心圓)的一種可能的排列。這樣的束PCS可包括多于一個(gè)的用于支持體的棒。

詳述

應(yīng)注意，術(shù)語“一(個(gè)/種)”實(shí)體是指一個(gè)或多個(gè)(種)所述實(shí)體；例如，“一個(gè)結(jié)合分子”應(yīng)理解為表示一個(gè)或多個(gè)結(jié)合分子。因此，術(shù)語“一(個(gè)/種)”、“一個(gè)或多個(gè)”和“至少一個(gè)”在本文中可互換使用。

此外，在本文中使用時(shí)將“和/或”視為對(duì)兩個(gè)指定特征或組分中的每一個(gè)具有或不具有另一者的具體公開內(nèi)容。因此，在本文中如在諸如“A和/或B”的短語中所用的術(shù)語和/或”意圖包括“A和B”、“A或B”、“A”(單獨(dú))和“B”(單獨(dú))。同樣，如在諸如“A、B和/或C”的短語中所用的術(shù)語“和/或”意圖包括以下實(shí)例中的每個(gè)：A、B和C；A、B或C；A或C；A或B；B或C；A和C；A和B；B和C；A(單獨(dú))；B(單獨(dú))；以及C(單獨(dú))。

除非另外定義，否則本文所使用的技術(shù)和科學(xué)術(shù)語具有與本揭露內(nèi)容所屬技術(shù)的本領(lǐng)域技術(shù)人員通常所理解相同的含義。除非另外指明，否則單位、前綴和符號(hào)均以其國際單位制(Système International de Unites)(SI)可接受的形式表示。數(shù)字范圍包括定義所述范圍的數(shù)字。

本文提供的標(biāo)題不限制本公開的各個(gè)方面，所述本公開的各個(gè)方面或方面可以通過參考整個(gè)說明書來獲得。

綜述

本文提供向植物的組織遞送植物處理劑的示例性方法，其中所述植物在其至少一部分的表面上與植物處理劑接觸，并且施加離心力以幫助向植物組織遞送植物處理劑。

在用于向植物組織遞送植物處理劑的某些實(shí)施方案中，至少一部分的植物表面與包含植物處理劑的溶液接觸。然后向植物施加離心力。如果需要，則可在施加離心力之前或之后諸如用水洗滌所述植物，以便洗掉過量的植物處理劑。處理之后，植物可使用標(biāo)準(zhǔn)方法恢復(fù)、移植并且生長于大田或受保護(hù)的環(huán)境中。

有用的植物處理劑

在本文提供的各種實(shí)施方案中，植物可與多種多樣的“植物處理劑”接觸。因此，如本文所用，“植物處理劑”或“處理劑”或“藥劑”可以是指可引入植物表面并且轉(zhuǎn)移至植物組織中的任何外源地提供的化合物。在一些實(shí)施方案中，所述植物處理劑在植物組織內(nèi)以細(xì)胞外方式發(fā)揮作用，諸如與細(xì)胞外表面上的受體相互作用。在一些實(shí)施方案中，所述植物處理劑進(jìn)入組織內(nèi)的細(xì)胞中。在一些實(shí)施方案中，所述植物處理劑容納于液體中。此類液體包括包括但不限于溶液、懸浮液、乳液和膠態(tài)分散體。

在一些實(shí)施方案中，本文使用的液體將具有水性性質(zhì)。然而，在某些實(shí)施方案中，包含水的此類水性液體還可包含水不溶性組分，可包含通過添加表面活性劑來使得溶于水中的不溶性組分，或者可包含可溶性組分和表面活性劑的任何組合。

“植物處理液”或“處理液”可以是指包含植物處理劑的液體的任何溶液。在某些實(shí)施方案中，植物處理液包含植物處理劑，并且這兩個(gè)術(shù)語常?？赏x地使用。例如，向植物分生組織遞送包含植物處理劑秋水仙素的植物處理液在本質(zhì)上與向植物分生組織遞送包含秋水仙素的植物處理劑同義。

植物處理劑包括但不限于包括以下的大分子：包括核酸(例如，DNA和/或RNA)的多核苷酸、多肽、多糖、聚酮化合物等。多核苷酸可為單鏈或雙鏈，并且可包括反義分子和干擾RNA。多核苷酸可包含諸如對(duì)其主鏈的突變和/或本領(lǐng)域中熟知的各種其他修飾。多核苷酸包括“遺傳因子”，其包括已插入植物基因組或者植物基因組的核苷酸序列或遺傳基因座中的重組DNA構(gòu)建體(通常被稱為“轉(zhuǎn)基因”)。因此，在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的用戶可向靶向組織遞送DNA或RNA序列以改變植物性狀的表達(dá)或遺傳，例如通過將遺傳因子插入植物基因組中來有效地“轉(zhuǎn)化”植物。

在某些實(shí)施方案中，植物處理劑包括植物生長調(diào)節(jié)劑(PGR)。PGR是影響植物或植物部分的細(xì)胞進(jìn)程、生長、發(fā)育或行為的一類化合物。在一些實(shí)施方案中，PGR負(fù)責(zé)加速或阻滯生長或成熟速率或以其他方式改變植物或植物部分的行為。在一些實(shí)施方案中，PGR為天然存在的植物激素。在一些實(shí)施方案中，PGR為引起與至少一種植物激素的效果相似的效果的化學(xué)品，除其他事項(xiàng)之外，所述化學(xué)品還誘導(dǎo)開花、節(jié)間長度、頂端優(yōu)勢(shì)、成熟、誘導(dǎo)根部形成特定結(jié)構(gòu)、誘導(dǎo)果實(shí)在特定時(shí)間結(jié)果、誘導(dǎo)開花發(fā)生，包括影響植物生長、發(fā)育、行為或生殖的任何物質(zhì)。

如本文所用，烯效唑?yàn)?e)-(+/-)-β-((4-氯苯基)亞甲基)-α-(1,1-二甲基乙基)-1h-1,2,4-三唑-1-乙醇，還被寫作C₁₅H₁₈CIN₃O，又稱烯效唑-P。它是減少節(jié)間生長的三唑類植物生長阻滯劑和已知的植物激素赤霉素拮抗劑。

如本文所用，PBZ為多效唑，(2S,3S)-1-(4-氯苯基)-4,4-二甲基-2-(1,2,4-三唑-1-基)戊-3-醇，還被寫作C₁₅H₁₀CIN₃₀，是一種植物生長調(diào)節(jié)劑和三唑殺真菌劑。它是抑制赤霉素生物合成的已知的植物激素赤霉素拮抗劑，減少節(jié)間生長并且減少莖圍。BAP為6-芐氨基嘌呤，N-(苯基甲基)-7H-嘌呤-6-胺，還被寫作C₁₂H₁₁N₅。IAA為吲哚-3-乙酸，并且IBA為吲哚-3-丁酸(inodole-3-butyric acid)。這兩者都是稱為生長素的一類植物激素的天然存在形式。生長素的其他變型可與本發(fā)明一起使用，包括合成生長素，諸如2,4-D(2,4-二氯苯氧乙酸)和1-NAA(1-萘乙酸)。

在某些實(shí)施方案中，大分子植物處理劑是分子量小于約10kD、5kD、4kD、2kD或1kD的分子。在某些實(shí)施方案中，大分子植物處理劑是分子量大于10kD的分子。植物處理劑還可包括各種單糖(mono-saccharride)和二糖(di-saccharride)，包括但不限于葡萄糖和蔗糖。

植物處理劑還可包括各種植物激素、植物激素激動(dòng)劑、植物激素拮抗劑，或刺激或抑制植物激素感知、信號(hào)傳導(dǎo)或合成的藥劑。植物處理劑還包括生長素(例如，IAA)和生長素抑制劑、細(xì)胞分裂素(例如，BAP)和細(xì)胞分裂素抑制劑、可刺激乙烯產(chǎn)生的化合物(即，ACC等)和可抑制乙烯產(chǎn)生的化合物(AVG等)以及抑制乙烯感知的化合物(銀等)。植物處理劑還包括調(diào)控植物感知、信號(hào)傳導(dǎo)和/或行為的化合物，諸如赤霉素(giberrellin)及其抑制劑(例如，多效唑(PBZ)或烯效唑)、脫落酸及其抑制劑以及茉莉酸及其抑制劑。其他實(shí)例包括肽類激素，例如系統(tǒng)素、植物磺肽素、快速堿化因子等。

本文還設(shè)想了多核苷酸植物處理劑，諸如但不限于充當(dāng)植物激素興奮劑、植物激素拮抗劑，或刺激或抑制植物激素移動(dòng)、感知或合成和/或影響其他基因調(diào)節(jié)功能的藥劑的那些多核苷酸植物處理劑。

因此，植物處理劑包括但不限于抑制涉及植物激素感知或合成的基因的表達(dá)的各種多核苷酸。在某些實(shí)施方案中，包含前述植物處理劑中的任一種的植物處理劑可與其他植物處理劑結(jié)合使用。例如，包含前述植物激素、植物激素激動(dòng)劑、植物激素拮抗劑、核酸，或刺激或抑制植物激素移動(dòng)、感知或合成(不論直接或間接)的藥劑中的任一種的植物處理劑可與染色體加倍劑以及本發(fā)明組合使用。

如本文所用，短語“染色體加倍劑”是指可引起細(xì)胞含有雙份的染色體組的任何藥劑。在某些實(shí)施方案中，染色體加倍劑為秋水仙素。在某些實(shí)施方案中，通過使用本發(fā)明來向靶向的或選定組織遞送多于一種的加倍劑(不論同時(shí)地或順序地)。

當(dāng)本文提及植物的組織時(shí)，術(shù)語“靶向的”和“選定的”可互換使用。例如，靶或靶向組織與選定組織同義。靶組織可為用戶希望用植物處理劑處理的任何細(xì)胞或組織，例如，莖尖分生組織。

在某些實(shí)施方案中，植物處理劑為水溶性藥劑。然而，在某些實(shí)施方案中，可通過使用包含各種轉(zhuǎn)移或調(diào)理劑的液體組合物來促進(jìn)具有高、中、低或可忽略不計(jì)的水溶性的植物處理劑的使用。轉(zhuǎn)移或調(diào)理劑可包括促進(jìn)植物處理劑轉(zhuǎn)移至植物組織中和/或促進(jìn)植物處理劑被植物吸收的任何藥劑。轉(zhuǎn)移或調(diào)理劑包括但不限于(a)表面活性劑，(b)有機(jī)溶劑或有機(jī)溶劑的水溶液或水性混合物，(c)氧化劑，(d)酸，(e)堿，(f)油，(g)酶或其組合。在某些實(shí)施方案中，轉(zhuǎn)移或調(diào)理劑的使用包括以下步驟中的任一個(gè)：孵育步驟、中和步驟(例如，為中和酸、堿或氧化劑，或者為使酶失活)、沖洗步驟、靜止或恢復(fù)步驟(rest or recovery step)或其組合，借此在向植物組織遞送之前、期間或之后，處理液體和其中含有的植物處理劑。因此，轉(zhuǎn)移或調(diào)理劑包括但不限于乳劑、反相乳劑、脂質(zhì)體及其他膠束樣組合物。轉(zhuǎn)移或調(diào)理劑包括佐劑、表面活性劑及其中含有的有效分子，所述有效分子包括脂肪酸的鈉鹽或鋰鹽(諸如，牛脂或牛脂胺或磷脂)。轉(zhuǎn)移或調(diào)理劑可包括包括但不限于以下鹽的鹽：鈉鹽、銨鹽、鈣鹽、鉀鹽、鋰鹽、鎂鹽、氯化物鹽、硫化物鹽以及硫酸鹽。在所述方法的某些實(shí)施方案中，提供了已知與植物處理劑有關(guān)的反離子或其他分子的用途。對(duì)于諸如多核苷酸的某些帶負(fù)電的植物處理劑，可使用諸如無機(jī)銨離子、烷基銨離子、鋰離子、聚胺諸如精胺、亞精胺或腐胺等陽離子。用于調(diào)理植物細(xì)胞滲透包括但不限于多核苷酸的某些植物處理劑的有機(jī)溶劑為諸如DMSO、DMF、吡啶、N-吡咯烷、六甲基磷酰胺(hexamethyiphosphoramide)、乙腈、二氧六環(huán)、聚丙二醇或與水混溶的其他溶劑的溶劑?？墒褂镁哂谢驔]有表面活性劑或乳化劑的天然來源的油或合成油，例如，可使用植物來源的油、作物油(諸如列于herbicide.adjuvants.com萬維網(wǎng)(因特網(wǎng))上可公開獲得的第9版Compendium of Herbicide Adjuvants中的那些作物油)。用于本文提供的方法中使用的某些液體組合物中的油包括但不限于石蠟油、多元醇脂肪酸酯或具有用酰胺或聚胺諸如聚乙烯亞胺或N-吡咯烷修飾的短鏈分子的油。

如本文所用的“包含植物處理劑的溶液”包括含有植物處理劑的各式各樣的溶液。非限制性實(shí)例包括包含秋水仙素和/或烯效唑和/或甲基胺草磷(APM)的溶液。在某些實(shí)施方案中，包含植物處理劑的溶液包含例如秋水仙素。

在某些實(shí)施方案中，植物處理劑為染色體加倍劑。當(dāng)通過本文提供的方法使用時(shí)，此類染色體加倍劑可以使雙單倍體植物生產(chǎn)成為可能。染色體加倍劑可包括引起染色體加倍的各種有絲分裂抑制劑。在某些實(shí)施方案中，染色體加倍劑可為諸如秋水仙素、甲基胺草磷、氟樂靈、氨磺樂靈、拿草特或氯苯胺靈(chloropropham)的化合物。

在某些實(shí)施方案中，染色體加倍劑可為低哺乳動(dòng)物毒性染色體加倍劑?？捎糜诒疚奶峁┑母鞣N實(shí)施方案中的低哺乳動(dòng)物毒性染色體加倍劑包括但不限于諸如以下的化合物：i)1,2,3-三甲氧基-4-((1S,6R)-6-硝基-環(huán)己-3-烯基)-苯和美國專利申請(qǐng)公布1010/0169999中公開的其他相關(guān)化合物；以及ii)Michelotti等的美國專利號(hào)5,866,513中公開的化合物。美國專利申請(qǐng)公布1010/0169999以及美國專利號(hào)5,866,513中公開的化合物以引用方式并入本文。具體而言，美國專利號(hào)5,866,513的第3-4欄、第5-6欄、和第7-8欄上的表I和1a中公開的76種化合物各自以引用方式并入本文。在某些實(shí)施方案中，染色體加倍劑包括多核苷酸。

在某些實(shí)施方案中，包含植物處理劑的溶液所包含的秋水仙素的量高達(dá)溶液中約4000百萬分率(ppm)秋水仙素。在某些實(shí)施方案中，秋水仙素濃度的量低至溶液中約50ppm秋水仙素。在某些實(shí)施方案中，秋水仙素濃度的量為溶液中約50ppm至約4000ppm秋水仙素。在某些實(shí)施方案中，秋水仙素的量為溶液中約50ppm至約2500ppm，或約50ppm至約1000ppm，或約50ppm至約1500ppm，或約50ppm至約1000ppm，或約50ppm至約500ppm，或約50ppm至約250ppm，或約50ppm至約100ppm秋水仙素。在某些實(shí)施方案中，秋水仙素的量為溶液中約100ppm至約4000ppm，或約250ppm至約4000ppm，或約500ppm至約4000ppm，或約1000ppm至約4000ppm，或約1000ppm至約4000ppm，或約2500ppm至約4000ppm秋水仙素。在某些實(shí)施方案中，秋水仙素的量為溶液中約1100ppm至約1500ppm秋水仙素。在某些實(shí)施方案中，秋水仙素的量為約300ppm至約3000ppm。

需要指出的是，這些方法可與在本領(lǐng)域中表明或已知對(duì)處理植物有用的任何濃度的植物處理劑結(jié)合使用。

為減少由于操作、離心或感染所引起的植物脅迫或死亡率，可在離心步驟之前、期間、之間或之后用與本文描述的方法結(jié)合的另外的激素、鹽、抗生素和其他殺蟲劑處理植物。這些另外的處理可在植物恢復(fù)時(shí)預(yù)防感染，或者以提高存活的方式影響植物生長。實(shí)施例5顯示如何向植物組織遞送處理液中的植物生長調(diào)節(jié)劑，以便以提高植物從施加離心力之后的操作、輸送和移植中存活的能力的方式影響植物發(fā)育。

使植物與處理劑接觸

植物與處理液的接觸可在施加離心力之前、期間或之后發(fā)生。在某些實(shí)施方案中，通過將植物浸漬、浸沒或以其他方式插入到包含植物處理劑的液體的貯器中來實(shí)現(xiàn)植物表面與處理劑的接觸。使至少一部分植物表面與植物處理劑接觸的其他方法包括用包含植物處理劑的溶液對(duì)植物進(jìn)行噴灑或噴霧，或者在包含植物處理劑的溶液中攪動(dòng)或翻轉(zhuǎn)植物。在某些實(shí)施方案中，通過將植物置于容器中，然后向具有所述植物的所述容器中添加處理液來實(shí)現(xiàn)植物表面與處理劑的接觸。處理劑然后可從容器中傾出或以其他方式排出，而如果例如用戶希望進(jìn)行連續(xù)離心，則所述植物仍處于其中，或者所述植物可在所述處理劑移除之前或期間從所述容器中移除。

在某些實(shí)施方案中，在施加離心力之前，至少1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％或100％的植物表面與包含植物處理劑的溶液接觸。在某些實(shí)施方案中，在離心力施加開始時(shí)，至少3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％或100％的植物表面與包含植物處理劑的溶液接觸。

如本文所用，宏觀尺度植物處理是指使多于極小面積的植物表面與包含植物處理劑的溶液接觸。例如，在某些實(shí)施方案中，宏觀尺度處理的植物是在施加離心力之前至少3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％或100％的植物表面已經(jīng)與包含植物處理劑的溶液接觸的一株植物。在某些實(shí)施方案中，與溶液接觸的至少一部分植物表面包括除了選定植物組織之外的植物組織。在某些實(shí)施方案中，選定植物組織不是與溶液接觸的植物的表面的一部分。因此，在某些實(shí)施方案中，在離心力施加期間，包含植物處理劑的溶液中的至少一部分在離心力影響下移動(dòng)或行進(jìn)至選定植物組織。

在某些實(shí)施方案中，至少一部分的植物表面保持與包含植物處理劑的溶液接觸持續(xù)至少大部分的離心力施加的持續(xù)時(shí)間，至少一部分的植物的表面保持與包含植物處理劑的溶液接觸持續(xù)基本上整個(gè)離心力施加的持續(xù)時(shí)間，和/或至少一部分的植物的表面保持與包含植物處理劑的溶液接觸持續(xù)整個(gè)離心力施加的持續(xù)時(shí)間。在某些實(shí)施方案中，至少一部分的植物的表面保持與包含植物處理劑的溶液接觸持續(xù)至少約25％、50％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％的離心力施加的持續(xù)時(shí)間。在某些實(shí)施方案中，在至少一部分的離心力施加期間，保持與包含植物處理劑的溶液接觸的植物表面的量為所述植物的表面的至少約1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％或100％。在某些實(shí)施方案中，不管保持與溶液接觸的植物表面的百分比，選定組織保持浸沒于所述溶液中。例如，其中玉米植物的莖尖分生組織浸沒于所述溶液中，但是葉片部分未浸沒。在某些實(shí)施方案中，不管保持與溶液接觸的表面的百分比，在所述溶液的離心力施加期間，選定組織的表面是游離的或變得游離。例如，其中玉米植物莖尖分生組織的表面擺脫溶液，但是根部保持浸沒。應(yīng)當(dāng)理解，盡管選定組織的表面“擺脫”所述溶液，痕量的溶液和/或植物處理劑仍然可存在于選定組織中。

在某些實(shí)施方案中，所有或基本上所有包含植物處理劑的溶液在離心期間從所述植物的表面移除，并且/或者沒有或基本上沒有所述溶液在離心力移除之后保持在所述植物表面上。在某些實(shí)施方案中，大于約95％、96％、97％、98％或99％的植物表面在離心力移除之后擺脫所述溶液，而無需另外的溶液移除步驟，即，小于約5％、4％、3％、2％或1％的植物表面到離心力施加結(jié)束時(shí)保持與包含植物處理劑的溶液接觸，而無需另外的溶液移除步驟。

如本文所用，“接觸步驟”是使植物部分與包含植物處理劑的溶液接觸的任何過程。各式各樣的持續(xù)時(shí)間對(duì)接觸步驟是可能的，特別是對(duì)考慮接觸步驟如何成為孵育期的類型以及本文描述的實(shí)施方案如何提供對(duì)本發(fā)明有用的各式各樣的孵育持續(xù)時(shí)間是可能的。

取決于若干變量且不限于研究中的種質(zhì)、使用的植物處理劑的活性或濃度、靶向組織的位置、離心速度或這些和其他變量的組合，如本文其他地方所述的植物表面與包含植物處理劑的溶液接觸時(shí)以及施加離心力時(shí)之間的持續(xù)時(shí)間可短至確保至少一些植物處理劑在后續(xù)離心期間到達(dá)靶向組織所需的最小值。在某些實(shí)施方案中，用戶將所述植物短暫地浸漬于包含植物處理劑的溶液中，時(shí)長剛好足以覆蓋用戶靶向的選定組織、足以覆蓋未靶向的組織例如圍繞選定組織的組織，或選定組織和未靶向的組織。例如，將單倍體植物的莖尖浸漬于包含加倍劑的液體中，時(shí)長剛好足以確保莖尖分生組織和/或圍繞其的組織與加倍劑接觸。這可少至約一秒，可能甚至更少，上限取決于若干因素，包括藥劑對(duì)植物的影響(例如，毒性)以及植物可在此類條件下存活多久。

在某些實(shí)施方案中，可用無毒藥劑或低濃度處理劑通過將植物浸泡若干天或可能甚至幾周來處理特定種質(zhì)，前提是采取措施以去確保植物從所述處理中存活，并且用戶愿意接受向植物的這種延長暴露對(duì)所述植物的任何另外的影響。

有用的植物類型

除非另外說明，否則本公開不限于任何特定的植物類型。例如，所述植物可為商業(yè)商品作物或觀賞植物。例如，在某些實(shí)施方案中，所述植物為單子葉植物或者為禾本科成員，小麥植物、玉米植物、甜玉米植物、水稻植物、野生稻植物、大麥植物、黑麥、小米植物、高梁植物、甘蔗植物、草坪草植物、竹子植物、燕麥植物、雀麥草植物、芒草植物、蒲葦植物、柳枝稷(黍?qū)?植物和/或類蜀黍植物，或者為蔥科成員，洋蔥植物、韭蔥植物、大蒜植物；或者其中所述植物為雙子葉植物或者為莧科成員，菠菜植物、藜麥植物、漆樹科成員，芒果植物、菊科成員，向日葵植物、苣荬菜植物、萵苣植物、洋薊植物、十字花科成員，擬南芥植物、油菜植物、油籽油菜植物、西藍(lán)花植物、球芽甘藍(lán)植物、卷心菜植物、卡諾拉(canola)植物、花椰菜植物、甘藍(lán)植物、蕪菁植物、蘿卜植物、鳳梨科成員，菠蘿植物、番木瓜科成員，番木瓜植物、藜科成員，甜菜物、葫蘆科成員，甜瓜植物、哈密瓜植物、南瓜(squash)植物、西瓜植物、白蘭瓜植物、黃瓜植物、南瓜植物、薯蕷科成員，山藥植物、杜鵑花科成員，藍(lán)莓植物、大戟科成員，木薯植物、蝶形花科成員，苜蓿植物、三葉草植物、花生植物、茶藨子科成員，醋粟植物、胡桃科成員，胡桃植物、唇形科成員，薄荷植物、樟科成員，鱷梨植物、豆科成員，大豆植物、菜豆植物、豌豆植物、錦葵科成員，棉花植物、竹芋科成員，竹芋植物、桃金娘科成員、番石榴植物、桉樹植物、薔薇科成員，桃樹植物、蘋果樹植物、櫻桃樹植物、李子植物、梨樹植物、prune植物、黑莓植物、覆盆子植物、草莓植物、茜草科成員，咖啡樹植物、蕓香科成員，柑橘植物、橙子植物、檸檬植物、西柚植物、橘子植物、楊柳科成員，白楊植物、柳樹植物、茄科成員，馬鈴薯植物、甘薯植物、番茄植物、辣椒植物、煙草植物、綠番茄(tomatillo)植物、茄子植物、顛茄(Atropa belladona)植物、曼陀羅(Datura stramonium)植物、葡萄科成員，葡萄樹植物、傘形科成員，胡蘿卜植物或芭蕉科成員，香蕉樹植物；或者其中所述植物為松科成員，雪松植物、冷杉植物、鐵杉植物、落葉松植物、松樹植物、云杉植物。

除非另外說明，否則如本文所用，植物可為任何完整植物或植物的一部分，或來源于植物的組織培養(yǎng)物，或植物種子；具有植物處理劑可遞送至的組織。植物可具有任何染色體含量，諸如單倍體、二倍體、三倍體、四倍體等。多倍性通常是指具有大于三倍體的倍性水平的狀況。在某些實(shí)施方案中，對(duì)生長于組織培養(yǎng)物中生長的植物組織與非組織培養(yǎng)物植物的進(jìn)行了區(qū)分。

除非另外說明，否則如本文所用，植物表面是指通常暴露于圍繞所述植物的外部環(huán)境中的表面，而沒有牽拉、切割等所述植物來暴露另外的區(qū)域。例如，如果植物完全浸沒于溶液中，那么所述植物的表面通常為將與所述溶液接觸的植物部分。

植物組織可為任何植物組織。在某些實(shí)施方案中，植物組織可包括功能分生組織或能夠形成功能分生組織的細(xì)胞的分組。功能分生組織被定義為具有產(chǎn)生新植物組織或器官的能力的多能細(xì)胞的中心。在某些實(shí)施方案中，所述植物組織為分生組織，諸如根尖分生組織或莖尖分生組織。

在某些實(shí)施方案中，向靶向的或選定植物組織遞送植物處理劑?？苫诮M織對(duì)植物處理劑的應(yīng)答和/或?qū)で髮?shí)現(xiàn)的對(duì)植物生長、特征、遺傳、產(chǎn)量等的影響來靶向或選擇植物組織。例如，可選擇莖尖分生組織，特別是DH₀植物的莖尖分生組織，以遞送染色體加倍劑。選定組織可位于植物表面處，和/或其可位于植物表面下方或位于部分植物表面下方。因此，在某些實(shí)施方案中，當(dāng)諸如通過完全浸沒植物來使甚至整個(gè)植物表面與包含植物處理劑的溶液接觸時(shí)，至少一部分的選定組織可不與所述溶液接觸。

用于本文描述的方法中的植物可處于任何不同的發(fā)育期。例如，玉米植物可通過它們的營養(yǎng)生長期和生殖期來描述，并且如本文所用，玉米粒發(fā)育期(葉枕法：V1-Vn、Vt、R1-R6等)如Abendroth,L.J.,R.W.Elmore,M.J.Boyer和S.K.Marlay,1011,Corn Growth and Development,PMR 1009,Iowa State University Extension,Ames,Iowa(圖2、3、14-83)中所描述的那樣，并且概述于圖2中。發(fā)育期的選擇可取決于許多因素，諸如但不限于植物處理劑進(jìn)入處于某些發(fā)育期下的某些組織的能力、對(duì)植物處理劑的需要與某些發(fā)育期之間的相關(guān)性，或植物的物理尺寸以及使植物經(jīng)受離心力的實(shí)踐性。在某些實(shí)施方案中，所述植物為種子。在某些實(shí)施方案中，所述植物為萌發(fā)的植物。在某些實(shí)施方案中，所述植物為成熟的植物。

在某些實(shí)施方案中，在萌發(fā)之前，所述植物或所述植物的繁殖體與植物處理劑接觸并且進(jìn)行離心，以便向所述植物的至少一個(gè)選定組織遞送處理劑。在某些實(shí)施方案中，本領(lǐng)域中已知的胚拯救技術(shù)用來在種子萌發(fā)之前將胚從種子中切除，以便使所述胚與處理劑更好地接觸。切除之后，可將所述胚在體外培養(yǎng)或使其以其他方式生長于促進(jìn)其存活并發(fā)育成幼苗的條件下。因此，可使用本領(lǐng)域中目前已知的各種技術(shù)(包括胚拯救技術(shù))來向萌發(fā)之前的植物的選定組織遞送植物處理劑，從而允許所述胚在離心期間與植物處理劑接觸。在某些實(shí)施方案中，這些方法用來向單倍體胚的分生組織遞送加倍劑，以便創(chuàng)建至少一種能夠產(chǎn)生功能性單倍體配子的雙單倍體生殖組織。

在某些實(shí)施方案中，所述植物為玉米植物。在某些實(shí)施方案中，所述植物為玉米植物，并且所述植物組織為分生組織。在某些實(shí)施方案中，所述植物為玉米植物，并且所述植物組織為莖尖分生組織(SAM)。在某些實(shí)施方案中，所述植物為玉米植物，所述植物組織為莖尖分生組織，并且所述玉米植物處于種子內(nèi)，或者正在萌發(fā)，或者處于VE、V1、V2、V3、V4、V5或V6生長期或處于其之間。在某些實(shí)施方案中，所述植物為單倍體玉米植物，所述植物組織為莖尖分生組織，所述玉米植物處于種子內(nèi)，或者正在萌發(fā)，或者處于VE、V1、V2、V3、V4、V5或V6營養(yǎng)生長期或處于其之間，并且所述植物處理劑為染色體加倍劑，諸如秋水仙素。

離心

離心力可以任何不同的方式施加，但最通常使用離心機(jī)來完成。如本文所用，對(duì)離心的提及與離心力施加同義，并且術(shù)語“旋轉(zhuǎn)”和“離心”在本文同義地使用。

此處報(bào)告的離心參數(shù)與公式RCF＝1.12R(RPM/1000)²一致，其中RCF＝相對(duì)離心力，R＝旋轉(zhuǎn)半徑，并且RPM＝以每分鐘轉(zhuǎn)數(shù)測(cè)量的旋轉(zhuǎn)速度。由RCF表示的加速度大小還可以“g”的倍數(shù)(或“x g”)表示，其中g(shù)表示地球表面處的標(biāo)準(zhǔn)重力加速度。因此，50g或50x g或50RCF表示等效的加速度值。本文使用的RCF和g值表示一旦RPM已達(dá)到用戶設(shè)定的速度，向處于或靠近離心樣品(RCF_最大值)容器的底部處的樣品施加的加速度。因此，RCF＝RCF_最大值＝1.12R_最大值(RPM_最大值/1000)²。所預(yù)期的是，對(duì)于給定速度，普通技術(shù)人員可確定沿著旋轉(zhuǎn)半徑的任何點(diǎn)處的RCF。例如，普通技術(shù)人員可優(yōu)選使用RCF_最小值(向離心樣品容器的最近端施加的RCF)或RCF_ave(在整個(gè)離心樣品容器上施加的平均RCF)，以便實(shí)踐本公開的發(fā)明。向植物施加離心力的本發(fā)明實(shí)施方案包括使用任何加速方法以產(chǎn)生在效果方面與本文描述的那些效果基本等效的力，不管如何計(jì)算或?qū)崿F(xiàn)所述力。

在Beckman Coulter Allegra X-14系列離心機(jī)中使用SX4750A吊桶式轉(zhuǎn)子來達(dá)到本文描述的離心速度。當(dāng)在使用SX4750A轉(zhuǎn)子的Allegra X-14上向電子控制面板中輸入50RCF(xg)的值時(shí)，其產(chǎn)生大約463.5RPM的R_最大值，所述R_最大值產(chǎn)生：RCF_最大值＝50g，RCF_ave＝34g，以及RCF_最小值＝31.3。輸入10RCF(xg)的值產(chǎn)生：RCF_最大值＝10，RCF_ave＝14，以及R_最小值＝7.5。其他離心設(shè)置可需要不同的參數(shù)以產(chǎn)生大約相同的加速度，并且所預(yù)料的是，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可將這些值轉(zhuǎn)化到在沒有過度實(shí)驗(yàn)的相似原則上操作的其他系統(tǒng)或裝置。

在本發(fā)明的范圍內(nèi)考慮了使用不同的離心設(shè)置或裝置來調(diào)整離心參數(shù)以產(chǎn)生良好的結(jié)果。

在本發(fā)明的各種實(shí)施方案中，可以允許例如通過離心力向植物施加加速度的任何方式處理植物。通常，植物置于適于置于離心機(jī)中的容器(離心樣品容器)中。在某些實(shí)施方案中，所述容器可為小容器，諸如放置單株或幾株植物的管。在某些實(shí)施方案中，所述容器可為大容器，諸如可使許多植物同時(shí)一起離心和/或與植物處理劑接觸的燒瓶、瓶子、盒子、網(wǎng)或貯器。

在某些實(shí)施方案中，植物可一起保持在相同的離心容器中時(shí)經(jīng)受離心力，或者它們可分離或分開到其他容器中，諸如單個(gè)地或幾個(gè)地置于單獨(dú)容器中以進(jìn)行離心。單個(gè)地置于單獨(dú)容器中的大量植物可同時(shí)離心，或者它們可一次幾個(gè)地或單獨(dú)地和順序地離心。在一些實(shí)施方案中，在一次離心中一起處理多于一種的植物，然后在另外的離心期間(例如，作為在雙旋轉(zhuǎn)期間和/或作為連續(xù)離心處理的一部分)在單獨(dú)容器中單個(gè)地處理所述植物。

在某些實(shí)施方案中，無需使靶組織與儲(chǔ)備處理劑保持分離，也無需相對(duì)于在計(jì)劃的離心期間(例如，在浸沒性離心期間)產(chǎn)生的加速力對(duì)齊所述靶組織，在所述浸沒性離心中，所述靶組織在離心期間接觸和/或浸沒于儲(chǔ)備處理劑中。在某些實(shí)施方案中，其中所述靶組織在離心力施加期間處于接觸中或是浸沒的，一些部分的植物表面在離心期間也接觸或浸沒于儲(chǔ)備處理劑中。

在某些實(shí)施方案中，需要防止靶組織在離心期間接觸和/或浸沒于儲(chǔ)備處理劑中，并且需要相對(duì)于在離心期間(例如，在浸沒性離心期間)產(chǎn)生的加速力對(duì)齊所述靶組織，在所述浸沒性離心中，防止靶組織變得浸沒和/或接觸儲(chǔ)備處理劑，并且相對(duì)于在離心期間產(chǎn)生的加速力對(duì)齊所述靶組織。出于若干原因，諸如為促進(jìn)植物處理劑移動(dòng)至植物的靶組織或區(qū)域，或者為將藥劑從植物表面移除，或者僅僅為幫助在給定離心步驟上游或下游的步驟期間操作所述植物，可進(jìn)行某些定向的維持。

有用的離心力

在某些實(shí)施方案中，在至少一部分植物表面與植物處理劑接觸之后，向所述植物施加至少約10g的離心力。在某些實(shí)施方案中，施加的離心力不大于約50g。在某些實(shí)施方案中，施加的離心力為約10g至約50g。在某些實(shí)施方案中，施加的離心力不大于約100g。在某些實(shí)施方案中，施加的離心力為約10g至約100g。在某些實(shí)施方案中，施加的離心力不大于約250g。在某些實(shí)施方案中，施加的離心力為約10g至約250g。在某些實(shí)施方案中，施加的離心力不大于約500g。在某些實(shí)施方案中，施加的離心力為約10g至約500g。在某些實(shí)施方案中，施加的離心力不大于約750g。在某些實(shí)施方案中，施加的離心力為約10g至約750g。在某些實(shí)施方案中，施加的離心力不大于約1000g。在某些實(shí)施方案中，施加的離心力為約10g至約1000g。在某些實(shí)施方案中，施加的離心力為約500g至約1000g。在某些實(shí)施方案中，施加的離心力不大于約1250g。在某些實(shí)施方案中，施加的離心力為約10g至約1250g。在某些實(shí)施方案中，施加的離心力為約750g至約1250g。在某些實(shí)施方案中，施加的離心力不大于約1500g。在某些實(shí)施方案中，施加的離心力為約10g至約1500g。在某些實(shí)施方案中，施加的離心力為約1000g至約1500g。在某些實(shí)施方案中，施加的離心力不大于約1750g。在某些實(shí)施方案中，施加的離心力為約10g至約1750g。在某些實(shí)施方案中，施加的離心力為約1250g至約1750g。在某些實(shí)施方案中，施加的離心力不大于約1000g。在某些實(shí)施方案中，施加的離心力為約10g至約1000g。在某些實(shí)施方案中，施加的離心力為約1500g至約1000g。在某些實(shí)施方案中，施加的離心力不大于約2000g。在某些實(shí)施方案中，施加的離心力為約10g至約2000g。在某些實(shí)施方案中，施加的離心力為約300g至約2000g。在某些實(shí)施方案中，施加的離心力不大于約2250g。在某些實(shí)施方案中，施加的離心力為約10g至約2250g。在某些實(shí)施方案中，施加的離心力為約1750g至約2250g。在某些實(shí)施方案中，施加的離心力不大于約2500g。在某些實(shí)施方案中，施加的離心力為約10g至約2500g。在某些實(shí)施方案中，施加的離心力為約1000g至約2500g。在某些實(shí)施方案中，施加的離心力不大于約2750g。在某些實(shí)施方案中，施加的離心力為約10g至約2750g。在某些實(shí)施方案中，施加的離心力為約2250g至約2750g。在某些實(shí)施方案中，施加的離心力不大于約3000g。在某些實(shí)施方案中，施加的離心力為約10g至約3000g。在某些實(shí)施方案中，施加的離心力為約2500g至約3000g。在某些實(shí)施方案中，施加的離心力不大于約3250g。在某些實(shí)施方案中，施加的離心力為約10g至約3250g。在某些實(shí)施方案中，施加的離心力為約2750g至約3250g。在某些實(shí)施方案中，施加的離心力不大于約3500g。在某些實(shí)施方案中，施加的離心力為約10g至約3500g。在某些實(shí)施方案中，施加的離心力為約3000g至約3500g。在某些實(shí)施方案中，施加的離心力不大于約3750g。在某些實(shí)施方案中，施加的離心力為約10g至約3750g。在某些實(shí)施方案中，施加的離心力為約3250g至約3750g。在某些實(shí)施方案中，施加的離心力不大于約4000g。在某些實(shí)施方案中，施加的離心力為約10g至約4000g。在某些實(shí)施方案中，施加的離心力為約3500g至約4000g。

有用的離心持續(xù)時(shí)間

在某些實(shí)施方案中，離心力施加至少約1秒。在某些實(shí)施方案中，離心力施加至少約5秒。在某些實(shí)施方案中，離心力施加至少約10秒。在某些實(shí)施方案中，離心力施加至少約15秒。在某些實(shí)施方案中，離心力施加至少約10秒。在某些實(shí)施方案中，離心力施加至少約30秒。在某些實(shí)施方案中，離心力施加至少約40秒。在某些實(shí)施方案中，離心力施加至少約50秒。在某些實(shí)施方案中，離心力施加至少約60秒。在某些實(shí)施方案中，離心力施加至少約90秒。在某些實(shí)施方案中，離心力施加至少約2分鐘。在某些實(shí)施方案中，離心力施加至少約3分鐘。在某些實(shí)施方案中，離心力施加至少約5分鐘。在某些實(shí)施方案中，離心力施加至少約10分鐘。在某些實(shí)施方案中，離心力施加至少約15分鐘。在某些實(shí)施方案中，離心力施加至少約10分鐘。在某些實(shí)施方案中，離心力施加至少約30分鐘。在某些實(shí)施方案中，離心力施加至少約45分鐘。在某些實(shí)施方案中，離心力施加至少約60分鐘。在某些實(shí)施方案中，離心力施加至少約90分鐘。在某些實(shí)施方案中，離心力施加至少約110分鐘。在某些實(shí)施方案中，離心力施加至少約150分鐘。在某些實(shí)施方案中，離心力施加至少約180分鐘。

在某些實(shí)施方案中，離心力施加約1秒與約60分鐘之間或約10秒與約60分鐘之間。在某些實(shí)施方案中，離心力施加約1秒與約45分鐘之間或約1秒與約45分鐘之間，或約1秒與約30分鐘之間或約1秒與約30分鐘之間，或約1秒與約10分鐘之間或約1秒與約10分鐘之間，或約1秒與約15分鐘之間或約1秒與約10分鐘之間，或約1秒與約10分鐘之間，或約1秒與約5分鐘之間或約1秒與約10分鐘之間，或約1秒與約10分鐘之間或約1秒與約10分鐘之間。在某些實(shí)施方案中，離心力施加約1秒與約180分鐘之間。

有用的孵育時(shí)間

遞送植物處理劑的方法通常涉及將植物暴露于處理劑中。這可需要暴露于植物處理劑中持續(xù)一段延長的時(shí)間，以便允許所述藥劑充分地轉(zhuǎn)移至所述植物的選定組織和/或細(xì)胞中。出于各種原因，包括一些處理劑的毒副作用和/或因?yàn)樗鼮橛行?，可能期望限制植物與植物處理劑接觸的時(shí)間。包括向植物施加離心力的某些實(shí)施方案可縮短植物與植物處理劑接觸來實(shí)現(xiàn)植物處理劑至植物組織的充分遞送所需的時(shí)間，以便在植物或植物組織中實(shí)現(xiàn)期望的變化。

在某些實(shí)施方案中，在施加離心力之前，植物與包含植物處理劑的溶液接觸少于約3.5小時(shí)，或少于約2小時(shí)，或少于約1小時(shí)，或少于約45分鐘，或少于約30分鐘，或少于約10分鐘，或少于約10分鐘，或少于約5分鐘或少于約1分鐘。

在某些實(shí)施方案中，所述植物與處理劑接觸，僅持續(xù)使植物與藥劑接觸所需的時(shí)間量，并且將所述植物加載到離心機(jī)中并開始離心。在某些其他實(shí)施方案中，所述植物可在添加以及然后移除處理劑時(shí)保持在容器中。例如，諸如圖7所示的植物和PCS(植物離心支持體)組合可與自動(dòng)化系統(tǒng)結(jié)合使用，所述自動(dòng)化系統(tǒng)在植物保持在容器內(nèi)時(shí)將處理劑推動(dòng)至容器中或者將處理劑從容器中移除。在某些實(shí)施方案中，玉米植物可置于離心容器中，并且由諸如圖7所示的PCS來固定，其中手動(dòng)或自動(dòng)化系統(tǒng)向容器中遞送處理劑，直至接觸和/或浸沒選定組織或圍繞所述PCS的組織的程度。在某些實(shí)施方案中，自動(dòng)或手動(dòng)系統(tǒng)還將大部分處理劑從容器中移除，使一些處理劑仍然留在植物上或植物中，因此將所述植物準(zhǔn)備用于后續(xù)的非浸沒性離心。在一些實(shí)施方案中，在施加離心力之前，靶組織與包含例如秋水仙素的液體加倍劑接觸少于一秒。

在某些實(shí)施方案中，可通過在對(duì)植物進(jìn)行離心之前將植物放置、浸沒或浸漬于包含植物處理劑的液體的貯器中并且然后將所述植物從所述溶液中移除來使至少一部分植物表面與植物處理劑接觸。在某些實(shí)施方案中，可向含有植物的容器中添加植物處理劑，然后可在一段時(shí)間后移除所述植物處理劑，使所述植物留在所述容器中，而一些殘留的處理劑仍然留在所述植物中或所述植物上。所述植物可在溶液保持少于一秒、約一秒，或至少約5秒，或至少約10秒，或至少約30秒，或至少約一分鐘、至少約五分鐘、至少約十分鐘、至少約10分鐘、至少約30分鐘、至少約45分鐘、至少約1小時(shí)、1.5小時(shí)、2小時(shí)、2.5小時(shí)、3小時(shí)或更長時(shí)間。

在某些實(shí)施方案中，在施加離心力之前，單倍體植物與包含染色體加倍劑諸如秋水仙素的溶液接觸約5分鐘與約1小時(shí)之間。

離心技術(shù)

在某些實(shí)施方案中，在離心期間，與植物表面接觸或以其他方式處于具有植物的離心容器內(nèi)的處理劑的微滴在離心開始時(shí)將由在離心期間產(chǎn)生的推入植物中或穿過離心容器直至被離心容器的壁和/或底部阻擋。一旦阻擋，取決于離心容器內(nèi)表面的形狀，所述溶液就將開始以液體進(jìn)行的可預(yù)測(cè)方式匯集。在離心力施加期間與植物一起離心以及在植物外面匯集的一定量的處理劑被稱為“儲(chǔ)備”處理劑。在離心力施加期間吸收到植物中的一定量的處理劑稱為“吸收”處理劑。

在某些實(shí)施方案中，根據(jù)在離心期間植物如何定向和/或在離心期間多少處理液處于具有所述植物的離心容器中，在離心力施加期間，靶組織和/或圍繞所述靶組織的表面組織將浸沒于或未浸沒于儲(chǔ)備處理劑中。

某些實(shí)施方案提供用于向植物組織遞送植物處理劑的方法，其中所述方法包括使植物至少表面與包含植物處理劑的溶液接觸。除非另行說明，否則本文其他地方公開的用于使植物與包含植物處理劑的溶液接觸以及施加離心力的所有參數(shù)均適用于所述方法。在某些實(shí)施方案中，所接觸的植物表面的量為至少約1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％或更多。在某些實(shí)施方案中，所述植物已經(jīng)萌發(fā)。在接觸植物之后，向已經(jīng)與包含植物處理劑的溶液接觸的植物施加離心力。在離心力施加期間，所述力將傾向于朝所述力的方向驅(qū)動(dòng)溶液。根據(jù)力的大小、力的持續(xù)時(shí)間以及植物和容器的物理特征，在離心力施加之前附著到所述植物的至少一部分溶液可在離心力施加期間從所述植物的表面移除。然而，在一些實(shí)施方案中，存在足以使至少一部分植物(諸如選定組織或圍繞所述選定組織的組織)保持接觸和/或浸沒的溶液的量。在某些實(shí)施方案中，在離心力施加期間，至少約1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％或更多的植物表面保持與所述溶液接觸。在某些實(shí)施方案中，在離心步驟期間，大于約25％、50％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％的溶液脫離與所述植物的表面的接觸。在某些實(shí)施方案中，施加如本文其他地方所更加詳細(xì)地說明的約10g至約4000g的離心力。在某些實(shí)施方案中，在步驟期間，所述植物的軸相對(duì)于所述離心力的方向?qū)R。在某些實(shí)施方案中，所述植物在一定程度上與所述離心力的方向?qū)R。在某些實(shí)施方案中，植物與植物離心支持體(PCS)結(jié)合，所述植物離心支持體在本文其他地方進(jìn)行了詳細(xì)描述。與PCS結(jié)合的植物可完全浸沒于溶液中、基本上浸沒于溶液中、部分浸沒于溶液中，或基本上擺脫溶液而離心，其中所述植物未浸沒于所述溶液中(例如，當(dāng)接觸所述植物的所述溶液僅僅是在與所述溶液接觸后粘著到所述植物的表面的溶液時(shí))等等。在某些實(shí)施方案中，植物附著到PCS，諸如纏繞到、系到、捆扎到等等。在某些實(shí)施方案中，在離心力施加期間，植物的軸由PCS來維持。在某些實(shí)施方案中，PCS維持所述植物的軸與所述離心力的方向在一定程度上對(duì)齊。在某些實(shí)施方案中，植物與植物離心支持體直接接觸，然而在其他實(shí)施方案中，植物不與植物離心支持體直接接觸。在某些實(shí)施方案中，離心力引起植物處理劑轉(zhuǎn)移，以便所述植物處理劑接觸在所述植物在離心力施加之前與所述植物處理劑接觸時(shí)未被接觸的所述植物的組織。在某些實(shí)施方案中，所述植物組織為分生組織，諸如莖尖分生組織(SAM)。在某些實(shí)施方案中，所述植物為玉米植物，例如處于VE、V1、V2、V3、V4、V5或V6營養(yǎng)生長期的玉米植物。

除非另行說明，否則本文其他地方公開的用于使植物與包含植物處理劑的溶液接觸以及施加離心力的所有參數(shù)均適用于涉及創(chuàng)建雙單倍體植物、增加加倍效率等的方法。某些實(shí)施方案提供創(chuàng)建雙單倍體玉米植物的方法。單倍體植物諸如DH₀母本植物的表面與包含染色體加倍劑的溶液接觸。所接觸的表面的量可為如本文其他地方所更加詳細(xì)地描述的任何量。然后向DH₀母本植物施加離心力。如本文公開的某些實(shí)施例所證實(shí)的那樣，在某些實(shí)施方案中，實(shí)現(xiàn)了至少一定量的加倍效率。如本文公開的某些實(shí)施例所證實(shí)的那樣，除了創(chuàng)建雙單倍體植物之外，所述方法與其他方法相比還可增加所達(dá)到的加倍效率。在創(chuàng)建雙單倍體植物期間，DH₀母本植物產(chǎn)生至少一種單倍體玉米卵子，從而創(chuàng)建雙單倍體玉米植物。在某些實(shí)施方案中，在離心力施加期間，至少5％的植物表面，或本文其他地方所更加詳細(xì)地說明的另一種量保持與包含染色體加倍劑的溶液接觸。在其他實(shí)施方案中，在離心力施加期間，大于99％的包含染色體加倍劑的溶液，或本文其他地方所更加詳細(xì)地說明的另一種量脫離與所述植物的表面的接觸。在某些實(shí)施方案中，施加如本文其他地方所更加詳細(xì)地說明的約10g至約4000g的離心力。在某些實(shí)施方案中，如本文其他地方所更加詳細(xì)地說明的，向所述植物施加的離心力的持續(xù)時(shí)間為約1秒至約180分鐘。在某些實(shí)施方案中，如本文其他地方所詳述的，在離心期間，所述植物與所述離心力的方向?qū)R。在某些實(shí)施方案中，在離心力施加期間,所述植物的軸由植物離心支持體來維持。在某些實(shí)施方案中，植物離心支持體維持所述植物的軸與所述離心力的方向在一定程度上對(duì)齊。在某些實(shí)施方案中，植物與植物離心支持體直接接觸，并且在某些實(shí)施方案中，植物不與植物離心支持體直接接觸。在某些實(shí)施方案中，相比于通過在沒有離心的情況下接觸莖分生組織來實(shí)現(xiàn)莖分生組織與染色體加倍劑的接觸，離心力增加所述染色體加倍劑與所述莖分生組織的接觸。在某些實(shí)施方案中，離心力引起染色體加倍劑轉(zhuǎn)移，以便所述藥劑接觸在所述植物在離心力施加之前與所述染色體加倍劑接觸時(shí)未被接觸的所述植物的組織。在某些實(shí)施方案中，所述玉米植物處于VE、V1、V2、V3、V4、V5或V6營養(yǎng)生長期。在某些實(shí)施方案中，所述染色體加倍劑為秋水仙素。在某些實(shí)施方案中，在所述施加離心力之前，所述植物與包含染色體加倍劑的溶液接觸少于約1小時(shí)或3小時(shí)的持續(xù)時(shí)間，或持續(xù)一段本文其他地方描述的持續(xù)時(shí)間。

某些實(shí)施方案提供用于向植物組織遞送植物處理劑的方法，其包括使植物表面與包含植物處理劑的溶液接觸，并且向與所述溶液接觸的所述植物施加離心力，其中在離心力施加期間，所述植物的軸由植物離心支持體(PCS)來維持，從而向所述植物組織遞送所述植物處理劑。除非另行說明，否則本文其他地方公開的用于使植物與包含植物處理劑的溶液接觸以及施加離心力的所有參數(shù)均適用于所述方法。在某些實(shí)施方案中，在步驟期間，PCS維持所述植物的軸與所述離心力的方向?qū)R。在某些實(shí)施方案中，植物與植物離心支持體直接接觸，并且在某些實(shí)施方案中，植物不與植物離心支持體直接接觸。在某些實(shí)施方案中，施加約10g至約500g的離心力。在某些實(shí)施方案中，施加約500g至約4000g的離心力。在某些實(shí)施方案中，離心力引起植物處理劑轉(zhuǎn)移，以便所述植物處理劑接觸在所述植物在離心之前與所述植物處理劑接觸時(shí)未與所述植物處理劑接觸的所述植物的組織。在某些實(shí)施方案中，相比于在離心力施加之前選定植物與植物處理劑的接觸，離心力的施加增加選定組織與植物處理劑的接觸。在某些實(shí)施方案中，所述植物組織為莖分生組織。在某些實(shí)施方案中，所述植物為玉米植物，例如處于VE、V1、V2、V3、V4、V5或V6營養(yǎng)生長期的玉米植物。在某些實(shí)施方案中，所述植物為DH₀植物。在某些實(shí)施方案中，所述植物處理劑為染色體加倍劑，例如秋水仙素。在某些實(shí)施方案中，相比于在離心力施加之前實(shí)現(xiàn)莖分生組織與染色體加倍劑的接觸，離心力增加所述染色體加倍劑與所述莖分生組織的接觸。

某些實(shí)施方案提供用于向植物組織遞送植物處理劑的方法，其中方法包括使植物表面與包含植物處理劑的溶液接觸，并且向所述植物施加第一離心力。在施加第一離心力之后，將離心力移除。然后，向經(jīng)受第一離心力的植物施加后續(xù)離心力。本文其他地方公開的用于使植物與包含植物處理劑的溶液接觸以及施加離心力的所有參數(shù)均適用于接觸所述植物以及第一離心力施加和后續(xù)離心力施加。

非浸沒性離心

在非浸沒性離心期間，在基本上整個(gè)離心力施加過程中，靶組織與儲(chǔ)備處理液分離。換言之，在某些實(shí)施方案中，當(dāng)?shù)跬笆诫x心機(jī)加速或減速并且儲(chǔ)備液還未到達(dá)所述植物外面的位置時(shí)，可存在一段通常相對(duì)短暫的時(shí)期，其中例如在離心開始和/或結(jié)束時(shí)，選定組織是浸沒的，在所述位置中所述儲(chǔ)備液將在離心期間靜止和/或再積累于所述植物上。

一旦植物已經(jīng)諸如通過浸泡于液體主體中來與包含植物處理劑的溶液接觸，所述植物就可與用來接觸所述植物的液體的主體分離。雖然用來接觸植物的溶液的主體與所述植物分離，但是一些溶液通常將通常作為在所述溶液的主體移除之后依附至所述表面(例如，“涂覆”所述植物表面)或以其他方式保留一段時(shí)間的微滴保持與所述植物的表面接觸。

當(dāng)選定組織或圍繞所述選定組織的植物表面在離心期間與處理液接觸并且適當(dāng)對(duì)齊時(shí)，留在所述植物上或植物中的一些處理劑將由在非浸沒性離心期間產(chǎn)生的加速力推動(dòng)到所述植物的選定組織中。這種對(duì)齊將取決于選定組織，并且僅需要采用基本物理原理來測(cè)定有效定向。在非浸沒性離心期間離開植物的處理劑將穿過離心容器來以液體進(jìn)行的可預(yù)測(cè)方式匯入離心容器的一端處的儲(chǔ)備處理劑中。

在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，在離心期間或在離心結(jié)束時(shí)，少于99％，或少于98％，或少于97％，或少于96％，或少于95％，或少于94％，或少于93％，或少于92％，或少于91％，或少于90％，或少于89％，或少于88％，或少于87％，或少于86％，或少于85％，或少于84％，或少于83％，或少于82％，或少于81％，或少于80％的植物表面保持與植物處理劑接觸。

在某些實(shí)施方案中，在離心力施加之前和/或期間，包含植物處理劑的溶液從所述植物的表面移除或基本移除，以便所述植物表面中的少于約5％、少于約4％、少于約3％、少于約2％或少于約1％表面到離心力施加結(jié)束時(shí)保持與包含所述植物處理劑的溶液接觸，而無需另外的溶液移除。

例如，在如本文實(shí)例中所述的非浸沒性離心期間，在離心期間從所述植物的表面轉(zhuǎn)移的所有植物處理劑在離心結(jié)束時(shí)靠著靠近所述植物的根部的離心容器的壁積累。因?yàn)橐恍└恳才c離心容器的這種壁接觸，所以儲(chǔ)備液分散到一部分根部，因此所述一些根部在離心結(jié)束時(shí)保持與所述處理液接觸。注意在非浸沒性旋轉(zhuǎn)期間限制這種接觸，包括限制在接觸步驟期間所用的處理液，以便在典型的非浸沒性旋轉(zhuǎn)中，在離心力施加期間和/或之后，僅幾毫升處理液匯集在離心容器中。

某些實(shí)施方案提供使用各種方法來從選定組織中進(jìn)一步分離儲(chǔ)備處理劑，所述各種方法包括并入吸收所述儲(chǔ)備處理劑的材料。還提供的是，人們可在離心力施加期間使用成形的離心容器，以便其在離心期間將處理液儲(chǔ)存在使所述儲(chǔ)備處理劑在從所述植物中轉(zhuǎn)移離開之后不再接觸選定組織的一個(gè)地方，或者使用可插入性隔離物來完成相似的結(jié)果。還提供的是，儲(chǔ)備處理劑在離心期間例如使用用于液體在離心期間退出的離心容器的一端處的開口退出離心容器。在那種情況下，儲(chǔ)備處理劑在離心力施加期間不靜止在離心容器內(nèi)部，但是退出至使其在離心力施加期間不接觸選定組織的位置。

在某些實(shí)施方案中，植物的軸相對(duì)于離心力對(duì)齊。植物可被描述成具有多個(gè)軸。這些軸中的一個(gè)為莖根軸(shoot-root axis)，其朝根端上至莖端的方向上延伸，并且反之亦然。在某些實(shí)施方案中，所述植物的莖根軸與所述離心力的方向?qū)R。在某些實(shí)施方案中，所述植物的莖根軸例如在所述離心力的方向的3°以內(nèi)基本上對(duì)齊。在某些實(shí)施方案中，所述植物的莖根軸在所述離心力的方向的1°、2°、3°、4°、5°、6°、7°、8°、9°、10°、11°、12°、13°、14°、15°、16°、17°、18°、19°、20°、21°、22°、23°、24°、25°、26°、27°、28°、29°或30°以內(nèi)對(duì)齊。

在某些實(shí)施方案中，在離心期間，所述植物的莖根軸與所述離心力的方向?qū)R，并且向所述植物提供PCS以阻止所述植物在離心力施加期間彎曲、屈曲、塌縮等。在某些實(shí)施方案中，所述支持體防止所述植物被離心期間產(chǎn)生的力損傷。在某些實(shí)施方案中，所述支持體允許植物從離心力施加中恢復(fù)，其中不具有所述支持體的相同的植物將損傷而無法恢復(fù)。在某些實(shí)施方案中，所述支持體通過防止彎曲、屈曲、塌縮等來維持或至少通常維持所述植物的莖根軸。

在某些實(shí)施方案中，所述支持體維持植物的軸諸如莖根軸相對(duì)于所述離心力的方向的對(duì)齊。在某些實(shí)施方案中，所述支持體維持植物的軸諸如莖根軸與所述離心力的方向的對(duì)齊，或者與所述離心力的方向至少基本上對(duì)齊，例如在所述離心力的方向的3°以內(nèi)。在某些實(shí)施方案中，所述支持體維持植物的軸諸如莖根軸在所述離心力的方向的1°、2°、3°、4°、5°、6°、7°、8°、9°、10°、11°、12°、13°、14°、15°、16°、17°、18°、19°、20°、21°、22°、23°、24°、25°、26°、27°、28°、29°或30°以內(nèi)對(duì)齊。

在某些實(shí)施方案中，所述支持體提供高于預(yù)期的離心速度/力的使用，同時(shí)阻止所述植物彎曲、屈曲、塌縮等。在某些實(shí)施方案中，所述支持體提供高于預(yù)期的離心速度/力的使用，同時(shí)阻止所述植物被離心期間產(chǎn)生的力損傷。在某些實(shí)施方案中，所述支持體提供高于預(yù)期的離心速度/力的使用，同時(shí)允許植物從離心力施加中恢復(fù)，其中不具有所述支持體的相同的植物將損傷而無法恢復(fù)。

在某些實(shí)施方案中，如本文所述的支持結(jié)構(gòu)的使用允許向植物施加高達(dá)約500g、750g、1000g、1250g、1500g、1750g、2000g、2250g、2500g、2750g、3000g、3500g或4000g的離心力。在某些實(shí)施方案中，如本文所述的支持結(jié)構(gòu)的使用允許向植物施加約10g或20g或100g或300g至約500g、750g、1000g、1250g、1500g、1750g、2000g、2250g、2500g、2750g、3000g、3500g或4000g的離心力。在某些實(shí)施方案中，如本文所述的支持結(jié)構(gòu)的使用允許向植物施加至少約500g、750g、1000g、1250g、1500g、1750g、2000g、2250g、2500g、2750g、3000g或4000g的離心力。在某些實(shí)施方案中，施加的離心力為約10g至約4000g。在某些實(shí)施方案中，施加的離心力為約300g至約2000g。在某些實(shí)施方案中，施加的離心力為約500g至約2000g。在某些實(shí)施方案中，施加的離心力為約750g至約1250g。在某些實(shí)施方案中，施加的離心力為約1000g至約1500g。在某些實(shí)施方案中，施加的離心力為約1250g至約1750g。在某些實(shí)施方案中，施加的離心力為約1500g至約2000g。在某些實(shí)施方案中，施加的離心力為約1750g至約2250g。在某些實(shí)施方案中，施加的離心力為約2000g至約2500g。在某些實(shí)施方案中，施加的離心力為約2250g至約2750g。在某些實(shí)施方案中，施加的離心力為約2500g至約3000g。在某些實(shí)施方案中，施加的離心力為約2750g至約3250g。在某些實(shí)施方案中，施加的離心力為約3000g至約3500g。在某些實(shí)施方案中，施加的離心力為約3250g至約3750g。在某些實(shí)施方案中，施加的離心力為約3500g至約4000g。在某些實(shí)施方案中，施加的離心力為約500g、750g、1000g、1250g、1500g、1750g、2000g、2250g、2500g、2750g、3000g或3500g中的任一個(gè)至約750g、1000g、1250g、1500g、1750g、2000g、2250g、2500g、2750g、3000g、3500g或4000g中的任一個(gè)。

在某些實(shí)施方案中，向植物和支持結(jié)構(gòu)施加離心力至少1秒、5秒、10秒、20秒、30秒、45秒、1分鐘、2分鐘、3分鐘、4分鐘、5分鐘、10分鐘、20分鐘、30分鐘、45分鐘、60分鐘、120分鐘或180分鐘。在某些實(shí)施方案中，向植物和支持結(jié)構(gòu)施加離心力不超過約5秒、10秒、20秒、30秒、45秒、1分鐘、2分鐘、3分鐘、4分鐘、5分鐘、10分鐘、20分鐘、30分鐘、45分鐘、60分鐘、120分鐘或180分鐘。在某些實(shí)施方案中，向植物和支持結(jié)構(gòu)施加離心力，持續(xù)約1秒、5秒、10秒、20秒、30秒、45秒、1分鐘、2分鐘、3分鐘、4分鐘、5分鐘、10分鐘、20分鐘、30分鐘、45分鐘、60分鐘或120分鐘中的任一個(gè)至約5秒、10秒、20秒、30秒、45秒、1分鐘、2分鐘、3分鐘、4分鐘、5分鐘、10分鐘、20分鐘、30分鐘、45分鐘、60分鐘、120分鐘或180分鐘中的任一個(gè)。

非浸沒性離心之后，植物可進(jìn)行后續(xù)處理(即，連續(xù)離心)或諸如用水沖洗(如果需要)，以便去除任何剩余的植物處理液，然后通過移植于生長培養(yǎng)基中來恢復(fù)，并且在受保護(hù)的環(huán)境(例如，溫室、遮陰棚、生長室或生長箱、組織培養(yǎng)室等)中照管，或者直接移植到大田。

浸沒性離心

在浸沒性旋轉(zhuǎn)期間，靶組織浸沒和/或保持與儲(chǔ)備處理劑接觸，所述儲(chǔ)備處理劑即離心容器中未轉(zhuǎn)移至植物中的處理劑主體。在某些實(shí)施方案中，在離心力施加期間，剩余的植物體也浸沒和/或保持與離心容器中的儲(chǔ)備處理劑接觸。在某些實(shí)施方案中，PCS用來支持植物的靶組織和/或剩余的植物體，以便靶組織在離心力施加期間浸沒于處理劑中，而基本上剩余的植物體未浸沒。

在某些實(shí)施方案中，在所述植物的表面與包含所述植物處理劑的溶液的最初接觸之后，可添加另外的溶液以確保在離心力施加期間基本上所述植物的大部分和/或靶向組織保持浸沒和或與儲(chǔ)備處理液接觸。

不管本文對(duì)“浸沒的”的一般提及，所述方法不限于要求整個(gè)植物在離心期間浸沒。在本文進(jìn)行的浸沒性離心中，我們發(fā)現(xiàn)，只要靶向組織浸沒，和/或圍繞所述靶向組織的植物的表面上的組織浸沒，就可獲得向所述組織進(jìn)行的藥劑的良好遞送。在某些實(shí)施方案中，其中至少選定組織浸沒，和/或圍繞所述靶向組織的植物的表面上的組織浸沒，獲得了向所述組織進(jìn)行的藥劑的良好遞送。

在某些實(shí)施方案中，一株或多株植物置于容器中，并且包含植物處理劑的溶液倒在它們上直至充分浸沒。在某些實(shí)施方案中，在離心期間，僅選定組織和/或圍繞靶向組織的表面組織保持與處理劑接觸。

例如，其中所述選定組織為莖尖分生組織，在浸沒性離心期間接觸少于約1％的植物總表面區(qū)域，以便實(shí)現(xiàn)向SAM的組織遞送藥劑。在某些實(shí)施方案中，在浸沒性離心期間，少于約1％的植物表面需要與植物處理劑接觸，以便向靶向組織遞送所述植物處理劑。

在某些實(shí)施方案中，在浸沒性離心期間，至少約1％或更多的植物表面需要保持與植物處理液接觸。在某些實(shí)施方案中，在離心期間，所述植物表面中至少約1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％或100％的植物的表面浸沒于植物處理劑中。

在某些實(shí)施方案中，多株植物置于也作為包含植物處理劑的溶液的貯器的容器中，以便所述多株植物一起捆扎于所述溶液中。雖然所述植物將通常浸沒，但是所述植物中的一些可能不總是使它們的所有表面覆蓋。在某些實(shí)施方案中，在離心之前，所述植物在處理劑中混合或攪動(dòng)至少一次，以便幫助確保所有植物表面在離心之前或期間的在某個(gè)時(shí)間與處理劑接觸。

在某些實(shí)施方案中，在離心期間，所述植物和/或所述植物的軸不需要相對(duì)于彼此和/或相對(duì)于加速力排列或?qū)R。例如，在某些實(shí)施方案中，多株諸如約一打、約幾打、約50株、約75株、約100株等幼苗可置于包含植物處理液的液體的貯器中，并且允許約在離心之前和/或期間混合。在某些實(shí)施方案中，未注意所述植物的對(duì)齊。在某些其他實(shí)施方案中，所述多株植物中的兩株或更多株或它們的軸有意地相對(duì)于彼此對(duì)齊。在某些實(shí)施方案中，不論是否有意，在離心期間，所述多株植物中的至少約5％、10％、20％、25％、30％、40％、50％、60％、70％、75％、80％、90％、95％、98％、99％或100％或它們的軸都相對(duì)于彼此對(duì)齊。例如，在離心期間將植物對(duì)齊植物和/捆扎在一起，以便它們將為另外的下游步驟做準(zhǔn)備，諸如第一離心之后的另外一次或多次的另外離心步驟。在第一離心之前進(jìn)行的對(duì)齊和/或捆扎可使進(jìn)行的后續(xù)步驟(諸如也進(jìn)行了植物的對(duì)齊的某些實(shí)施方案中的離心)更為有效。

在某些實(shí)施方案中，與植物處理劑接觸的植物的表面區(qū)域的量可隨著植物類型和/或所述植物的結(jié)構(gòu)、植物的尺寸、植物處理劑待遞送至的組織、所述植物的發(fā)育期以及可供使用的包含植物處理劑的溶液的量等因素而變化。在某些實(shí)施方案中，約1％與100％之間的植物表面與植物處理劑接觸。在某些實(shí)施方案中，約5％與100％之間的植物表面與植物處理劑接觸。在某些實(shí)施方案中，在離心期間，至少約1％，或至少約2％，或至少約5％，或至少約10％，或至少約20％，或至少約30％，或至少約40％，或至少約50％，或至少約60％，或至少約70％，或至少約80％，或至少約90％，或至少約95％，或至少約98％，或至少約99％或約100％(例如，植物完全浸沒于溶液中)的植物的表面保持與包含所述植物處理劑的溶液接觸。

在某些實(shí)施方案中，其中至少一部分的所述植物表面在離心期間保持接觸或浸沒，可施加高達(dá)約20g、40g、50g、60g、70g、75g、80g、90g、100g、150g、200g、250g、300g、350g、400g、450g、500g、550g、600g、650g、700g、750g、800g、850g、900g、950g、1000g、1050g、1100g、1150g、1200g、1250g、1300g、1350g、1400g、1450g、1500g、1550g、1600g、1650g、1700g、1750g、1800g、1850g、1900g、1950g、2000g、2050g、2100g、2150g、2200g、2250g、2300g、2350g、2400g、2450g、2500g、2550g、2600g、2650g、2700g、2750g、2800g、2850g、2900g、2950g、3000g、3050g、3100g、3150g、3200g、3250g、3300g、3350g、3400g、3450g、3500g、3550g、3600g、3650g、3700g、3750g、3800g、3850g、3900g、3950g或4000g的離心力。在某些實(shí)施方案中，其中至少一部分的所述植物表面在離心期間保持接觸或浸沒，可施加至少約10g、20g、40g、50g、60g、70g、75g、80g、90g、100g、150g、200g、250g、300g、350g、400g、450g、500g、550g、600g、650g、700g、750g、800g、850g、900g、950g、1000g、1050g、1100g、1150g、1200g、1250g、1300g、1350g、1400g、1450g、1500g、1550g、1600g、1650g、1700g、1750g、1800g、1850g、1900g、1950g、2000g、2050g、2100g、2150g、2200g、2250g、2300g、2350g、2400g、2450g、2500g、2550g、2600g、2650g、2700g、2750g、2800g、2850g、2900g、2950g、3000g、3050g、3100g、3150g、3200g、3250g、3300g、3350g、3400g、3450g、3500g、3550g、3600g、3650g、3700g、3750g、3800g、3850g、3900g、3950g或4000g的離心力。在某些實(shí)施方案中，施加的離心力來自約10g、20g、40g、50g、60g、70g、75g、80g、90g、100g、150g、200g、250g、300g、350g、400g、450g、500g、550g、600g、650g、700g、750g、800g、850g、900g、950g、1000g、1050g、1100g、1150g、1200g、1250g、1300g、1350g、1400g、1450g、1500g、1550g、1600g、1650g、1700g、1750g、1800g、1850g、1900g、1950g、2000g、2050g、2100g、2150g、2200g、2250g、2300g、2350g、2400g、2450g、2500g、2550g、2600g、2650g、2700g、2750g、2800g、2850g、2900g、2950g、3000g、3050g、3100g、3150g、3200g、3250g、3300g、3350g、3400g、3450g、3500g、3550g、3600g、3650g、3700g、3750g、3800g、3850g、3900g、3950g或4000g中的任一個(gè)。

在此類實(shí)施方案中的某些中，施加離心力至少1秒、5秒、10秒、20秒、30秒、45秒、1分鐘、2分鐘、3分鐘、4分鐘、5分鐘、10分鐘、20分鐘、30分鐘、45分鐘、60分鐘、120分鐘或180分鐘。在某些實(shí)施方案中，向植物和支持結(jié)構(gòu)施加離心力不超過約5秒、10秒、20秒、30秒、45秒、1分鐘、2分鐘、3分鐘、4分鐘、5分鐘、10分鐘、20分鐘、30分鐘、45分鐘、60分鐘、120分鐘或180分鐘。在某些實(shí)施方案中，向植物和支持結(jié)構(gòu)施加離心力，持續(xù)約1秒、5秒、10秒、20秒、30秒、45秒、1分鐘、2分鐘、3分鐘、4分鐘、5分鐘、10分鐘、20分鐘、30分鐘、45分鐘、60分鐘或120分鐘中的任一個(gè)至約5秒、10秒、20秒、30秒、45秒、1分鐘、2分鐘、3分鐘、4分鐘、5分鐘、10分鐘、20分鐘、30分鐘、45分鐘、60分鐘、120分鐘或180分鐘中的任一個(gè)。

在某些實(shí)施方案中，來自所述植物表面與包含所述植物處理劑的溶液接觸時(shí)以及移除時(shí)的持續(xù)時(shí)間為至少約一秒、5秒、30秒、一分鐘、五分鐘、十分鐘、20分鐘、30分鐘、45分鐘、1小時(shí)、1.5小時(shí)、2小時(shí)、2.5小時(shí)、3小時(shí)或更長時(shí)間。在某些實(shí)施方案中，來自所述植物表面與包含所述植物處理劑的溶液接觸時(shí)以及移除時(shí)的持續(xù)時(shí)間不大于約5秒、30秒、一分鐘、五分鐘、十分鐘、20分鐘、30分鐘、45分鐘、1小時(shí)、1.5小時(shí)、2小時(shí)、2.5小時(shí)、3小時(shí)或更長時(shí)間。在某些實(shí)施方案中，來自所述植物表面與包含所述植物處理劑的溶液接觸時(shí)以及移除時(shí)的持續(xù)時(shí)間為約一秒、5秒、30秒、一分鐘、五分鐘、十分鐘、20分鐘、30分鐘、45分鐘、1小時(shí)、1.5小時(shí)、2小時(shí)或2.5小時(shí)中的任一個(gè)至約5秒、30秒、一分鐘、五分鐘、十分鐘、20分鐘、30分鐘、45分鐘、1小時(shí)、1.5小時(shí)、2小時(shí)、2.5小時(shí)或3小時(shí)。

與植物處理劑接觸的植物的表面的量可根據(jù)例如使所述植物表面與所述植物處理劑接觸的方法和/或根據(jù)例如所用的所述植物處理劑的量(諸如體積)而變化。例如，植物處理劑可通常在整個(gè)植物表面上或僅在某些部分上噴灑或噴霧。

如果使用液體處理液，那么向容器中添加的植物處理劑的量越大，越容易確保充分接觸容器中所處理的植物，直至所述植物基本上完全浸沒和/或它們開始漂浮到所述液體的表面。此外，向離心容器中添加另外的植物，處理劑可用的容器的容量將減少，因此減少接觸各植物上的所需表面所需的處理劑的量。而且，如果諸如通過震動(dòng)或翻轉(zhuǎn)來攪動(dòng)含有植物和植物處理劑的容器以使所述植物處理劑分布于整個(gè)容器中，那么通常將與所述植物處理劑接觸的所述植物的表面區(qū)域越大。

在某些實(shí)施方案中，所述植物為具有當(dāng)展開時(shí)形成萼(cup)或輪生體(whorl)的葉的玉米幼苗。展開的葉片的底部處的這個(gè)區(qū)域能夠保持液體。在某些實(shí)施方案中，包含植物處理劑的溶液與玉米植物接觸，而不考慮液體是置于萼中或置于輪生體中。在某些實(shí)施方案中，其中包含植物處理劑的溶液包含于萼或輪生體內(nèi)，玉米植物的另外表面區(qū)域也與包含植物處理劑的溶液接觸。在某些實(shí)施方案中，也與包含植物處理劑的溶液接觸的玉米植物的另外的表面區(qū)域比萼/輪生體中接觸的表面區(qū)域多約1％、2％、3％、4％或5％。在某些實(shí)施方案中，在離心力施加之前，至少一部分的植物的表面與包含植物處理劑的溶液接觸，但是沒有溶液置于展開的葉片的底部處形成的萼/輪生體中，換言之，所述萼/輪生體沒有溶液。

離心處理

本發(fā)明的某些實(shí)施方案采用“連續(xù)離心”，所述連續(xù)離心包括連續(xù)進(jìn)行的多于一次的離心，并且可包括至少一次非浸沒性離心和/或一次浸沒性離心。在連續(xù)離心期間，使植物在第一離心施加之后進(jìn)行至少一次另外的離心。連續(xù)離心可包括在離心之前、之后或之間具有不同步驟的以任何順序進(jìn)行的任何類型的多次離心。連續(xù)離心可在至少一次離心處理期間產(chǎn)生的加速力的施加期間結(jié)合PCS的使用。“雙重離心”是一種類型的連續(xù)離心，其包括連續(xù)或在不同時(shí)間進(jìn)行的兩次離心。在某些實(shí)施方案中，連續(xù)離心包括第一浸沒性旋轉(zhuǎn)，隨后進(jìn)行非浸沒性旋轉(zhuǎn)。

在某些實(shí)施方案中，向靶向組織在離心力施加期間浸沒于儲(chǔ)備處理劑中的植物施加離心力。在某些實(shí)施方案中，在離心力施加期間，至少1％的總植物表面與包含植物處理劑的溶液接觸。在某些實(shí)施方案中，在離心力施加期間，至少約1％，或至少約2％，或至少約3％，或至少約5％，或至少約10％，或至少約20％，或至少約30％，或至少約40％，或至少約50％，或至少約60％，或至少約70％，或至少約80％，或至少約90％，或至少約95％，或至少約98％，或至少約99％或100％的植物表面與包含植物處理液的溶液接觸。

在某些實(shí)施方案中，在后續(xù)離心力施加之前和/或期間，包含植物處理劑的溶液從所述植物的表面移除或基本移除，以便少于約5％、少于約4％、少于約3％、少于約2％或少于約1％的植物表面到后續(xù)離心力施加結(jié)束時(shí)保持與所述溶液接觸。

在作為連續(xù)離心的一部分的離心期間向植物施加的離心力可為本領(lǐng)域已知的任何離心力。在某些實(shí)施方案中，至少一種離心處理的離心參數(shù)與本文其他地方描述的那些離心參數(shù)(諸如，如本文其他地方所述的浸沒性離心或非浸沒性離心或連續(xù)離心的離心參數(shù))一致。這些離心參數(shù)包括非浸沒性旋轉(zhuǎn)期間的10g-4000g之間和/或浸沒性旋轉(zhuǎn)期間的10g-500g之間的離心力范圍，并且向植物施加的離心力的持續(xù)時(shí)間可包括約一秒至約180分鐘的范圍。

第一離心處理之后，植物可進(jìn)行后續(xù)或連續(xù)處理或諸如用水沖洗，以便去除任何剩余的植物處理液，然后通過移植于生長培養(yǎng)基中來恢復(fù)，并且在受保護(hù)的環(huán)境(例如，溫室、遮陰棚、生長室或生長箱、組織培養(yǎng)室等)中照管，或者直接移植到大田。

植物離心支持體

在某些實(shí)施方案中，結(jié)構(gòu)支持與植物在離心時(shí)包含于離心容器內(nèi)。在某些實(shí)施方案中，植物離心支持體(PCS)相對(duì)于由離心產(chǎn)生的加速力維持期望的靶向組織定向，以便接觸植物的處理劑中的至少一些部分轉(zhuǎn)移到選定組織和/或被離心期間產(chǎn)生的加速力推動(dòng)到選定組織中，即以便“適當(dāng)?shù)貙?duì)齊”靶組織和/或植物。在某些實(shí)施方案中，PCS在離心期間支持植物的至少一些部分，以便靶組織的細(xì)胞不接觸儲(chǔ)備處理劑。在某些實(shí)施方案中，PCS消除或減輕離心力施加期間所引起的對(duì)植物的細(xì)胞、組織或器官損傷，雖然這不一定總是需要，因?yàn)橛脩艨赡馨l(fā)現(xiàn)恢復(fù)含有離心期間成功地遞送處理劑的細(xì)胞或組織的受損植物方面的效用。

在某些實(shí)施方案中，PCS固定到離心容器內(nèi)部，不論是其為可移動(dòng)地可連接插入，還是其成型或裝配到離心容器中或以其他方式長久地附著到離心容器。在某些實(shí)施方案中，PCS包括可附著到植物莖的至少一個(gè)棒、桿、棱或鰭狀物。在一些實(shí)施方案中，PCS包括可附著到至少一株植物諸如植物幼苗的至少一個(gè)大約1/8”直徑棒。在一些實(shí)施方案中，多于一株植物與(諸如附著到)PCS結(jié)合。圖5示出PCS的一個(gè)實(shí)例。在一些實(shí)施方案中，多于一株植物附著到PCS，不論每株植物單獨(dú)固定到共同PCS的不同部分(如圖8所示)，或者不論多于一株植物附著到共同PCS的相同部分(如圖6所示)。

在某些實(shí)施方案中，PCS包括大約1/8”直徑木制棒。在某些實(shí)施方案中，PCS大約為待離心的植物的長度。在某些實(shí)施方案中，PCS的這種長度包括植物的長度加上仍然附著到幼苗的種子的長度或?qū)挾取?/p>

在某些實(shí)施方案中，包括棒的PCS設(shè)定在離心樣品容器中，所述棒的一個(gè)末端、尖端或突出物倚靠離心樣品容器的內(nèi)壁，以便所述棒的一些部分延伸至或橫跨離心樣品容器的內(nèi)部。圖5-9示出這種的各種示例性實(shí)施方案。

在某些實(shí)施方案中，植物莖的基本區(qū)域諸如至少約5％、10％、20％、25％、30％、40％、50％、60％、70％、75％、80％、90％、95％、98％、99％或100％由所述植物結(jié)合(例如附著到或固定)的PCS的一側(cè)支持，并且PCS設(shè)定到離心樣品容器中，以便當(dāng)植物離心時(shí)，PCS保持植物莖的長軸與由離心所引起的加速度平行。在某些實(shí)施方案中，所述長軸為植物的根莖軸(root-shoot axis)。在某些實(shí)施方案中，至少一株植物與(諸如附著到)至少一個(gè)PCS結(jié)合，并且將植物-PCS組合離心。在某些實(shí)施方案中，PCS接觸其支持的每株植物。在某些實(shí)施方案中，PCS向其接觸的植物提供充分的支持，以至于接觸PCS的植物能夠向不接觸PCS的其他附近植物提供充分的支持，以便在離心期間充分地支持甚至不與PCS直接接觸的植物以滿足本文其他地方描述的非浸沒性離心的要求。

如本文所提供的，PCS可包括足夠堅(jiān)固以便防止靶組織在離心期間接觸儲(chǔ)備處理劑和/或以便在離心期間維持期望的靶組織對(duì)齊的任何材料。在某些實(shí)施方案中，PCS還防止對(duì)植物的致命損傷，所述對(duì)植物的致命損傷否則將由在離心期間塌縮、折疊、撕裂、剪切或折斷植物器官和/或組織引起。相似地，植物可以任何形式與PCS結(jié)合，只要植物-PCS組合向所述植物提供充分的結(jié)構(gòu)支持，以便防止靶組織在離心期間接觸儲(chǔ)備處理劑和/或以便在離心期間維持期望的靶組織對(duì)齊。在某些實(shí)施方案中，PCS還可防止離心期間產(chǎn)生的加速力將植物器官或組織損傷而無法恢復(fù)。

在某些實(shí)施方案中，PCS至少與其所結(jié)合的植物的莖一樣長。在某些實(shí)施方案中，PCS的長度還取決于種子是否仍附著到幼苗。在某些實(shí)施方案中，幼苗的莖沿著包括大約與幼苗一樣長或更長的木制棒的PCS的長度附著。在某些實(shí)施方案中，植物莖附著到具有套的PCS，所述套包括柔性材料，諸如塑料石蠟、塑料套、鋁箔或用來非破壞性地和可移動(dòng)地使一個(gè)物品附著到另一個(gè)的任何其他材料，包括繩圈、金屬線、橡皮筋等。設(shè)想了使植物結(jié)合、附著或固定到PCS的其他形式，只要PCS和植物的組合向所述植物的表面提供充分的磨擦，以便防止靶組織在離心力施加期間變得浸沒于儲(chǔ)備處理劑中，和/或只要PCS和植物的組合維持靶組織對(duì)齊，以便在離心力施加期間將至少一些處理劑推向與靶組織的至少一個(gè)細(xì)胞接觸。

在某些實(shí)施方案中，例如當(dāng)植物單獨(dú)纏繞到單個(gè)PCS時(shí)，在植物和PCS之間直接產(chǎn)生了在離心期間將植物保持在適當(dāng)位置的摩擦力。在某些實(shí)施方案中，PCS與植物的結(jié)合可以是直接的，諸如其中將所述植物保持在適當(dāng)位置的摩擦力在捆扎在一起的至少兩株植物之間發(fā)生。在某些實(shí)施方案中，這種捆扎足夠緊，以便提供必需的摩擦力來防止靶組織在離心力施加期間變得浸沒于儲(chǔ)備處理劑中和/或維持靶組織對(duì)齊，以便在離心力施加期間將至少一些靶藥劑推向與靶組織的至少一個(gè)細(xì)胞接觸。

在某些實(shí)施方案中，PCS可為填充植物周圍的空間的支持泡沫，以便所述PCS提供防止靶組織在離心力施加期間變得浸沒于儲(chǔ)備處理劑中所需的摩擦力和/或提供維持靶組織對(duì)齊所需的摩擦力，以便在離心力施加期間將至少一些靶藥劑推向與靶組織的至少一個(gè)細(xì)胞接觸。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，包括泡沫的PCS還將防止植物在離心期間遭受致命損傷。滿足本文先前提到的PCS的一般說明的任何其他類型的支持性和/或粘著性基質(zhì)均可與本發(fā)明結(jié)合使用。

在某些實(shí)施方案中，PCS與一批捆扎在一起的許多植物結(jié)合，并且被套圍繞，所述套在此實(shí)施方案中也是PCS的部件，其幫助提供PCS實(shí)現(xiàn)自身功能(例如，套-棒PCS系統(tǒng))所需的摩擦力。在某些實(shí)施方案中，棒用植物來纏繞以便進(jìn)一步提高套-桿PCS系統(tǒng)的性能。圖9示出PCS系統(tǒng)的示例性實(shí)施方案。

這些方法不限于離心期間任何特定的靶組織的對(duì)齊或植物的對(duì)齊。在某些實(shí)施方案中，不同組織需要相對(duì)于離心期間產(chǎn)生的加速力的不同的靶組織定向和或不同的植物體定向。例如，如果靶向組織為SAM，那么PCS可用來防止SAM在離心力施加期間變得浸沒或接觸儲(chǔ)備處理劑。PCS還可用來確保在離心開始時(shí)將接觸SAM或圍繞SAM的組織(例如，葉原基和/或圍繞SAM的老葉)的至少一些處理劑推入SAM的至少一個(gè)細(xì)胞中。

例如，本文描述了向玉米SAM遞送處理劑的方法。在本文實(shí)例所示，植物排列在Beckman Coulter Allegra X-14系列離心機(jī)中，以便PCS將保持植物的莖根軸植物與由離心產(chǎn)生的加速力以及離心機(jī)中心最近的植物的SAM端和離離心機(jī)中心最遠(yuǎn)的植物的根端平行。以此方式，在離心期間，離心期間產(chǎn)生的加速力將把在SAM表面附近或SAM表面處的一些處理劑推入SAM的至少一個(gè)細(xì)胞中。

在靶向SAM組織的非浸沒性離心的某些實(shí)施方案中，幾打單倍體幼苗一起捆扎在包括套和棒的PCS中，并且基本上以相同的定向?qū)R，所述定向與圖9所示的定向相似。然后植物與加倍劑(例如，秋水仙素)溶液接觸幾分鐘，然后置于離心容器中并離心，以便SAM不接觸儲(chǔ)備加倍劑，然而在離心開始時(shí)接觸植物的一些加倍劑在離心力施加期間推入SAM的至少一個(gè)細(xì)胞中，從而向植物的SAM內(nèi)的細(xì)胞遞送加倍劑。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，束PCS還防止由離心期間產(chǎn)生的加速力引起的對(duì)植物的致命損傷。在一些實(shí)施方案中，PCS可包括套或墊(matt)，只要所述套或墊用作本文描述的PCS的功能。

PCS可與基本上任何離心處理結(jié)合使用，不管其是否執(zhí)行以上所述的功能。例如，用戶可選擇在浸沒性旋轉(zhuǎn)期間使用PCS，即使在那種情況下PCS不防止靶組織浸沒于儲(chǔ)備液中，并且即使在浸沒性離心期間靶組織的對(duì)齊并不必要。在某些實(shí)施方案中，在浸沒性離心期間使用PCS以對(duì)齊植物和/或靶向組織，并且能夠更有效地向靶向植物組織遞送處理液。在某些實(shí)施方案中，在浸沒性離心期間使用PCS以在離心期間保持靶組織浸沒于儲(chǔ)備處理劑中，同時(shí)使剩余的或基本上剩余的植物體保持在所述儲(chǔ)備處理劑之外。在某些實(shí)施方案中，在浸沒性離心期間使用PCS，因?yàn)槠涫闺x心之前或之后或者后續(xù)離心之前或之后的植物處理更簡(jiǎn)單或更有效。

提高加倍效率

本文提供的方法可用來幫助向選定單倍體植物組織遞送包含染色體加倍劑的植物處理劑，因此提高加倍效率。

“加倍效率”(DE)是通過產(chǎn)生DH₁種子的指定的DH₀植物的數(shù)目除以進(jìn)行染色體加倍處理的那個(gè)指定的DH₀植物的總數(shù)來計(jì)算的DH成功的總體規(guī)范。

如本文所用，進(jìn)行染色體加倍處理的單倍體植物諸如單倍體幼苗被稱為DH₀植物。成功加倍的DH₀植物可產(chǎn)生單倍體卵子和/或精子，并且如果DH₀植物成功地自交，那么合子染色體數(shù)目可在具有2n孢子體的預(yù)期活力和生育力的基本上純合型后代(在本文稱為DH₁植物)中恢復(fù)。

某些實(shí)施方案提供獲得雙單倍體玉米胚的方法，所述方法包括：進(jìn)行向植物組織遞送植物處理劑的任何前述方法，其中所述植物為單倍體植物，并且其中所述處理劑為染色體加倍劑，并且其中所述加倍劑誘導(dǎo)至少一種雙單倍體植物的形成。本文還提供獲得雙單倍體植物的方法，所述方法包括：從由本文描述的方法獲得的種子中收獲雙單倍體胚。在某些實(shí)施方案中，當(dāng)從種子中收獲胚時(shí)，種子附著到玉米穗。在其他實(shí)施方案中，當(dāng)收獲胚時(shí)，種子未附著到玉米穗。某些實(shí)施方案還提供向雙單倍體胚供應(yīng)充分的營養(yǎng)物，以便允許雙單倍體胚發(fā)育成雙單倍體植物。

某些實(shí)施方案還提供獲得雙單倍體玉米植物的方法，所述方法包括：獲得通過本文提供的任何方法產(chǎn)生的雙單倍體玉米胚，并且向所述胚供應(yīng)充足的營養(yǎng)物以允許所述胚發(fā)育成雙單倍體玉米植物種子。雙單倍體玉米胚可通過包括以下的方法來產(chǎn)生：進(jìn)行向莖尖分生組織中遞送包含植物處理劑的溶液的任何前述方法，其中所述植物處理劑為染色體加倍劑，并且允許加倍劑誘導(dǎo)染色體加倍。

還提供獲得包含雙單倍體玉米胚的種子的方法，所述方法包括：收獲包含由獲得雙單倍體玉米胚的方法獲得的雙單倍體胚的種子。雙單倍體玉米胚可通過包括以下的方法來獲得：進(jìn)行向植物組織遞送植物處理劑的任何前述方法，其中胚處理劑為染色體加倍劑，并且允許加倍劑誘導(dǎo)在至少一個(gè)種子中形成至少一種雙單倍體胚。在某些實(shí)施方案中，收獲的種子為生理上成熟的種子。

還提供獲得雙單倍體玉米植物的方法，所述方法包括：播種包含由獲得包含雙單倍體玉米胚的種子的方法獲得的包含雙單倍體玉米胚的種子，并且允許播種的種子發(fā)育成雙單倍體玉米植物。在某些實(shí)施方案中，包含雙單倍體玉米胚的種子獲自第三方。換言之，收獲種子的團(tuán)體不一定是播種包含雙單倍體胚的種子并且允許播種的種子發(fā)育成雙單倍體玉米植物的團(tuán)體。

另外的定義和描述

“植物群體(population of plant)”或“植物群體(plant population)”意指包括任何數(shù)目(包括一個(gè))的個(gè)體、物體或數(shù)據(jù)的集合，從個(gè)體、物體或數(shù)據(jù)中采集樣品以進(jìn)行評(píng)估，例如，估計(jì)QTL效應(yīng)。最常見地，所述術(shù)語涉及育種植物群體，成員選自所述育種植物群體并且雜交以在育種程序中產(chǎn)生后代。植物群體可包括單個(gè)育種雜交或多個(gè)育種雜交的后代，并且可為實(shí)際的植物或植物來源的材料或植物的計(jì)算機(jī)模擬表示。群體成員不必與選擇用于后續(xù)周期的分析的群體成員或經(jīng)最終選自以獲得最后后代植物的那些群體成員相同。常常，植物群體來源于單個(gè)雙親雜交，但是還可來源于相同或不同親本間的兩種或更多種雜交。雖然植物群體可包括任何數(shù)目的個(gè)體，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到，植物育種人員通常使用范圍為一百個(gè)或兩百個(gè)個(gè)體至幾千個(gè)的群體大小，并且最高表現(xiàn)的5％-10％的群體是通常選擇來用于后續(xù)雜交以便提高群體后續(xù)代的性能的群體。

如本文所用，“培養(yǎng)”描述了促進(jìn)或改善植物在其生命周期中任何點(diǎn)(包括萌發(fā))處的生長的任何活動(dòng)。“照管”在本文與培養(yǎng)同義使用，例如在溫室中照管植物等同于在溫室中培養(yǎng)植物。

如本文所用的“生長培養(yǎng)基”包括能夠支持植物發(fā)育的任何基質(zhì)，包括盆栽土、田間土壤和實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)基，包括但不限于N6或基于MS的植物組織培養(yǎng)基。

如本文所用，“萌發(fā)”描述了在根(root radical)首次從種皮中出現(xiàn)時(shí)開始的植物生命周期中的一個(gè)點(diǎn)。這個(gè)時(shí)期可與被認(rèn)為是“發(fā)芽”的時(shí)間段重疊，在所述發(fā)芽期間種子開始發(fā)出芽。

以下公開的實(shí)施例僅僅是可以另外的形式體現(xiàn)的本發(fā)明的代表。因此，本文公開的特定結(jié)構(gòu)細(xì)節(jié)、功能細(xì)節(jié)和程序細(xì)節(jié)將不被理解為限制性的。

實(shí)施例

本文使用的單倍體玉米植物通過用來自單倍體誘導(dǎo)系的花粉對(duì)F1或F2玉米植物進(jìn)行授粉來獲得。將穗在種子成熟時(shí)收獲、去殼，并且將單倍體種子通過本領(lǐng)域的標(biāo)準(zhǔn)方法來恢復(fù)。

可用來重復(fù)以下實(shí)驗(yàn)的單倍體誘導(dǎo)系的非限制性實(shí)例包括Stock 6(Coe 1959)、RWS(Rober等1005)、KEMS(Deimling等1997)、KMS或ZMS(Chalyk等3994；Chalyk和Chebotar 1000)，或來源于這些單倍體誘導(dǎo)系的其他誘導(dǎo)系。所述誘導(dǎo)系還可攜帶至少一種標(biāo)記性狀以有助于鑒別單倍體后代。單倍體庫(haploid pool)的純度可制成95％或更大，并且可使用本領(lǐng)域已知的各種方法來驗(yàn)證。

實(shí)施例1.用植物處理劑秋水仙素進(jìn)行的單次非浸沒性旋轉(zhuǎn)成功地提高加倍效率。

四個(gè)不同的玉米F1雜種來源的單倍體誘導(dǎo)群體的玉米種子用于此實(shí)驗(yàn)；群體中的兩個(gè)，雄性1和雄性2，來源于兩個(gè)不同的雄性近交系，并且剩余的兩個(gè)群體，雌性1和雌性2來源于兩個(gè)不同的雌性近交系。使每個(gè)種質(zhì)的種子在土壤中萌發(fā)，并且在溫室中在標(biāo)準(zhǔn)玉米生長條件下照管后續(xù)的幼苗，直至幼苗達(dá)到V1至V2生長期。

接著，然后將若干隨機(jī)選擇的每個(gè)種質(zhì)的幼苗從土壤中移除、洗滌以去除殘留的土壤，然后經(jīng)受接觸步驟，所述接觸步驟包括將幼苗在包含1250ppm秋水仙素的液體加倍劑中浸泡10分鐘。

在接觸步驟之后，將幼苗捆扎在具有木制棒的PCS中，所述PCS與圖9中描述的PCS相似。將幼苗和棒用幾層鋁箔緊緊地纏繞在一起。注意將幼苗纏緊，但不能太緊以致于損傷幼苗的組織。將套的折疊和層排列成使得仍然依附到植物的表面的任何液體藥劑在離心期間不會(huì)陷入套內(nèi)。

一旦排列于離心機(jī)中，幼苗就經(jīng)受在335g下非浸沒性離心3min。

離心后，將幼苗從離心容器中移除，用水沖洗以去除任何剩余的植物處理劑，然后移植到生長室內(nèi)的10英寸盆中，在所述生長室內(nèi)將所述幼苗在標(biāo)準(zhǔn)玉米生長條件下照管，直至它們生長至成熟并開花。

嘗試用從處理中存活的每株植物進(jìn)行自花授粉以產(chǎn)生花粉，并且在隨后的生長期間，確定每個(gè)樣品中的授粉成功、受精成功和最終加倍效率。

來自每個(gè)種質(zhì)的若干隨機(jī)選擇的幼苗的對(duì)照樣品未接受暴露至植物處理劑，但是如同它們的處理過的對(duì)應(yīng)物那樣以其他方式同一地操作。

表1示出未能產(chǎn)生花粉的所有對(duì)照植物。因此，它們不能自交或產(chǎn)生自交種子，因此產(chǎn)生的DE為零。另一方面，接受非浸沒性離心處理的樣品展現(xiàn)出良好的總體結(jié)實(shí)(seed set)以及42％至71％范圍的平均群體DE，取決于種質(zhì)。

表1.當(dāng)不同的單倍體玉米種質(zhì)經(jīng)受單次非浸沒性離心時(shí)對(duì)DH成功的影響。授粉成功為產(chǎn)生絲和花粉并且因此能自交的植物的數(shù)目；受精成功為產(chǎn)生具有至少一粒種子的穗的加倍處理過的單倍體植物的數(shù)目。DE為加倍效率，等于受精成功除以每個(gè)種質(zhì)和處理中處理的植物的數(shù)目。

此實(shí)施例證明，在各式各樣的玉米種質(zhì)中，與當(dāng)前方法相比，這些方法將加倍劑有效地遞送至植物分生組織，并且增加加倍效率。在某些實(shí)施方案中，可將其他植物處理劑遞送至另外的玉米種質(zhì)和除了玉米之外的物種中的各式各樣的可替代組織。無論何時(shí)期望向特定植物組織遞送化學(xué)藥劑，特別是如果因?yàn)榻M織是內(nèi)部的或者由其他組織覆蓋和/或保護(hù)而難以到達(dá)(像莖分生組織)，那么這些方法比起使用當(dāng)前方法的那些方法將提供更多成功。

秋水仙堿是有毒的，因此在此實(shí)施例中選擇10min浸泡以進(jìn)行接觸步驟，并且它顯示了DE的顯著差異。應(yīng)當(dāng)理解，根據(jù)植物年齡、離心速度、秋水仙素濃度和/或其他參數(shù)，在其他條件下，可將包括更長或更短持續(xù)時(shí)間的接觸步驟優(yōu)化以實(shí)現(xiàn)期望的結(jié)果。

實(shí)施例2.用植物處理劑秋水仙素進(jìn)行的單次浸沒性離心成功地提高加倍效率。

5種不同的F1雜種來源的單倍體商業(yè)玉米株系的種子經(jīng)隨機(jī)選擇，并且在溫室中萌發(fā)。將所得的幼苗在V1-V2生長期時(shí)從土壤或生長培養(yǎng)基中移除，并且將土壤或生長培養(yǎng)基用水從植物中沖洗掉。將每個(gè)單倍體株系內(nèi)的幾個(gè)隨機(jī)幼苗的一個(gè)樣品置于離心樣品容器中，而不考慮植物的莖根軸相對(duì)于在計(jì)劃的離心期間產(chǎn)生的加速力將如何定向。接著，將包含1000ppm秋水仙素的植物處理液倒入容器中，以便溶液浸沒每個(gè)植物SAM，然后在SAM浸沒于植物處理劑中的情況下將樣品在50g下離心10min。

離心后，將植物移除、用水沖洗以去除任何剩余的秋水仙素溶液，然后在光、濕度和溫度受控的溫室中恢復(fù)并照管幾天，之后移植到苗圃溫室。

對(duì)照樣品不接受離心或秋水仙素暴露，但是如同處理樣品那樣以其他方式同一地操作。在植物的后續(xù)生長期間，確定每個(gè)樣品中的最初存活、授粉成功、受精成功和加倍效率(DE)。

在離心期間經(jīng)受與植物處理劑的接觸的每個(gè)近交系與它們的對(duì)應(yīng)的未處理對(duì)照相比，顯示授粉成功、受精成功和DE的較大提高(表2)。與其對(duì)照相比，在離心樣品中總平均DE提高25％，而最初存活僅下降15％。還注意到，對(duì)于每個(gè)樣品，最初存活等于最終存活，并且雖然接受實(shí)驗(yàn)處理的近交樣品中至少25％的所有個(gè)體均產(chǎn)生花粉和絲，但是在接受對(duì)照處理時(shí)那些相同的5個(gè)近交樣品中的3個(gè)具有0％授粉成功。

表2.使不同單倍體基因型經(jīng)受單次浸沒性離心的結(jié)果。授粉成功為產(chǎn)生絲和花粉并且因此能自交的植物的數(shù)目；受精成功為產(chǎn)生具有至少一粒種子的穗的加倍處理過的單倍體植物的數(shù)目。DE為加倍效率，等于受精成功除以每個(gè)種質(zhì)和處理中處理的植物的數(shù)目。

這些數(shù)據(jù)顯示單次浸沒性離心處理將植物處理劑有效地遞送至植物組織。在此情況下，加倍劑被有效地遞送至單倍體植物的分生組織，具有顯著提高那些植物的加倍效率的效果，而對(duì)植物存活具有極少影響。

實(shí)施例3.連續(xù)離心處理成功地提高加倍效率。

5種不同的F1雜種來源的單倍體玉米株系的種子經(jīng)隨機(jī)選擇，并且在溫室中萌發(fā)。將所得的幼苗在V1-V3生長期時(shí)從土壤或生長培養(yǎng)基中移除，并且將土壤或生長培養(yǎng)基用水從植物中沖洗掉。然后將幼苗對(duì)齊，并且連同類似于圖9示出的內(nèi)容的于捆扎的PCS中的幾根棒一起組裝，并且將包含1000ppm秋水仙素的植物處理液倒入容器中，以便溶液浸沒每株植物的SAM，然后將整個(gè)樣品在50g下離心3min，同時(shí)SAM保持浸沒于植物處理劑中。

在第一離心之后，將植物處理液傾出，并且使幼苗經(jīng)受在335g下的非浸沒性離心3min。在第二離心期間，將PCS和幼苗對(duì)齊，以便每株植物的SAM在施加離心力期間不接觸儲(chǔ)備處理劑。

在第二離心之后，將植物從離心容器中移除，并且用水沖洗以去除任何剩余的秋水仙素溶液，然后在光、濕度和溫度受控的溫室中恢復(fù)并照管幾天，之后移植到苗圃溫室。

對(duì)照樣品不接受秋水仙素暴露，但是如同實(shí)驗(yàn)樣品那樣以其他方式同一地操作。在植物的后續(xù)生長期間，確定如實(shí)施例2所述的每個(gè)樣品中的最初存活、授粉成功、受精成功、最終存活和加倍效率。

經(jīng)受連續(xù)離心的所有五種基因型與它們的對(duì)應(yīng)的未處理對(duì)照相比均顯示顯著提高的授粉成功、受精成功和加倍效率，沒有最初存活的增加(表3)。對(duì)于每個(gè)樣品，最初存活等于最終存活。觀測(cè)到，與對(duì)照相比，接受實(shí)驗(yàn)處理的樣品中的總體DE增加67％。此外，雖然接受實(shí)驗(yàn)處理的近交樣品中至少62％的所有個(gè)體均產(chǎn)生花粉和絲，但是在接受對(duì)照處理時(shí)那些相同的5個(gè)近交樣品中的3個(gè)產(chǎn)生0％授粉成功。

表3.使不同單倍體基因型經(jīng)受第一浸沒性離心、隨后經(jīng)受第二非浸沒性離心的結(jié)果。授粉成功為產(chǎn)生絲和花粉并且因此能自交的植物的數(shù)目；受精成功為產(chǎn)生具有至少一粒種子的穗的加倍處理過的單倍體植物的數(shù)目。DE為加倍效率，等于受精成功除以每個(gè)種質(zhì)和處理中處理的植物的數(shù)目。

這些數(shù)據(jù)顯示連續(xù)離心處理將植物處理劑有效地遞送至植物組織。在此情況下，加倍劑被有效地遞送至單倍體植物的分生組織，具有顯著提高那些植物的加倍效率的效果，而對(duì)存活基本無影響。

實(shí)施例4.其他植物處理劑。

為證明離心幫助向植物組織遞送植物處理劑的能力，將呈商業(yè)混合形式的植物生長調(diào)節(jié)劑烯效唑(赤霉酸抑制劑)(0.055％烯效唑)混合于植物處理液中，并且與經(jīng)受離心的植物接觸。

處于V1-3生長期的F1來源的單倍體玉米植物的三個(gè)樣品各自經(jīng)受在50g下的單次浸沒性離心10min，期間每株植物的SAM保持與包含以下物質(zhì)的儲(chǔ)備處理劑接觸：a)不含Sumagic的非活性植物處理液(對(duì)照)、b)含有另外1％(體積:體積)Sumagic的植物處理液或c)含有另外2％Sumagic的植物處理液。

離心后，將植物移除、用水沖洗以去除任何剩余的植物處理劑，然后在光、濕度和溫度受控的溫室中恢復(fù)并照管幾天，之后移植到苗圃溫室。在生長三周之后，可視地評(píng)估每株植物從其各自的處理中存活的能力。圖1示出從三個(gè)處理中的每個(gè)中恢復(fù)的植物的示例性代表。

圖1示出，與1％或2％Sumagic接觸時(shí)離心的樣品更矮，展現(xiàn)出顏色更暗的更大葉片，展現(xiàn)出更粗的莖，并且展現(xiàn)出更多的根生物量。這不但表明這些方法提供除了加倍劑之外的植物處理劑至植物組織的有效遞送的能力，而且表明處理液中生長調(diào)節(jié)劑的添加可改善植物健康。

實(shí)施例5.植物在大田環(huán)境中顯示驚人的生存性

將來源于商業(yè)近交01DKD2與誘導(dǎo)系KHI1之間或商業(yè)近交83IDI1與KHI1之間的雜交的單倍體玉米幼苗通過單次旋轉(zhuǎn)或連續(xù)旋轉(zhuǎn)離心方法處理，并且在光、濕度和溫度受控的環(huán)境中恢復(fù)大約15小時(shí)。然后將植物移植到大田中并且照管三周，三周之后評(píng)估植物存活率(表5)。

表5.兩個(gè)近交來源的單倍體株系在與具有不同秋水仙素濃度的三種不同處理液組合的單次浸沒性或連續(xù)旋轉(zhuǎn)離心處理之后的大田移植存活率。

表5示出，來源于兩個(gè)遺傳趨異的近交的單倍體玉米株系當(dāng)在處理之后移植到大田環(huán)境中時(shí)展示了極好的存活率。移植后3周，不管秋水仙素濃度或是否施加第二旋轉(zhuǎn)，任一單倍體株系的存活率均高于80％。

實(shí)施例6.植物可從強(qiáng)離心力、隨后的大田移植中存活

使來自幾個(gè)不同F(xiàn)1雜種來源的單倍體誘導(dǎo)群體的單倍體幼苗在溫室中生長到V1-V2期，在V1-V2期時(shí)將它們從土壤中移除、用水沖洗以去除殘留土壤、分成具有相等數(shù)目植物的兩份樣品，然后將各樣品連同幾根棒一起捆扎成兩個(gè)與圖9示出的PCS相似的PCS。然后使植物經(jīng)受在50g下的浸沒性離心3min，同時(shí)SAM保持浸沒于處理劑中。

在第一浸沒性離心之后，使幼苗經(jīng)受在335g下的更慢和更短的非浸沒性離心3min，并且使另一份樣品經(jīng)受在500g下的更快和更久的非浸沒性離心10min。

離心后，將所有幼苗從離心容器中移除，用水沖洗以去除任何剩余的植物處理劑，然后移植到戶外的玉米田，在所述戶外的玉米田中將所述幼苗在標(biāo)準(zhǔn)玉米生長條件下照管，直至它們生長至成熟并開花。嘗試用從處理中存活良好足以產(chǎn)生花粉和絲的每株植物進(jìn)行自花授粉，并且在確保生長期間，記錄每個(gè)穗上和每個(gè)植物上形成的粒的數(shù)目。將經(jīng)受相同處理的所有幼苗的存活率在所有種質(zhì)中組合，并且平均化以產(chǎn)生每個(gè)處理中的總體存活率。相似地，將所有種質(zhì)中的加倍效率組合并且平均化以產(chǎn)生每個(gè)處理中的總體DE。

表6示出，經(jīng)受兩次離心處理的植物在移植到大田環(huán)境之后產(chǎn)生良好的存活率和加倍效率。

表6.經(jīng)受作為總體連續(xù)離心處理的一部分的兩種不同非浸沒性離心處理中的一種的不同種質(zhì)的近交中的平均存活率和加倍效率。

此實(shí)施例證明，甚至當(dāng)在處理之后將植物直接移植到大田時(shí)，用戶可獲得向靶向組織進(jìn)行的處理劑的極好遞送(如高DE所證實(shí)的那樣)以及極好的存活率。此外，證明了與本文其他實(shí)施例相比基本上增加離心的持續(xù)時(shí)間和速度對(duì)存活率和加倍效率幾乎沒有影響，其中離心處理通常在335g下進(jìn)行3min。因此，所預(yù)料的是，其他離心持續(xù)時(shí)間和時(shí)間將用于各式各樣的離心參數(shù)和處理后植物恢復(fù)方法(例如，直接的大田移植vs.生長箱等)中。

實(shí)施例7.處理劑的遞送以及良好存活在寬泛的植物生長期范圍內(nèi)是可能的。

為證明這些方法如何可用于寬泛的植物生長期范圍內(nèi)，使單倍體植物經(jīng)受相同的連續(xù)離心處理，所述連續(xù)離心處理包括第一浸沒性離心、隨后是第二非浸沒性離心。比較三個(gè)不同的生長期和對(duì)三個(gè)生活期之間的DH相關(guān)的成功指標(biāo)的影響。

使來源于雌性近交系91DUQ1或雄性近交系83IDI1的F1雜種來源的單倍體幼苗在標(biāo)準(zhǔn)玉米生長條件中在溫室中的土壤中萌發(fā)。為確保老苗將擬合入到離心樣品容器中，并且為確保所有幼苗接受相同的化學(xué)處理，在種植后6天時(shí)使所有幼苗經(jīng)受1％多效唑(PBZ)土壤浸液處理，每株植物10ml。

將幼苗的這個(gè)群體細(xì)分成3份樣品，各自包含幾打幼苗。各樣品中的一半幼苗來源于91DUQ1，并且另一半來源于83IDI1。在V1-V2生長期(種植后1周)時(shí)將第一樣品從土壤中移除，在V3-V4期(種植后2周)時(shí)將第二樣品從土壤中移除，并且在V4-V5生長期(種植后3周)時(shí)將第三樣品從土壤中移除。

從土壤中移除之后，將各樣品中的幼苗在水中沖洗以去除殘留土壤，然后連同幾根木制棒一起纏繞于與圖9示出的PCS相似的PCS中，并且經(jīng)受在50g下在1250ppm秋水仙素中的第一浸沒性離心3min。

在第一浸沒性離心之后，將植物處理液傾出。將表面被依附了一些殘留藥劑的幼苗返回至空離心容器中，并且經(jīng)受在335g下的非浸沒性離心3min。

在第二離心之后，將植物從離心容器中移除，并且用水沖洗以去除任何剩余的秋水仙素溶液，然后在光、濕度和溫度受控的溫室中恢復(fù)并照管幾天，之后移植到苗圃溫室，在所述苗圃溫室中將植物在標(biāo)準(zhǔn)玉米生長條件下照管，直至它們生長至成熟并開花。

嘗試用從處理中存活的每株植物進(jìn)行自花授粉以產(chǎn)生花粉和絲，并且在隨后的生長期間，確定每個(gè)樣品中的授粉成功、受精成功和最終加倍效率。在此實(shí)驗(yàn)中，各生長期樣品中的加倍效率通過產(chǎn)生包含至少四個(gè)粒的至少一個(gè)穗的植物的數(shù)目除以所處理的植物的總數(shù)來計(jì)算。

圖4中的一個(gè)明顯趨勢(shì)是，在早期生活期時(shí)，處理的樣品傾向于展現(xiàn)出更高的授粉成功、受精成功和倍增效率。然而，應(yīng)當(dāng)指出，數(shù)據(jù)清楚地證明了使用這些方法對(duì)至少達(dá)到V4-V5的植物的效用，那樣此處的生長期樣品在評(píng)估的所有三個(gè)標(biāo)準(zhǔn)方面產(chǎn)生良好評(píng)分。尤其令人鼓舞的事實(shí)是，這個(gè)組的加倍效率平均為近30％、中位數(shù)為36.7％，表明這些方法也可用來向至少高達(dá)V6的較老植物遞送加倍劑。

圖4還清楚地表明，這些方法可用來向年齡比V1小得多的植物遞送加倍劑，因?yàn)閂1-V2樣品展現(xiàn)出超過70％的DE。所預(yù)期的是，向幼小植物中的靶向組織進(jìn)行有效藥劑遞送的這種趨勢(shì)可延伸至早在生命周期中的萌發(fā)首次開始時(shí)的時(shí)間點(diǎn)。這些數(shù)據(jù)還顯示，這些方法可通過采用本領(lǐng)域已知的用于將胚從萌發(fā)之前的種子中切除的方法(例如，胚拯救)或通過采用使用處理劑穿透種皮以促進(jìn)未萌發(fā)的植物與處理劑之間接觸的方法來用于甚至更幼小的植物上。

實(shí)施例8.植物可從很強(qiáng)的離心力中存活

使來源于雌性玉米近交系91DUQ1或雄性玉米近交系83IDI1的F1雜種來源的單倍體幼苗在標(biāo)準(zhǔn)玉米生長條件中在溫室中的土壤中萌發(fā)，并且生長至V1-V2生長期(種植后1周)。然后將幼苗從土壤中移除、沖洗以去除殘留土壤，并且劃分為各自包含幾打幼苗的5份樣品。

將一份樣品的植物連同幾根木制棒一起捆扎成與圖9示出的PCS相似的PCS。將這種捆扎的PCS樣品置于離心容器中，首先放置根。將其他四份樣品的每株植物用石蠟套單獨(dú)地纏繞到包括棒的PCS，并且置于單獨(dú)的離心容器中，類似于圖7示出的那樣，每個(gè)容器一個(gè)植物-PCS組件。

一旦附著到它們各自的PCS并置于它們各自的離心容器中，就將包含1250ppm秋水仙素的溶液添加到每個(gè)容器，直到將每株植物浸沒，至少持續(xù)直到將每株植物的SAM浸沒。然后在SAM浸沒于處理液中的情況下將所有樣品在50g下離心3min。

在第一離心之后，將處理液從各離心容器中排出，然后使各樣品以如表9所示的范圍為340g至2000g的六種不同速率中的一種經(jīng)受非浸沒性旋轉(zhuǎn)3分鐘。

在第二離心之后，將植物從離心容器中移除，并且用水沖洗以去除任何剩余的秋水仙素溶液，然后移植到10英寸盆中，并且生長室中在標(biāo)準(zhǔn)玉米生長條件下照管，直至它們生長至成熟并開花。

嘗試用從處理中存活的每株植物進(jìn)行自花授粉以產(chǎn)生花粉和穗，并且確定每個(gè)樣品中的授粉成功。

表7.在單倍體植物樣品上進(jìn)行的五種不同離心速度處理的比較。最初存活為存活至開花的植物的部分。授粉成功為產(chǎn)生花粉和絲并且因此能自交的植物的數(shù)目；受精成功為產(chǎn)生具有至少一粒種子的穗的加倍處理過的單倍體植物的數(shù)目。DE為加倍效率，等于受精成功除以每個(gè)種質(zhì)和處理中處理的植物的數(shù)目。

表7顯示，甚至在2000g下離心3min的植物展現(xiàn)出極好的存活率。表7還顯示，在離心期間，當(dāng)植物由PCS單獨(dú)地支持時(shí)獲得了極好的加倍率和一致的結(jié)果。

因此，可合理地得出以下結(jié)論，這些方法將可用于2000g以上的速度，并且用戶可期望使用廣范圍的離心率(包括至少高達(dá)4000g或5000g)來恢復(fù)至少一些DH₁種子，雖然更高的離心率仍可能產(chǎn)生可接受的結(jié)果。

實(shí)施例9.植物處理劑遞送的效率可用孵育來優(yōu)化

此實(shí)驗(yàn)證明了離心之間的孵育步驟可改善植物處理劑的遞送。

使來源于雌性近交系91DUQ1或雄性近交系83IDI1的F1雜種來源的單倍體幼苗在標(biāo)準(zhǔn)玉米生長條件中在溫室中的土壤中萌發(fā)，并且生長至V1生長期(種植后1周)。接著，將幼苗從土壤中移除，用水沖洗以將殘留土壤從植物中去除，然后分成4份樣品，所述樣品包含每個(gè)種質(zhì)的幾株幼苗/樣品。

然后將各樣品捆扎于包括用于支持的鋁箔套和木制棒的PCS中，所述PCS與圖9示出的PCS相似。一旦捆扎于PCS中，就使各樣品與包含600ppm或800ppm秋水仙素的植物處理液接觸，以便將每株植物的SAM完全浸沒，然后在SAM在離心期間浸沒于儲(chǔ)備加倍劑中的情況下將各樣品在100g下離心3min。

在浸沒性離心之后，將植物從離心容器移除，并且同時(shí)來自第一離心的一些加倍溶液保持依附至植物，將根和每個(gè)莖的下半部在水中沖洗以將任何加倍劑從所述植物端中去除。然后將每個(gè)捆扎的樣品在封閉潮濕的環(huán)境中孵育，持續(xù)表8列出的4種孵育期中的一種。

在每個(gè)各自的孵育期之后，將捆扎的樣品從潮濕的外殼中移除，并且經(jīng)受在340g下的非浸沒性離心3min，其中接觸植物的僅有的加倍溶液是來自先前浸沒性離心的保持在植物上的加倍溶液，即，在第一離心之后未向植物中添加另外的加倍溶液。

在第二離心之后，將植物從離心容器中移除，并且用水沖洗以去除任何剩余的秋水仙素溶液，然后在光、濕度和溫度受控的溫室中恢復(fù)并照管幾天，之后移植到苗圃溫室，在所述苗圃溫室中將植物在標(biāo)準(zhǔn)玉米生長條件下照管，直至它們生長至成熟并開花。

嘗試用從處理中存活的每株植物進(jìn)行自花授粉以產(chǎn)生花粉，并且確定每個(gè)處理中的最終加倍效率。在此實(shí)驗(yàn)中，各處理樣品中的加倍效率通過產(chǎn)生包含至少四個(gè)粒的至少一個(gè)穗的各處理樣品的植物的數(shù)目除以經(jīng)受那組處理?xiàng)l件的植物的總數(shù)來計(jì)算。

表8顯示，即使在相對(duì)低濃度的植物處理劑下，用增加的孵育期獲得了良好的加倍效率。

表8.包括兩種不同植物處理劑濃度和兩種不同孵育期的四種不同處理組合對(duì)單倍體植物的加倍效率的影響。使植物經(jīng)受在600ppm或800ppm的植物處理劑(秋水仙素)濃度下的第一浸沒性離心，隨后經(jīng)受3分鐘或3小時(shí)的孵育期，然后經(jīng)受非浸沒性離心。

表8顯示，這些方法可用于各式各樣的植物處理濃度和孵育期中，在所述孵育期內(nèi)，植物與植物處理劑接觸。這些結(jié)果與以下結(jié)論一致：離心步驟之前或之間的孵育期可改善向靶組織進(jìn)行的植物處理劑的遞送。在某些實(shí)施方案中，用戶可使植物與植物處理劑接觸，然后有意地延遲后續(xù)離心，以便實(shí)現(xiàn)提高的加倍效率。

實(shí)施例10.廣范圍的離心持續(xù)時(shí)間是對(duì)本發(fā)明有效的。

使兩種遺傳上不同的近交系中的一種(83IDI1或91DUQ1)的幼苗在溫室中萌發(fā)，并且在V1-V3生長期時(shí)從土壤或生長培養(yǎng)基中移除，并且用水沖洗以去除殘留土壤。然后將所有幼苗固定在與圖9示出的PCS相似的包括套和棒的PCS中，并且經(jīng)受在50g下包含1250ppm秋水仙素的液體處理液的浸沒性旋轉(zhuǎn)3min。

在第一浸沒性離心之后，將植物處理液傾出，并且將捆扎的幼苗經(jīng)受在340g下的非浸沒性離心3min或180min。

在第二離心之后，將植物從離心容器中移除，并且用水沖洗以去除任何剩余的秋水仙素溶液，然后在光、濕度和溫度受控的溫室中恢復(fù)并照管一周，然后對(duì)存活的植物的數(shù)目進(jìn)行計(jì)數(shù)以確定每個(gè)處理中的存活率。

表10.經(jīng)受兩種不同持續(xù)時(shí)間的非浸沒性離心的兩種不同種質(zhì)的幼苗的存活率。

表10顯示，甚至在不同的種質(zhì)間，離心時(shí)間可顯著增加，而沒有降低存活率。甚至在3小時(shí)旋轉(zhuǎn)時(shí)，本方法也產(chǎn)生極好的生存性。因此，很明顯，當(dāng)與超出本文直接測(cè)試的那些離心持續(xù)時(shí)間的離心持續(xù)時(shí)間一起使用時(shí)，這些方法在廣泛的離心范圍上、在證明其效用上非常有效。