本申請要求2014年1月23日提交的美國臨時申請No.61/930,821和2014年4月29日提交的美國臨時申請No.61/986,033的權(quán)益。

發(fā)明背景

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及治療或預(yù)防家禽中的禽流感的組合物和方法。更具體地說，本發(fā)明涉及干擾雞和其他家禽中的禽流感病毒復(fù)制的siRNA組合物。

背景技術(shù)：

禽流感病毒(AIV)是在許多禽物種中感染特定組織、包括呼吸、消化和/或神經(jīng)系統(tǒng)組織的病毒性疾病。雖然在野生禽類中很少致死，但AIV是高度傳染性的并且當(dāng)傳播到家禽時經(jīng)常是致死性的(Swayne和Halvorson 2008，Capua和Marangon 2006，Horimoto和Kawaoka 2001)。高致病性禽流感(HPAI)病毒迅速感染家禽并且經(jīng)常是致死性的，病死率接近100％(Horimoto和Kawaoka 2001)。低致病性禽流感(LPAI)病毒通常引起可能不被發(fā)現(xiàn)的輕度疾??；然而，LPAI的經(jīng)濟影響在于造成生產(chǎn)損失。LPAI和HPAI爆發(fā)的風(fēng)險對家禽業(yè)是重大威脅。

目前對家禽中AIV的預(yù)防性方法是受限的。正如由病毒在疫苗接種過的禽類中復(fù)制的能力所證明的，現(xiàn)有的疫苗不能提供完全免疫(Capua等2004)。疫苗依靠健全的免疫系統(tǒng)并且由于病毒抗原的進化而可能變得無效(Arzt等2010，Escorcia等2008，Zhou等2008，Bennink等2004，Ge等2004)。以前的研究結(jié)果顯示，來自家禽的AIV實地分離株在它們的遺傳信息中表現(xiàn)出不斷的漂移，并且歸因于疫苗株的抗原性差異可能有助于所述病毒在實地的持留(Escorcia等2008，Lee等2004)。有趣的是，一些為了控制HPAI爆發(fā)而創(chuàng)制的疫苗是新的HPAI爆發(fā)的前兆。疫苗保護可能要花超過一周來獲得(Kim等2009)；因此，在爆發(fā)期間疫苗接種幾乎提供不了保護。疫苗接種通過肌內(nèi)注射最有效，但肌內(nèi)注射對于大規(guī)模疫苗給藥是不實際的。最后，儲存和操作不當(dāng)經(jīng)常導(dǎo)致疫苗失效。還日益擔(dān)心當(dāng)前的禽H5N1病毒正變得耐受金剛烷胺、金剛烷乙胺和奧司他韋(Cheung等2006，Le等2005，de Jong等2005)。報告已經(jīng)將使用這些常見藥的治療與耐藥病毒的脫落聯(lián)系起來。例如，在保護禽類養(yǎng)殖場的緊急嘗試中，據(jù)報告中國在2005H5N1爆發(fā)期間施用了金剛烷胺。這種錯用導(dǎo)致了在中國和東南亞傳播的耐藥株(Cheung等2006)。缺少可靠的預(yù)防藥和這種疾病的地方性質(zhì)突出了開發(fā)在家禽中更有效的控制措施作為控制AIV傳播和減少爆發(fā)對家禽操作的影響的手段的急迫性。特別有價值的是考慮能夠保護家禽對抗AIV的任何亞型或病毒株的新預(yù)防性策略。

在缺乏有效控制時，家禽中AIV爆發(fā)可以是毀滅性的并且可能的經(jīng)濟損失估計值是巨大的。當(dāng)AIV流行襲擊具有更高密度的禽類養(yǎng)殖場的地區(qū)時，尤其如此。盡管有嚴(yán)格的生物安全措施和銷毀工作，這些地區(qū)仍然成為爆發(fā)的高風(fēng)險地點并且經(jīng)常面臨相當(dāng)大的控制AIV傳播的挑戰(zhàn)。一旦通過呼吸分泌物和糞便傳播，AIV的潛伏期可能持續(xù)長達(dá)10天并且大多數(shù)感染的家禽脫落病毒7到10天，使得病毒在禽群中長時間傳播(Easterday等1997)。這種潛在的長脫落期增加了對家禽的傳播風(fēng)險，尤其是在更大的群體內(nèi)(Easterday等1997)。開發(fā)強有力的抗流感技術(shù)是有效管理和控制這種疾病在家禽中蔓延以使經(jīng)濟損失和傳播到其他易感物種(包括人類)的風(fēng)險最小化的關(guān)鍵步驟。

當(dāng)前的禽類疫苗接種策略是受限的，因為它們不提供完全免疫、依靠健全的免疫系統(tǒng)、對病毒抗原性進化易感、在大規(guī)模商業(yè)家禽操作中要求對每只禽進行單獨處理、儲存期有限、和要花幾個星期才能獲得疫苗接種后抗體保護。因為這些挑戰(zhàn)，在美國，AIV疫苗接種很少用于家禽的預(yù)防性應(yīng)用。如果采取緊急疫苗接種程序，如果在爆發(fā)期間施用的話，它將幾乎不提供保護。此外，越來越多的關(guān)于出現(xiàn)耐藥性AIV變體的證據(jù)提出了使用藥物療法例如金剛烷胺、金剛烷乙胺和奧司他韋的風(fēng)險。這些限制表明，真正的需要是開發(fā)不僅能夠防御病毒的不同亞型和耐藥株，而且在如果爆發(fā)發(fā)生并且在短時期內(nèi)疫苗接種不可行或不生效時提供瞬時保護的預(yù)防策略。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明提供了利用非致病性細(xì)菌向禽類細(xì)胞遞送一種或多種小干擾性RNA(siRNA)以預(yù)防或治療禽流感病毒(AIV)的產(chǎn)物和相關(guān)方法。所述siRNA與AIV NP或PA序列的mRNA互補。在雞的攻擊研究中，所述siRNA顯示出防止疾病的臨床癥狀發(fā)作或降低嚴(yán)重性，包括降低病毒滴度或病毒脫落。

在第一方面，本發(fā)明提供了包含原核載體的非致病性大腸桿菌(E.coli)。所述載體是編碼一種或多種siRNA和控制所述siRNA轉(zhuǎn)錄的啟動子的DNA分子。由所述載體編碼的siRNA干擾一種或多種禽流感病毒RNA分子，從而抑制所述AIV的復(fù)制。另外，所述細(xì)菌被工程改造成表達(dá)至少一種inv基因和至少一種hlyA基因。所述inv基因產(chǎn)物幫助所述細(xì)菌進入靶細(xì)胞中。

在所述第一方面的有利實施方式中，所述siRNA干擾NP、PA、PB1或PB2mRNA。在其他有利的實施方式中，所述siRNA與多個亞型共有的禽流感病毒mRNA序列互補。理想地，所述siRNA將靶向在大多數(shù)亞型中保守的序列。以這種方式，所述siRNA將有效對抗盡可能多的亞型。然而，共有序列可能是更受限的并且它們可以隨時間改變。因此，siRNA可以被設(shè)計成有效對抗多個亞型，縱然不是全部亞型的話，并且可以使用有各種不同siRNA的“混合物”方式來覆蓋廣闊的AIV譜。

在第一方面的其他實施方式中，所述siRNA可以從包含選自SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14的序列的DNA序列產(chǎn)生。類似地，如果在質(zhì)粒具有選自SEQ ID No.5、SEQ ID No.7、SEQ ID No.15和SEQ ID No.17的序列的情況下，所述siRNA可以從編碼轉(zhuǎn)錄本的質(zhì)粒產(chǎn)生。

用于控制所述siRNA轉(zhuǎn)錄的啟動子可以是T7啟動子、T3啟動子或SP6啟動子。所述siRNA可以靶向保守序列，其中被靶向的保守序列是多個禽流感亞型共有的。并且所述原核載體是編碼inv基因和hlyA基因的質(zhì)粒，從而促進所述細(xì)菌進入細(xì)胞中并在進入后從內(nèi)涵體遞送來自所述細(xì)菌的siRNA。

在第二方面，本發(fā)明提供了治療家禽中的禽流感或降低禽流感蔓延風(fēng)險的方法。所述方法包括向家禽施用根據(jù)第一方面所述的包含非致病性大腸桿菌的組合物的步驟。在有利的實施方式中，所述組合物作為適合于吸入的氣霧劑經(jīng)鼻內(nèi)或噴霧施用。在其他有利的實施方式中，可以施用多個大腸桿菌菌群。在施用多個菌群的情況下，每個大腸桿菌菌群可以被工程改造成表達(dá)干擾一種或多種禽流感病毒RNA分子的不同的siRNA分子。通過這樣的策略，可以在單次預(yù)防性施用中靶向多個AIV mRNA。

在第三方面，本發(fā)明提供了藥物組合物，其具有遞送兩種不同siRNA的兩種不同的非致病性大腸桿菌。換句話說，第一種非致病性大腸桿菌具有編碼一種siRNA的原核載體，其中編碼的第一種siRNA干擾一種或多種禽流感病毒RNA分子，并且第二種非致病性大腸桿菌具有編碼不同siRNA的原核載體，其中編碼的第二種siRNA干擾不同的禽流感病毒RNA分子或相同禽流感病毒RNA分子的不同部分。所述組合物在可藥用載體中提供。在有利的實施方式中，編碼的第一種siRNA序列可以包括SEQ ID No.3并且編碼的第二種siRNA序列可以包括SEQ ID No.4。所述第一種細(xì)菌和第二種細(xì)菌可以被工程改造成表達(dá)至少一種inv基因和至少一種hlyA基因。

在第四方面，本發(fā)明提供了通過向家禽施用根據(jù)第三方面所述的組合物來治療家禽中的禽流感或降低禽流感蔓延風(fēng)險的方法。

在第五方面，本發(fā)明提供了通過向雞施用包含具有原核載體的侵襲性大腸桿菌的組合物的步驟來治療雞中的禽流感或降低禽流感蔓延風(fēng)險的方法。然而，所述載體，雖然包含DNA分子，卻不編碼與任何已知的雞基因或禽流感病毒RNA分子互補的siRNA。換句話說，所述細(xì)菌可以表達(dá)siRNA，或者它可以不表達(dá)siRNA，但如果它表達(dá)siRNA的話，該siRNA不與任何已知的雞基因或禽流感病毒RNA分子互補。所述細(xì)菌被工程改造成表達(dá)至少一種inv基因和至少一種hlyA基因。

在第六方面，本發(fā)明提供了具有編碼一種或多種siRNA的一種或多種DNA分子、控制所述siRNA轉(zhuǎn)錄的啟動子、至少一種inv基因和至少一種hlyA基因的原核載體。編碼的siRNA干擾禽流感病毒的mRNA。在有利的實施方式中，根據(jù)第六方面所述的載體可以產(chǎn)生干擾NP、PA、PB1或PB2mRNA的siRNA。另外，所述siRNA可以包含選自SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14的序列。

在第七方面，本發(fā)明提供了通過向家禽施用包含第六方面所述的原核載體的組合物來治療家禽中的禽流感或降低禽流感蔓延風(fēng)險的方法。在有利的實施方式中，所述組合物可以是利用編碼其他siRNA的其他原核載體的混合物，其中所述siRNA干擾禽流感病毒的其他mRNA轉(zhuǎn)錄本。

附圖說明

為了更完全了解本發(fā)明，應(yīng)該結(jié)合附圖參考以下詳細(xì)說明，在所述附圖中：

圖1是一系列四個圖(圖1A-1D)，顯示了通過按日、MOI和病毒示出的中位滴度降低而測量的siRNA保護。*表明利用Wilcoxon秩和檢驗，與相應(yīng)的未處理樣品有統(tǒng)計學(xué)顯著性差異(p<0.05)。

圖2是顯示在正常生長培養(yǎng)基(WM)、感染培養(yǎng)基(IM)中培養(yǎng)的或用A/火雞/科羅拉多/235497/2003(H8N4)(感染的)感染的LMH細(xì)胞中β-肌動蛋白(ACTB-282bp)和β1-整合素(ITGB1-308bp)的mRNA表達(dá)的圖像。泳道：1)在WM中的ITGB1；2)在IM中的ITGB1；3)感染的ITGB1；4)在WM中的ACTB；5)在IM中的ACTB；6)感染的ACTB；和7)陰性PCR對照。

圖3是一組六個圖像，顯示了帶有RFP標(biāo)簽的抗AIV_亂序(scramble)載體。向雞LMH細(xì)胞給予兩種劑量的RFP-載體(高＝7.8e5CFU/mL和低＝1.95e5CFU/mL)。在侵襲后2和24小時評價載體攝取。*注意，白色箭頭指向紅色熒光區(qū)域，所述紅色熒光區(qū)域在灰度圖上是不清楚的。

圖4是一系列四個圖(圖4A-4D)，顯示了通過按日、MOI和病毒示出的中位滴度降低而測量的抗AIV載體保護。星號(*)指示利用Wilcoxon秩和檢驗，與相應(yīng)的未處理樣品有統(tǒng)計學(xué)顯著性差異(p<0.05)。

圖5是一系列六個圖像，顯示了帶有RFP標(biāo)簽的抗AIV_亂序載體。將雞用RFP載體鼻內(nèi)處理并在處理后15和27小時評價攝取。*注意，白色箭頭指向紅色熒光區(qū)域，所述紅色熒光區(qū)域在灰度圖上是不清楚的。

圖6是一系列三個圖(圖6A-6C)，顯示了在研究期內(nèi)，每日A/雞/德克薩斯/473-2/10(H6N2)病毒滴度和脫落病毒的雞的比例。(A)逐日繪制的代表所有雞(脫落和不脫落)的中位病毒滴度(Log EID50eq/mL)。在第4日上面的線是PC；在第4日中間的線是亂序載體；并且在第4日下面的線是混合物。(B)代表雞脫落并且逐日繪制的中位病毒滴度。每日從左至右：混合物；亂序載體；PC。(C)在每組總共n＝10只雞中，逐日示出的脫落H6N2病毒的雞的比例(％)；但是，第10日在PC組中由于一只雞死亡，因此代表的是n＝9的觀察結(jié)果。逐日示出的中位滴度(B)表示在那日脫落H6N2病毒的雞的比例(C)。每日從左至右：混合物；亂序載體；PC。

具體實施方式

開發(fā)強有力的抗流感技術(shù)是有效管理和控制AIV在家禽中蔓延以使經(jīng)濟損失和傳播到其他易感物種(包括人類)的風(fēng)險最小化的關(guān)鍵步驟。當(dāng)前的禽類疫苗接種策略是受限的，因為它們不提供完全免疫、依靠健全的免疫系統(tǒng)、對病毒抗原性進化易感、在大規(guī)模商業(yè)家禽操作中要求對每只禽進行單獨處理、儲存期有限、和要花幾個星期才能獲得疫苗接種后抗體保護。因為這些挑戰(zhàn)，在美國，AIV疫苗接種很少用于家禽的預(yù)防性應(yīng)用。如果采取緊急疫苗接種程序，如果在爆發(fā)期間施用的話，它將幾乎不提供保護。此外，越來越多的關(guān)于出現(xiàn)耐藥性AIV變體的證據(jù)提出了使用藥物療法例如金剛烷胺、金剛烷乙胺和奧司他韋的風(fēng)險。這些限制表明，真正的需要是開發(fā)不僅能夠防御病毒的不同亞型和耐藥株，而且在如果爆發(fā)發(fā)生并且在短時期內(nèi)疫苗接種不可行或不生效時提供瞬時保護的預(yù)防策略。

為了開發(fā)替代性抗病毒藥，已經(jīng)探索了利用siRNA的RNA干擾(RNAi)，以利用siRNA控制人類和家畜物種中的疾病(Lyall等2011，Long等2010，Chen等2009)。RNAi介導(dǎo)劑的遞送已阻礙了它的臨床應(yīng)用(Li和Shen 2009)。因為siRNA不能獨立地跨過細(xì)胞膜，因此，它們需要遞送媒介例如基因工程改造的病毒和合成載體(Aigner 2009，Li等2006，Ge等2004)。這些病毒和合成siRNA媒介對臨床功效造成了嚴(yán)重的局限性和顧慮(Ge等2004)。病毒載體能引發(fā)造成細(xì)胞死亡的強免疫應(yīng)答(Davidson和McCray 2011，Ge等2004)?？刂凭哂胁《据d體的RNAi劑的劑量是困難的并且可以導(dǎo)致RNAi/microRNA系統(tǒng)的飽和，引起肝毒性(Beer等2010，Hacein-Bey-Abina等2008，Grimm等2006)。病毒載體可以整合到宿主基因組中并引起腫瘤發(fā)生(Davidson和McCray 2011，Beer等2010，Hacein-Bey-Abina等2008，Ge等2004)。實際上，近期的研究警告了來自短發(fā)夾RNA(shRNA)病毒載體的脫靶效應(yīng)，其在轉(zhuǎn)基因動物中導(dǎo)致細(xì)胞死亡和器官問題(Grimm等2006)。最后，合成的RNA媒介具有低遞送效率并且需要較高的劑量，這不僅成本過高，而且經(jīng)常是有毒性的(Ge等2004)。因此，迫切需要致力于獲得基于RNAi的抗病毒藥、特別是對抗家禽中的AIV的基于RNAi的抗病毒藥的更好的遞送機制。會特異性靶向AIV感染和復(fù)制的主要位點——肺和呼吸組織的安全有效的siRNA遞送媒介是特別有希望的途徑。這種類型的系統(tǒng)會改善更有效的抗流感預(yù)防藥的遞送特異性，同時由于全身給藥而使siRNA損失最小化并降低siRNA相關(guān)毒性。

因此，開發(fā)了transkingdom RNAi(tkRNAi)遞送平臺來提供對雞上皮細(xì)胞中AIV的抑制。TkRNAi使用非致病性細(xì)菌來產(chǎn)生和遞送沉默性RNA到粘膜上皮組織，并且證明了是通過施用于雞的上氣道來預(yù)防流感的有希望的遞送方法。這些細(xì)菌在遺傳上被工程改造成產(chǎn)生mRNA靶特異性的shRNA，侵襲粘膜上皮細(xì)胞，并將它們的shRNA有效載量釋放到寄主細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中。據(jù)認(rèn)為，一旦釋放到細(xì)胞質(zhì)中，這些shRNA就被加工成siRNA并隨后沉默互補的mRNA靶，從而觸發(fā)RNAi(Buttaro和Fruehauf 2010，Xiang等2006)。這里使用的tkRNAi系統(tǒng)包含已經(jīng)被特殊的shRNA生成質(zhì)粒(pMBV43)轉(zhuǎn)化的大腸桿菌。這些pMBV43質(zhì)粒和載體大腸桿菌的特征在于幾種組分。它們包括在T7RNA聚合酶啟動子控制下的shRNA表達(dá)盒、和終止子，用于在流感易感性呼吸道上皮細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中成功釋放和產(chǎn)生siRNA。引入來自假結(jié)核耶爾森氏菌(Yersinia pseudotuberculosis)的侵襲基因(inv)為在大腸桿菌表面上表達(dá)侵襲素蛋白質(zhì)做準(zhǔn)備。侵襲素與粘膜上皮細(xì)胞的表面上存在的β1整合素受體相互作用，導(dǎo)致載體細(xì)菌攝入到靶上皮細(xì)胞的內(nèi)涵體中。一旦大腸桿菌被攝取到所述宿主細(xì)胞中，它們需要逃脫宿主液泡以釋放到細(xì)胞溶質(zhì)中。所述細(xì)菌被編碼成從hlyA基因表達(dá)李斯特溶解素O(Listerolysin O)(LLO)，這是來自單核細(xì)胞增生性李斯特菌(Listeria monocytogenes)的成孔毒素(Xiang等2006，Mathew等2003，Radford等2002，Grillot-Courvalin等1998)。由于宿主溶酶體的低pH環(huán)境和缺少營養(yǎng)素，所述細(xì)菌在內(nèi)涵體內(nèi)部溶解，隨后釋放這種細(xì)菌毒素，其導(dǎo)致內(nèi)涵體膜破裂(Nguyen和Fruehauf 2009)。于是，在細(xì)胞質(zhì)中，所釋放的shRNA被Dicer加工成siRNA，合并到RNA-誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體(RISC)中，并觸發(fā)RNAi途徑來沉默被靶向敲除的基因。利用tkRNAi，我們開發(fā)了能夠生成并遞送靶向NP和PA AIV基因的siRNA的新RNAi抗病毒藥。這種新方法被應(yīng)用于禽類組織模型，以演示利用抗AIV載體抑制禽流感復(fù)制和脫落的概念的體外證據(jù)，所述模型的建立也在本文中公開。

對家禽進行疫苗接種以對抗AIV的經(jīng)濟獎勵很低并且經(jīng)常歸因于疫苗的幾個限制。這些限制和缺少獎勵對有效控制家禽中AIV爆發(fā)造成了明顯的障礙。開發(fā)新的抗流感技術(shù)是對于有效管理和控制這種疾病在家禽中蔓延、使財務(wù)損失最小化、和降低傳播給其他動物(包括人類)的風(fēng)險的關(guān)鍵步驟。應(yīng)用RNAi方法來開發(fā)對抗AIV的替代抗病毒藥是有希望的選擇。然而，RNAi介導(dǎo)劑的遞送仍然是限制其臨床應(yīng)用的障礙。Transkingdom RNAi(tkRNAi)利用非致病性細(xì)菌來產(chǎn)生siRNA并將siRNA遞送到靶組織，并且可能是獲得RNAi方法的臨床應(yīng)用的關(guān)鍵。構(gòu)建TkRNAi載體(抗AIV載體)以產(chǎn)生靶向病毒基因NP和PA的siRNA，并在已建立的禽類組織模型中評價這些載體的保護性功效。

首先在用帶有紅色熒光蛋白標(biāo)簽的載體處理的雞LMH細(xì)胞中驗證載體攝取和侵襲。接著，將細(xì)胞用抗AIV載體處理并用兩種不同的LPAI亞型H8N4和H6N2感染。以日為控制變量的多變量線性回歸分析揭示了用所述抗AIV載體處理的樣品和那些未處理的樣品之間校正平均脫落滴度的顯著差異(p<0.05)。靶向NP和PA這兩個基因的載體混合物在雞LMH細(xì)胞上清液中提供了高達(dá)10,960-倍的脫落滴度降低(p<0.05)。該工作演示了在已建立的禽類組織模型中利用這些新型抗AIV載體抑制AIV的概念的體外證據(jù)。該工作代表了在禽類模型中利用所述tkRNAi系統(tǒng)和抑制流感復(fù)制的第一個這樣的實例。

因為NP和PA蛋白二者在AIV轉(zhuǎn)錄和復(fù)制中發(fā)揮關(guān)鍵的作用，所以它們代表了通過siRNA抑制病毒復(fù)制的主要靶標(biāo)。設(shè)計經(jīng)過抗原性漂移和抗原性轉(zhuǎn)變?nèi)阅苡行У膕iRNA需要靶向基因內(nèi)部在不同的AIV亞型和病毒株之間保守的區(qū)域。由于它們在病毒轉(zhuǎn)錄和復(fù)制中的作用以及作為保持最佳病毒適應(yīng)度的方式，NP和PA各自含有在大多數(shù)A型流感病毒中發(fā)現(xiàn)的一段保守核苷酸。這些短序列在病毒復(fù)制中發(fā)揮的特定作用還有待于確定。然而，在雞、人、犬、馬和豬流感基因組中都發(fā)現(xiàn)了這些短保守序列。與NP和PA基因不同，HA和NA區(qū)段不含用于siRNA設(shè)計的21個保守核苷酸段。在成功轉(zhuǎn)錄和復(fù)制中對這些保守區(qū)域的依賴性致使所述NP和PA基因中的這些短序列成為siRNA設(shè)計的主要靶標(biāo)。

幾乎所有調(diào)查siRNA應(yīng)用的研究都在哺乳動物細(xì)胞中評估，而缺少利用禽類模型的研究。基于幾個原因，使用哺乳動物細(xì)胞是明顯的限制。首先，因為大部分RNAi設(shè)計工具是利用哺乳動物系統(tǒng)開發(fā)的，這些工具可能設(shè)計出當(dāng)被引入禽類細(xì)胞培養(yǎng)物時不太有效的siRNA，導(dǎo)致RNAi效率較低。其次，AIV是禽類物種的疾病。因此，使用相關(guān)的禽類組織模型來確定RNAi是否是防止家禽中AIV復(fù)制的有效方法，是必要的。以前的RNAi轉(zhuǎn)染和病毒感染研究通常選擇的病毒是從人類和其他哺乳動物分離的實驗室改造的病毒。如果我們試圖確定RNAi是否是防止家禽中AIV復(fù)制的有效方法，則利用通常從家禽分離的天然存在的禽流感病毒進行這些研究是至關(guān)重要的。

AIV被公認(rèn)為國立過敏和傳染性疾病研究所(National Institute of Allergy and Infectious Diseases)生物防御C類優(yōu)先病原體、經(jīng)濟上重要的家禽疾病、和重大公眾健康威脅，因為來源于動物的病毒有引起下一步人類流行的潛力(Carver和Krushinskie 2006，Webster 1997)。AIV侵害許多食用禽類，包括雞、火雞、鴨、鵪鶉和珍珠雞。在文獻(xiàn)中，有LPAI和HPAI在家禽中重大全球爆發(fā)的數(shù)不清的描述。這些爆發(fā)引人關(guān)注，不僅因為在家禽中觀察到的毒力程度導(dǎo)致嚴(yán)重的經(jīng)濟后果，而且是由于傳播給哺乳動物物種的能力。高度致病性的H5N1禽類病毒株目前在許多國家流行。家禽中HPAI爆發(fā)已經(jīng)導(dǎo)致數(shù)百萬動物的剔除和數(shù)十億美元的凈損失。自從2003年以來，H5N1病毒株已經(jīng)引起了648個人類病例，其中384例是致死的(2013：WHO在人類動物交界處的流感(Influenza at the human animal interface))。令人震驚的是，現(xiàn)在已經(jīng)報告了大約150例的LPAI(H7N9)病毒的人類感染，其中約33％已經(jīng)導(dǎo)致死亡(疾病控制和預(yù)防中心(Centers for Disease Control and Prevention)2014)。

AIV傳播給人類的主要風(fēng)險因數(shù)是直接接觸和處理家禽(Vong等2009，Areechokchai等2006，Dinh等2006，Wang等2006，Bridges等2002，Mounts等1999)，因此大部分人類病例是當(dāng)人類和家畜之間的密切接近導(dǎo)致傳播時發(fā)生的。因為流行病毒的數(shù)量在家禽中增加，因此傳播給人類的風(fēng)險和重配成更容易在人類中傳播的形式的潛力也增加(Gatherer 2010)。因此，對于降低對人類的風(fēng)險來說，家禽中的AIV預(yù)防必須是主要關(guān)注點。在幾乎沒有或沒有免疫力的人群中出現(xiàn)新型可傳播AIV，將引起沒有疫苗可用的全球大流行。這些病毒株特別令人擔(dān)憂，因為它們耐受最成本有效的抗病毒藥物，金剛烷胺和金剛烷乙胺(He等2008，Lee等2008，Pinto和Lamb 1995，Belshe等1988)。

正如具有在位的早期檢測規(guī)程和警報系統(tǒng)作為控制和管理家禽中AIV的手段是至關(guān)重要的，還必須有可利用的有效預(yù)防性措施為潛在性爆發(fā)作準(zhǔn)備。家禽疫苗接種可以有助于控制HPAI病毒并降低經(jīng)濟損失和動物傳染病傳播，然而疫苗接種不是家禽養(yǎng)殖場的常見做法，因為它不被認(rèn)為是可行的選項。此外，如果在緊急情況下采取疫苗接種，它很可能是在爆發(fā)已經(jīng)被確定后發(fā)生的。疫苗保護需要花兩到三周來獲得(Kim等2009)，并且經(jīng)常需要重復(fù)給藥來引起完全的保護(Poetri等2011)。因此，在爆發(fā)期間疫苗接種可能對控制傳播鏈幾乎沒有作用，尤其在家禽數(shù)量密集的地區(qū)。開發(fā)用于家禽的強有力的抗流感技術(shù)是有效管理和控制這種疾病在全世界蔓延的關(guān)鍵步驟。

之前描述的工作研究了利用RNAi遞送平臺tkRNAi在雞上皮細(xì)胞中抑制AIV。這種tkRNAi系統(tǒng)利用工程改造的大腸桿菌來產(chǎn)生對抗NP和PA病毒基因的短發(fā)夾RNA并成功地將所述shRNA遞送到細(xì)胞內(nèi)。在給藥二十四小時內(nèi)，這些載體在體外導(dǎo)致AIV復(fù)制顯著減少。這些進程證明了這些新型抗AIV載體在我們的禽類組織模型中的瞬時抗病毒潛力。在繼續(xù)追求我們的長期目標(biāo)、即將這種抗流感技術(shù)開發(fā)成為能促進更有效和強大的家禽AIV控制方法的開發(fā)的預(yù)防藥中，本研究的目的是評價這些抗病毒載體在實驗性攻擊的雞中的鼻內(nèi)施用和保護性功效。

基于臨床保護(降低的發(fā)病率和死亡率)和通過檢測攻擊后的病毒脫落來評價疫苗功效。家禽中AIV疫苗接種的另一個目標(biāo)是刺激免疫應(yīng)答并防止個體動物被感染。這種預(yù)防藥沒有被工程改造成在個體動物中預(yù)防感染。這種新技術(shù)的作用模式是抑制病毒復(fù)制，從而在感染之后減少感染性病毒的脫落。理論上，如果雞脫落的病毒量降低，則病毒載量降低并且動物更可能被臨床保護。因此，為了提供這些抗AIV載體的初始功效，評價了這些載體在實驗性攻擊的雞中降低發(fā)病率、死亡率和病毒脫落的預(yù)防能力。如果這種預(yù)防藥能抑制禽類個體中禽類脫落的比例和脫落滴度，則在禽類群體中能更好地控制傳播風(fēng)險。因此，除了監(jiān)測脫落性禽類的比例和脫落滴度之外，還利用在接受所述抗AIV載體的AIV攻擊的禽類之中圈養(yǎng)的崗哨(sentinel)禽類測試傳播潛力(參見下面的實施例3)。

用所述抗AIV載體處理的家禽不會產(chǎn)生抗AIV的抗體。這通常是與疫苗接種實踐相關(guān)的局限性，因為疫苗刺激抗病毒的抗體產(chǎn)生。這造成與交換壁壘(trade barrier)相關(guān)的問題，使得難以判別抗體反應(yīng)性是由于疫苗接種還是天然AIV感染。如果有有效的常規(guī)疫苗可用，它經(jīng)常是不能使用的。國家不能冒失去無AIV疾病狀態(tài)的風(fēng)險，當(dāng)由于疫苗接種產(chǎn)生的陽性血清學(xué)試驗干擾疾病監(jiān)控時，情況經(jīng)常是這樣。與接種疫苗的家禽不同，用所述抗AIV載體處理的那些家禽不會對AIV抗體測試陽性，并且不會需要利用區(qū)分感染與疫苗接種的試驗(Differentiate Infected from vaccinated Assay)(DIVA)進一步測試。以這種方式，將避免與疫苗接種動物的反應(yīng)性有關(guān)的教皇壁壘和額外的AIV篩選試驗。

家禽業(yè)不會采用沒有證明它的使用是AIV爆發(fā)的成本有效的對策的商業(yè)疫苗或任何其他預(yù)防藥。這在低密度家禽地區(qū)尤其關(guān)鍵，在這種地區(qū)下爆發(fā)的風(fēng)險被認(rèn)為是可忽略的。影響疫苗接種成本的因素包括疫苗的保存期限或持久性、給藥方法、能產(chǎn)生它的容易性和可及性。通常，利益必須高于疫苗接種或治療的成本方能被視為有利的投資。

與其他RNAi治療方法有關(guān)的局限性之一是與沉默性RNA的商業(yè)制造有關(guān)的成本。所提議的技術(shù)的顯而易見的優(yōu)點是細(xì)菌自身產(chǎn)生shRNA以供分裂成隨后的siRNA序列的能力。這種特性消除了昂貴的siRNA制造和高生產(chǎn)成本(Xiang等2009，Keates等2008，Xiang等2006，Gardlik等2005)。在疫苗被認(rèn)為必要的地區(qū)中，國家每年會儲備數(shù)百萬劑疫苗用于突然事件的準(zhǔn)備。很多次當(dāng)發(fā)現(xiàn)這些疫苗距離現(xiàn)場病毒很遠(yuǎn)時，它們就變得過期了。產(chǎn)生大量細(xì)菌是簡單和快速的。因此，與疫苗可能花數(shù)月來配制和甚至更長時間來獲得足夠的量不同，這些載體可以容易地從少量原料產(chǎn)生巨大的量。如果儲存得當(dāng)，這些細(xì)菌性載體可以具有無限的儲存期限。這是超越當(dāng)前疫苗的又一個主要優(yōu)點。

疫苗接種和其他RNAi方法具有共同的與給藥和靶向遞送相關(guān)的障礙。大多數(shù)AIV疫苗必須皮下給藥，使得它們給藥繁瑣和效率低。這些抗AIV載體允許靶向呼吸遞送并特異性侵襲到表達(dá)β1-整合素的粘膜上皮細(xì)胞中。與其他組織和器官不同，包括肺在內(nèi)的呼吸組織是難以置信地易接近的，使得這種抗AIV技術(shù)理想地用于預(yù)防呼吸疾病，如流感。雞具有位于眼睛中部的腺，稱為哈氏腺(Harderian gland)，該腺被認(rèn)為對于在上呼吸道中產(chǎn)生局部免疫應(yīng)答是關(guān)鍵的(Wight等1971)?；谶@個理由，滴眼液疫苗接種被認(rèn)為通過哈氏腺刺激了粘膜免疫反應(yīng)，如果將這些載體施用于眼中的話，也能這么說。所述抗AIV載體可以被容易地修改成鼻內(nèi)、口服、通過滴眼液施用、或作為適合于吸入或眼睛遞送的噴霧氣霧劑施用。

這些載體將提供成本有效的持久的產(chǎn)物，所述產(chǎn)物可容易地用于在商業(yè)家禽操作上進行大規(guī)模應(yīng)用。遞送的多用性和它可以容易地修改成供大規(guī)模應(yīng)用賦予了這種技術(shù)超過當(dāng)前疫苗的優(yōu)點并等同于提供有效率的遞送和肺組織定位的系統(tǒng)。這些品質(zhì)使得這種技術(shù)在爆發(fā)疫情期間在減少病毒脫落和病毒在家禽群體之間傳播上尤其有利。

功效是理想的AIV疫苗或替代的家禽預(yù)防藥的本質(zhì)特性。術(shù)語“有效的”是用于確定疫苗或替代性預(yù)防藥在標(biāo)準(zhǔn)化實驗性攻擊研究中的保護性，所述保護性根據(jù)預(yù)防死亡率、發(fā)病率、脫落和AIV在家禽中傳播來度量。疫苗對HPAI的功效的行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)是降低的發(fā)病率和死亡率。在LPAI實驗性攻擊的SPF雞中觀察到非常小的發(fā)病率和死亡率，使得難以確定疫苗對LPAI分離株的功效。確定疫苗對抗LPAI分離株的功效如何，常規(guī)是定量雞的口咽部滴度。因為目前家禽可用的疫苗不提供殺菌性免疫，所以有效控制工具應(yīng)該是將病毒脫落降低到最大可能的程度(Sylte和Suarez 2012)。這些初始的試驗性研究的結(jié)果表明，抗AIV載體處理將病毒復(fù)制和脫落滴度降至被認(rèn)為臨床相關(guān)的水平。然而，需要進行其他研究來進一步證明這種技術(shù)的保護性質(zhì)。

家禽中的AIV疫苗接種比用于對抗大多數(shù)其他由病毒引起的疾病的疫苗接種更困難。這是由于大的抗原變異需要事先知道流行亞型，從而降低了疫苗功效。低疫苗功效和高成本與利益比通常抵銷了任何提議的疫苗接種策略。當(dāng)在家禽中檢出AIV時，一般使用‘撲滅’或剔除策略來努力根除疾病。假定在將來的攻擊研究和隨機化現(xiàn)場試驗中證明了功效、效能和環(huán)境安全性，我設(shè)想這種預(yù)防技術(shù)可能是搶先剔除高風(fēng)險地區(qū)中的家禽的解決方案。然而，即使當(dāng)選擇疫苗接種作為爆發(fā)期間的應(yīng)急工具時，它還經(jīng)常結(jié)合其他控制方法，尤其是如果難以迅速剔除的話。以前的經(jīng)驗已經(jīng)指出，為了成功控制并最終根除AIV，疫苗接種程序必須是更廣泛的控制策略的一部分(Capua和Marangon 2006)。這包括嚴(yán)格的生物安全措施、監(jiān)控、剔除、和可能實施這種預(yù)防技術(shù)的應(yīng)用。

與功效相關(guān)的另一個問題是獲得保護性免疫所必需的時間間隔。需要最少7到10日來刺激疫苗接種之后的初始免疫應(yīng)答，并再需要2周來產(chǎn)生保護性抗體水平。這意味著即使作決定的過程是快步的并且有適當(dāng)?shù)囊呙绻┝⒓磻?yīng)用，但如果是在家禽中爆發(fā)活躍期間應(yīng)用的話，疫苗接種未必有效。這種抗AIV載體技術(shù)會超過所述疫苗的關(guān)鍵益處在于它提供瞬時保護的能力。在爆發(fā)疫情期間，這種特性是難以置信地有利的。

實施例1–設(shè)計siRNA和在禽類組織模型中利用病毒特異性siRNA抑制禽流感

禽流感病毒(AIV)是對全世界家禽最重大的經(jīng)濟威脅。AIV疫苗有限，這突出了對考慮能保護家禽對抗爆發(fā)的新預(yù)防策略的需要。已開發(fā)了適當(dāng)?shù)那蓊惤M織轉(zhuǎn)染和AIV感染模型。這種禽類模型被用于證明靶向病毒復(fù)制所需要的兩個關(guān)鍵AIV基因NP和PA的小干擾RNA(“siRNA”)的抗病毒潛力。將雞LMH細(xì)胞用靶向NP和PA mRNA的siRNA轉(zhuǎn)染并用兩種不同的LPAI亞型H8N4和H6N2感染細(xì)胞。以日為控制變量的多變量線性回歸分析揭示了用siRNA處理的樣品和那些未處理的樣品之間校正平均脫落滴度的顯著差異(p<0.05)。各siRNA和待測siRNA混合物導(dǎo)致在雞LMH細(xì)胞上清液中脫落滴度降低高達(dá)100倍(p<0.05)。該工作演示了在已建立的禽類組織模型中利用病毒特異性siRNA抑制禽流感復(fù)制的概念的體外證據(jù)。

材料和方法

細(xì)胞培養(yǎng)–選擇雞肝細(xì)胞癌上皮細(xì)胞(LMH細(xì)胞，ATCC CRL-2117)作為所述模型的禽類細(xì)胞系。這些細(xì)胞是可商購的，專門計劃用于轉(zhuǎn)染研究的，并且作為上皮肝細(xì)胞，它們代表了A型流感感染的適當(dāng)禽類組織(Swayne和Pantin-Jackwood 2006，Shinya等1995)。將LMH細(xì)胞在37℃和7％CO₂存在下生長在Waymouth's MB 752/1培養(yǎng)基(Life Technologies)中，所述培養(yǎng)基含有10％胎牛血清(FBS，Life Technologies)、2mM L-谷氨酰胺(Life Technologies)、100單位/ml青霉素和1mg/ml鏈霉素(Life Technologies)。用于增殖所述LMH細(xì)胞的所有培養(yǎng)容器預(yù)先涂布有0.1％明膠(Millipore)。在LMH細(xì)胞中進行的全部轉(zhuǎn)染和感染試驗之后，Madin-Darby犬腎(MDCK)細(xì)胞被用于測定病毒滴度和定量感染性病毒粒子。將MDCK細(xì)胞在37℃和7％CO₂存在下生長在最低必需培養(yǎng)基中，所述培養(yǎng)基具有Earle's平衡鹽(MEM/EBSS)、2mM L-谷氨酰胺、10％胎牛血清(FBS)、0.5％丙酮酸鈉(100mM溶液，Life Technologies)、0.5％MEM非必需氨基酸(NEAA，100x溶液，Life Technologies)、100單位/ml青霉素和1mg/ml鏈霉素(Life Technologies)。

病毒–下列LPAI禽流感病毒株在LMH細(xì)胞中增殖：A/雞/德克薩斯/473-2/10(H6N2)，A/雞/德克薩斯/55116-2/11(H4N8)，和從2005年科羅拉多的火雞爆發(fā)中分離的LPAI亞型H8N4(亞型是以前通過血細(xì)胞凝集抑制和神經(jīng)氨酸苷酶抑制實驗確定的)。病毒滴度通過在MDCK細(xì)胞中的50％組織培養(yǎng)感染劑量(TCID50)試驗來測量。H6N2和H8N4LPAI病毒株被選擇用于本研究，因為它們在48個感染后小時數(shù)(hpi)時在LMH細(xì)胞中復(fù)制到高滴度并具有強細(xì)胞病變效應(yīng)(CPE)，并且適合于使用MDCK細(xì)胞的TCID₅₀試驗。將這兩種病毒在LMH細(xì)胞中增殖并收集感染性病毒上清液，離心去除細(xì)胞碎片，并在-80℃儲存。通過TCID₅₀度量工作儲液滴度，并確定最佳感染復(fù)數(shù)(MOI)。

siRNA–合成RNA寡核苷酸，脫鹽，并在運輸之前雙鏈體化(Dharmacon，Thermo Scientific)。NP(NP-siRNA)和PA(PA-siRNA)的正義和反義RNA序列以前已發(fā)表(Ge等2003)。各siRNA的mRNA靶序列如下：NP：5’-GGA TCT TAT TTC TTC GGA G-3’(SEQ ID NO.1)和PA：5’-GCA ATT GAG GAG TGC CTG A-3’(SEQ ID NO.2)。使用BLAST證實每種siRNA正義鏈序列與同H6N2和H8N4有關(guān)的NP和PA病毒基因序列100％互補。另外，篩選與雞序列高度同源的所有siRNA反義種子區(qū)序列以減少脫靶沉默的可能性。

轉(zhuǎn)染效率–測試了幾種轉(zhuǎn)染試劑的與siRNA無關(guān)的CPE視覺征象。這些轉(zhuǎn)染試劑包括2000(Life Technologies)、RNAiMax(Life Technologies)、6(Promega Corporation)和XtremeGene(Roche Diagnostics)。在LMH細(xì)胞中利用BLOCK-iT^TM Alexa紅色熒光dsRNA對照(Life Technologies)測定轉(zhuǎn)染效率。利用LSM 510Zeiss共聚焦熒光顯微鏡在40X下在八個隨機視野中計數(shù)Alexa-陽性細(xì)胞。使用熒光顯微術(shù)來選擇最終轉(zhuǎn)染試劑，確定siRNA和轉(zhuǎn)染試劑的最佳濃度范圍，和最佳siRNA溫育期。在溫育24h后測定轉(zhuǎn)染效率(α＝0.05)。

將siRNA轉(zhuǎn)染到雞細(xì)胞中–在轉(zhuǎn)染前一日將LMH細(xì)胞接種在24-孔板中，以讓細(xì)胞單層達(dá)到80％匯合。利用2000，根據(jù)制造商的說明書，將細(xì)胞用NP-siRNA、PA-siRNA和NP/PA二者(siRNA混合物)(各32nM或以混合物形式總共64nM)轉(zhuǎn)染。簡單地說，將2000在Opti-MEM培養(yǎng)基(Life Technologies)中以1:50稀釋。隨后將各試驗siRNA和假siRNA(與任何已知雞基因沒有互補性的亂序的陰性siRNA)在所述2000–Opti-MEM混合物中稀釋并使其在室溫下溫育15分鐘。所述LMH細(xì)胞通過去除完全生長培養(yǎng)基并只用Opti-Mem培養(yǎng)基洗滌每個孔來準(zhǔn)備用于轉(zhuǎn)染。用687μl/孔轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基(Opti-MEM，10％FBS，2mM L-谷氨酰胺)替換洗滌液并添加63μl的siRNA2000復(fù)合體。所有對照或處理細(xì)胞在一式三個孔中轉(zhuǎn)染。

病毒感染–在轉(zhuǎn)染后24小時，所述LMH細(xì)胞通過去除所述轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基并用含有0.25μg/ml TPCK處理的胰蛋白酶(Sigma-Aldrich)、3％牛血清白蛋白(BSA，Gemini Bio-Products)、2mM L-谷氨酰胺、100U/ml青霉素和1mg/ml鏈霉素的接種培養(yǎng)基(IM)洗滌每個孔而準(zhǔn)備用于感染。去除洗滌液并向每個適當(dāng)?shù)目滋砑涌偣?50μl的IM，所述IM含有MOI為0.01或0.001的H8N4或H6N2病毒。將板在搖擺平臺上在37℃和7％CO₂存在下溫育1小時，然后去除所述病毒并用750μl/孔的新鮮IM替換。收獲48hpi細(xì)胞培養(yǎng)上清液，離心去除細(xì)胞碎片，并在-80℃下冷凍。每個實驗包括以一式三個孔測試的陽性對照(只感染LPAI)、陰性對照(未處理的LMH細(xì)胞)和假轉(zhuǎn)染對照(假siRNA和LPAI感染)。

感染性病毒滴度評價–LMH細(xì)胞培養(yǎng)上清液通過利用CPE作為病毒存在的指標(biāo)對MDCK細(xì)胞滴定來定量，并且將滴度表示為50％組織培養(yǎng)物感染劑量/ml(TCID50/ml)。簡單地說，將MDCK細(xì)胞接種到96孔板中。對于每個培養(yǎng)上清液，在含有1μg/ml TPCK處理的胰蛋白酶(Worthington Biochemical Corporation)的MEM/EBSS、2mM L-谷氨酰胺、3％BSA、0.5％丙酮酸鈉、0.5％MEM-NEAA、100U/ml青霉素和1mg/ml鏈霉素中進行從1:10到1:108的十倍連續(xù)稀釋。當(dāng)細(xì)胞單層80-90％匯合時，去除生長培養(yǎng)基并將所述細(xì)胞用100μl/孔病毒懸液進行一式三份的接種。在48hpi時，將細(xì)胞與結(jié)晶紫染色劑(含有0.1％結(jié)晶紫和2.5％PBS緩沖的福爾馬林的磷酸鹽緩沖鹽水(PBS))一起溫育并將有CPE的孔記分為病毒生長陽性。TCID50/mL通過Reed和Muench數(shù)學(xué)技術(shù)來計算(Reed和Muench 1938)。

統(tǒng)計分析–所有實驗在不同日重復(fù)最少三次。利用0.05的統(tǒng)計顯著性水平，進行Wilcoxon秩和檢驗以比較在同一日進行的siRNA轉(zhuǎn)染樣品和陽性對照(PC)樣品之間的中位病毒滴度。為了確定siRNA轉(zhuǎn)染樣品和PC樣品之間的校正平均LogTCID₅₀/mL值是否有統(tǒng)計差異(p<0.05)，利用以日為控制變量的多變量線性回歸來分析數(shù)據(jù)。利用計算軟件Stata 10(Statcorp LP)進行統(tǒng)計分析。

結(jié)果

有效siRNA的設(shè)計–不同的禽流感病毒株之間范圍廣泛的遺傳變異對非特異性疫苗接種之后的病毒逃避負(fù)有很大責(zé)任。同樣地，這種遺傳變異性使得難以設(shè)計能對許多AIV保持有效的siRNA。mRNA靶位點和siRNA反義種子區(qū)之間少到一個核苷酸的差異都可能完全消除任何RNAi抗病毒活性。因此，重要的是設(shè)計靶向在許多不同的病毒株(包括HPAI病毒)中觀察到的高度保守序列的siRNA。利用BLAST來檢索A型流感病毒中的序列同源性以及NP和PA siRNA序列與雞序列之間的脫靶匹配。這種篩選揭示了這兩種siRNA與任何已知雞序列都不具有高度同源性，特別是在siRNA種子區(qū)和宿主mRNA之間。所述NP和PA siRNA序列二者以100％同源性與H8N4和H6N2NP和PA序列對齊。利用這兩種19個nt的siRNA序列的核苷酸收集(nr/nt)數(shù)據(jù)庫，所述BLAST檢索顯示出在超過10,000種A型流感病毒(包括從豬、野鳥、家禽、馬、犬和人類分離的那些病毒)中100％的查詢覆蓋。這些查詢匹配包括最近在2013年從國內(nèi)和國際爆發(fā)分離的致病性H5、H9和H7亞型。

siRNA在雞細(xì)胞中的抗病毒活性–優(yōu)化所述轉(zhuǎn)染程序，以利用2000和濃度在32nM和64nM之間的siRNA在LMH細(xì)胞中達(dá)到高達(dá)81％的轉(zhuǎn)染率。這種轉(zhuǎn)染程序和siRNA濃度范圍允許在不引起CPE的情況下實現(xiàn)足夠的轉(zhuǎn)染。在用MOI 0.01和0.001的H6N2或H8N4病毒感染之前，將NP和PA-siRNA轉(zhuǎn)染到LMH細(xì)胞中并收集培養(yǎng)上清液用于TCID₅₀分析。在假對照和PC之間病毒滴度沒有顯著差異(數(shù)據(jù)未示出)表明siRNA轉(zhuǎn)染不影響病毒產(chǎn)生。

正如所料，每種siRNA轉(zhuǎn)染的抗病毒活性按日、用于感染的病毒和MOI變化(圖1)。然而，在H6N2和H8N4二者感染的NP、PA或混合物-siRNA樣品中觀察到顯著的抗病毒活性。在每個實驗日，與相應(yīng)的PC樣品相比，至少一種siRNA轉(zhuǎn)染在這兩種病毒中和在這兩種MOI下顯著降低中位病毒滴度。在至少一個實驗日，除了MOI 0.001的H8N4之外，所述混合物-siRNA在這兩種病毒中和在這兩種MOI下顯著降低中位病毒滴度。盡管沒有顯著差異可能與樣本量小有關(guān)，但與其適當(dāng)?shù)奈刺幚鞵C相比，70％、50％和100％的所有NP-siRNA、PA-siRNA和混合物-siRNA轉(zhuǎn)染分別導(dǎo)致中位病毒滴度降低。

為了跨所有實驗日比較siRNA轉(zhuǎn)染樣品與未處理的PC樣品，利用以日為控制變量的多變量線性回歸(MLR)分析。MLR結(jié)果揭示了在siRNA轉(zhuǎn)染樣品和未處理的PC樣品之間校正平均病毒滴度的顯著差異(表1)。在來自H8N4MOI 0.01和H6N2MOI 0.001感染細(xì)胞的NP-siRNA和混合物-siRNA樣品二者中觀察到顯著差異。計算siRNA轉(zhuǎn)染樣品和未處理樣品之間感染性病毒的log₁₀降低。除了來自H8N4MOI 0.001和H6N2MOI 0.01樣品的PA-siRNA轉(zhuǎn)染之外，所有siRNA轉(zhuǎn)染都導(dǎo)致至少0.3的log₁₀降低(降低2.1倍)。最值得注意的是在混合物-siRNA轉(zhuǎn)染后的H8N4/MOI 0.01滴度、NP-siRNA轉(zhuǎn)染后的H8N4/MOI 0.001滴度以及混合物-和NP-siRNA轉(zhuǎn)染后的H6N2/MOI 0.001滴度，分別導(dǎo)致1.3(20-倍)、1.0(10-倍)和1.7(50-倍)、2.0log₁₀降低(100-倍)。

表1-通過脫落滴度的log降低和降低倍數(shù)度量的在雞上皮細(xì)胞中的SiRNA保護

本實施例演示了在禽類組織模型中利用病毒特異性siRNA抑制禽流感的概念的體外證據(jù)。用靶向NP和PA mRNA的siRNA轉(zhuǎn)染雞LMH細(xì)胞顯著降低了用兩種不同的AIV亞型H8N4和H6N2感染之后的感染性滴度。這兩種病毒不是實驗室改造的LPAI病毒。二者都從過去在美國發(fā)生的家禽爆發(fā)中分離。因而，它們是測試這種siRNA抗病毒方法的適當(dāng)且理想的病毒。

即使在siRNA轉(zhuǎn)染樣品和未處理的PC樣品之間沒有觀察到顯著差異時，在所有siRNA樣品中，除了兩個PA-siRNA轉(zhuǎn)染組之外，仍觀察到感染性病毒滴度的log₁₀降低。最強效的感染性病毒滴度抑制發(fā)生在LMH細(xì)胞用NP-siRNA或混合物-siRNA轉(zhuǎn)染后，導(dǎo)致log₁₀降低在0.5-2.0的范圍內(nèi)(降低3.2-100倍)。

本工作為確定能夠引發(fā)充分的siRNA保護以在家禽的AIV爆發(fā)期間防止病毒脫落和后續(xù)疾病傳播的措施提供了基礎(chǔ)。另外，流感病毒突變迅速，經(jīng)常致使疫苗無效。設(shè)計靶向這些保守mRNA位點的RNAi構(gòu)建物允許獲得更有效率的RNAi沉默，而且，利用這些siRNA混合物靶向多個保守位點可以進一步防止因突變引起的RNAi逃脫。

RNAi是可以幫助研究人員實現(xiàn)尚不可能的目標(biāo)并提供新的抗流感發(fā)展策略的機會的工具。本研究在開發(fā)適當(dāng)?shù)捏w外禽類模型來證實這種RNAi抗流感方法上是成功的。本工作表明，靶向病毒NP和PA基因的以混合物形式的siRNA介導(dǎo)的敲除抑制了AIV體外復(fù)制。然而，盡管有所述潛力，但這些siRNA必須在這種禽類模型中抑制感染性病毒脫落，這些RNAi介導(dǎo)劑需要被認(rèn)為臨床可應(yīng)用的更好的遞送機制。出于幾個原因，與使用合成轉(zhuǎn)染媒介例如2000有關(guān)的遞送效率是有限的。第一，低遞送效率需要更高的劑量，這不僅成本過高，而且經(jīng)常有毒性(Ge等2004)。第二，這些轉(zhuǎn)染試劑只實現(xiàn)全身遞送，而不是靶向遞送。這再次需要更高的劑量來充分轉(zhuǎn)染特定的組織。開發(fā)允許鼻內(nèi)遞送的RNAi抗病毒技術(shù)是預(yù)防AIV的唯一希望。因此，后續(xù)的工作集中在設(shè)計這種基于RNAi的抗病毒藥、特別是用于預(yù)防家禽中AIV的基于RNAi的抗病毒藥的更好的遞送機制上。這項工作在下面實施例2中示出。

實施例2–在雞細(xì)胞模型中利用獨特的RNAi遞送技術(shù)抑制禽流感復(fù)制

對家禽進行疫苗接種以對抗AIV的經(jīng)濟獎勵很低并且經(jīng)常歸因于疫苗的幾個限制。這些限制和缺少獎勵對有效控制家禽中AIV爆發(fā)造成了明顯的障礙。開發(fā)新的抗流感技術(shù)是對于有效管理和控制這種疾病在家禽中蔓延、使財務(wù)損失最小化、和降低傳播給其他動物(包括人類)的風(fēng)險的關(guān)鍵步驟。應(yīng)用RNAi方法來開發(fā)對抗AIV的替代抗病毒藥是一種可能性。然而，RNAi介導(dǎo)劑的遞送仍然是限制其臨床應(yīng)用的障礙。Transkingdom RNAi(tkRNAi)利用非致病性細(xì)菌來產(chǎn)生siRNA并將siRNA遞送到靶組織，并且可能是獲得RNAi方法的臨床應(yīng)用的關(guān)鍵。構(gòu)建tkRNAi載體(抗AIV載體)以產(chǎn)生靶向病毒基因NP或PA的siRNA，并在已建立的禽類組織模型中評價這些載體的保護性功效。還運用載體的組合(“混合物”)來研究靶向多個AIV mRNA的附加效應(yīng)。首先在用帶有紅色熒光蛋白標(biāo)簽的載體處理的雞LMH細(xì)胞中驗證載體攝取和侵襲。接著，將細(xì)胞用抗AIV載體處理并用兩種不同的LPAI亞型H8N4和H6N2感染。以日為控制變量的多變量線性回歸分析揭示了用所述抗AIV載體處理的樣品和那些未處理的樣品之間校正平均脫落滴度的顯著差異(p<0.05)。靶向NP和PA這兩個基因的載體混合物在雞LMH細(xì)胞上清液中提供了高達(dá)10,960倍的脫落滴度降低(p<0.05)。該工作演示了在已建立的禽類組織模型中利用這些新型抗AIV載體抑制AIV的概念的體外證據(jù)。該工作代表了在禽類模型中利用所述tkRNAi系統(tǒng)和抑制流感復(fù)制的第一個這樣的實例。

材料和方法

細(xì)胞培養(yǎng)–基于前面在實施例1中的工作，雞肝細(xì)胞癌上皮(LMH)細(xì)胞和Madin-Darby犬腎(MDCK)細(xì)胞分別用于所有的侵襲和感染以及病毒滴度試驗。將細(xì)胞保持在如前面所述并略加修改的適當(dāng)?shù)纳L培養(yǎng)基中。為了使所述抗AIV載體在侵襲步驟期間的宿主補體滅活最小化，將LMH細(xì)胞一直在含有熱滅活的FBS(Life Technologies)的培養(yǎng)基中生長。這是為了避免因響應(yīng)于細(xì)菌的存在而可能引起的補體旁路途徑的激活，導(dǎo)致細(xì)菌載體在細(xì)胞內(nèi)攝取之前失活。

病毒–選擇下列LPAI禽流感病毒株用于所有的侵襲和感染研究：A/雞/德克薩斯/473-2/10(H6N2)和從2005年科羅拉多的火雞爆發(fā)中分離的LPAI亞型H8N4。每種LPAI的病毒滴度通過TCID₅₀試驗來測量。這兩種病毒在48個感染后小時數(shù)(hpi)時在有CPE的LMH細(xì)胞中復(fù)制到高滴度。如前面所述，產(chǎn)生儲液并選擇最佳MOI。

雞細(xì)胞中β-1整合素的驗證–因為禽類組織是tkRNAi的新靶標(biāo)，在正常條件下(未感染)和AIV感染后的LMH細(xì)胞表面上β(1)整合素受體的存在對于驗證是重要的。從未感染的(正常生長條件)LMH細(xì)胞培養(yǎng)物以及從用H8N4病毒感染后6和24小時的培養(yǎng)物提取總RNA(總RNA試劑盒I，Omega Bio-Tek)。利用寡聚(dT)引物(Promega)從0.75μg的總RNA合成第一鏈cDNA，并利用4mM dNTP和AffinityScript多溫度逆轉(zhuǎn)錄酶試劑盒(Stratagene)根據(jù)制造商的推薦完成所述cDNA合成。管家基因β-肌動蛋白用作LMH細(xì)胞中β(1)整合素表達(dá)的內(nèi)部控制。β-肌動蛋白和β(1)整合素的引物以前已發(fā)表(Caprile等2009)，利用的是GenBank雞序列。常規(guī)PCR擴增利用25μl反應(yīng)來完成，其含有：2.5μl cDNA，0.8mM dNTP，1.6mM MgCl₂，2.5μl 10X Amplitaq Gold緩沖液II，0.8U Taq DNA聚合酶(Applied Biosystems)，以及0.4μM正向和反向引物。各反應(yīng)用30μl Chill蠟(Bio-Rad)覆蓋以防止蒸發(fā)并放入MJ Research 60個位置的熱循環(huán)儀(Bio-Rad)中。將PCR反應(yīng)混合物在95溫育10分鐘以及35個下述的循環(huán)：95℃30秒，57℃60秒，和72℃20秒。PCR產(chǎn)物通過利用DNA系統(tǒng)(Lonza Group Ltd)的瓊脂糖凝膠電泳來分析。擴增的產(chǎn)物通過紫外光透照來可視化，并且將100堿基對(bp)分子量階梯狀標(biāo)志物(Lonza Group Ltd)在所述凝膠上一體運行以幫助計算擴增的DNA片段的大小。β-肌動蛋白和β(1)整合素的預(yù)期條帶大小分別是282和308bp。

tkRNAi shRNA載體的構(gòu)建和產(chǎn)生–以前已經(jīng)描述了ShRNA表達(dá)載體pmbv43(Buttaro and Fruehauf 2010)。Pmbv43包含由T7啟動子驅(qū)動的表達(dá)盒以及含有BamHI和SalI限制酶序列的克隆位點。在收到來自Cambridge Biolabs(Cambridge，MA)的親本_pmbv43質(zhì)粒后，將所述質(zhì)粒在50μl反應(yīng)中37℃下消化2小時，所述反應(yīng)含有：2μg pmbv43，2.0μl BamHI(New England Biolabs(NEB))，2.0μl SalI(NEB)，5.0μl緩沖液3(NEB)，0.5μl100X牛血清白蛋白(NEB)，和24.2μl分子水。消化的親本_pmbv43隨后用小牛腸堿性磷酸酶(NEB)處理并用苯酚/氯仿和乙醇沉淀。由此產(chǎn)生的8.4kb線性親本_pmbv43質(zhì)粒從凝膠電泳之后的1％瓊脂糖凝膠中進行凝膠提取并利用透析分離。

靶向NP序列的RNAi是5’-GGA TCT TAT TTC TTC GGA G-3’(SEQ ID.NO.1)，并且靶向PA序列的RNAi是5’-GCA ATT GAG GAG TGC CTG A-3’(SEQ ID NO.2)。NP的互補/反義序列是5’-CTC CGA AGA AAT AAG ATC C–3’(SEQ ID NO.3)，并且PA的互補/反義序列是5’–TCA GGC ACT CCT CAA TTG C–3’(SEQ ID NO.4)。編碼NP和PA特異性shRNA的DNA模板是：BamHI位點-正義序列-發(fā)夾環(huán)(5’-TTC AAG AGA-3’)-反義序列-TTTTTTTTTT-SalI位點。換句話說，編碼NP特異性shRNA的DNA模板是沒有poly-T尾的5’-GGA TCT TAT TTC TTC GGA GTT CAA GAG ACT CCG AAG AAA TAA GAT CC–3’(SEQ ID NO.5)和有poly-T尾的5’-GGA TCT TAT TTC TTC GGA GTT CAA GAG ACT CCG AAG AAA TAA GAT CCT TTT TTT TTT–3’(SEQ ID NO.6)。并且編碼PA特異性shRNA的DNA模板是沒有poly-T尾的5’-GCA ATT GAG GAG TGC CTG ATT CAA GAG ATC AGG CAC TCC TCA ATT GC-3’(SEQ ID NO.7)和有poly-T尾的5’-GCA ATT GAG GAG TGC CTG ATT CAA GAG ATC AGG CAC TCC TCA ATT GCT TTT TTT TTT-3’(SEQ ID NO.8)。

整合的DNA技術(shù)合成了PA DNA寡核苷酸序列的上鏈和下鏈。將各PA寡核苷酸重懸浮到300μM并將120μM的每條鏈在20μl反應(yīng)中一起退火。退火后，將雙鏈體磷酸化并在10μl反應(yīng)中在4℃下經(jīng)24小時連接成線性pmbv43，所述反應(yīng)含有：1μl T4DNA連接酶緩沖液(NEB)，1μl退火和磷酸化的PA寡核苷酸，2μl pmbv43，1μl T4DNA連接酶(NEB)，和5μl分子水。將由此產(chǎn)生的連接混合物轉(zhuǎn)化到DH5α^TM感受態(tài)細(xì)胞(Life Technologies)中，并將由此產(chǎn)生的轉(zhuǎn)化細(xì)胞鋪在含有10μg/ml卡那霉素(Kan)的Luria肉湯(LB)板上并在37℃溫育過夜。由此產(chǎn)生的菌落通過利用PA_shRNA特異性引物的PCR根據(jù)以下熱方案擴增209bp產(chǎn)物來篩選：944分鐘，30個下述的循環(huán)：94℃30秒、45℃30秒、72℃30秒，以及最后在72℃延伸10分鐘。利用HiPure Plasmid Maxiprep試劑盒(Life Technologies)純化單個PCR陽性PA_pmbv43質(zhì)?？寺〔ζ溥M行測序以驗證正確的PA_shRNA插入。利用標(biāo)準(zhǔn)的克隆和質(zhì)粒純化方法，所述NP_pmbv43質(zhì)粒被商業(yè)合成，利用DH10-β細(xì)胞產(chǎn)生，并由商業(yè)股份有限公司DNA 2.0純化。在收到NP_pmbv43后，將質(zhì)粒重懸浮在分子水中，終濃度為100ng/μl。將NP_pmbv43、PA_pmbv43和親本_pmbv43轉(zhuǎn)化到CEQ221感受態(tài)細(xì)胞中(NP_pmbv43/CEQ，PA_pmbv43/CEQ，和親本_pmbv43/CEQ載體)并在含有25μg/ml Kan和50μg/ml 2,3-二氨基丙酸的腦心浸液(Brain Heart Infusion)瓊脂(BHI/Kan/Dap)上鋪板。將板在37℃溫育過夜，并且由此產(chǎn)生的菌落通過利用NP、PA和親本_shRNA特異性引物組的PCR進行篩選。對代表NP_pmbv43/CEQ、PA_pmbv43/CEQ和親本_pmbv43/CEQ的單個PCR陽性克隆進行測序。在序列驗證之后，隨后將各克隆在BHI/Kan/Dap肉湯中增殖。在對數(shù)中期(OD₆₀₀＝0.4-0.6)和靜止期(OD₆₀₀＝1.0)產(chǎn)生儲液，并在20％甘油中凍回-80℃。將來自代表OD₆₀₀＝1.0的各載體儲液的單個冷凍等分試樣解凍以用于板計數(shù)。簡單地說，解凍各1ml的等分試樣，以5,000x g離心5分鐘，并在1ml含有100μg/ml Dap的磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)(PBS/Dap)中重懸浮。將由此產(chǎn)生的載體在PBS/Dap中以1:10、1:100、1:1,000、1:10,000、1:60,000、1:90,000、1:135,000、1:270,000稀釋。將來自代表1:60,000-1:270,000的各理論稀釋度的總共50μl在BHI/Kan/Dap瓊脂上以一式兩份鋪板并在37℃溫育過夜。將各稀釋度下的菌落計數(shù)平均并用于計算每ml的總體菌落形成單位(CFU/ml)。這些計數(shù)值代表了NP_pmbv43/CEQ(anti-AIV_NP)、PA_pmbv43/CEQ(anti-AIV_PA)和親本_pmbv43/CEQ(抗-AIV_亂序)載體儲液的適當(dāng)可行的CFU/ml濃度。這種系統(tǒng)允許在所有將來的體外侵襲試驗中直接解凍和使用等分試樣。

除了所述NP和PA構(gòu)建物之外，還創(chuàng)造了下列PB1和PB2序列的構(gòu)建物：PB1(5’–GAT CTG TTC CAC CAT TGA A–3’)(SEQ ID NO.11)和PB2(5’–CGG GAC TCT AGC ATA CTT A–3’)(SEQ ID NO.12)。PB1的互補/反義序列是5’-TTC AAT GGT GGA ACA GAT C–3’(SEQ ID NO.13)，并且PA的互補/反義序列是5’–TCA GGC ACT CCT CAA TTG C–3’(SEQ ID NO.14)。編碼PB1和PB2特異性shRNA的DNA模板是：BamHI位點-正義序列-發(fā)夾環(huán)(5’-TTC AAG AGA-3’)-反義序列-TTTTTTTTTT-SalI位點。換句話說，編碼PB1特異性shRNA的DNA模板是沒有poly-T尾的5’–GAT CTG TTC CAC CAT TGA ATT CAA GAG ATT CAA TGG TGG AAC AGA TC–3’(SEQ ID NO.15)和有poly-T尾的5’-GAT CTG TTC CAC CAT TGA ATT CAA GAG ATT CAA TGG TGG AAC AGA TCT TTT TTT TTT–3’(SEQ ID NO.16)。并且編碼PB2特異性shRNA的DNA模板是沒有poly-T尾的5’–CGG GAC TCT AGC ATA CTT ATT CAA GAG ATA AGT ATG CTA GAG TCC CG-3’(SEQ ID NO.17)和有poly-T尾的5’-CGG GAC TCT AGC ATA CTT ATT CAA GAG ATA AGT ATG CTA GAG TCC CGT TTT TTT TTT-3’(SEQ ID NO.18)。還設(shè)想了，所述正義和反義序列在構(gòu)建物內(nèi)的次序可以是顛倒的，使得所述次序是BamHI位點-反義序列-發(fā)夾環(huán)(5’-TTC AAG AGA-3’)-正義序列-TTTTTTTTTT-SalI位點，但是優(yōu)選首先放置所述正義序列。另外，設(shè)想了可以使用長度在3到23個核苷酸之間變化的其他發(fā)夾環(huán)序列，包括具有3、4、5、6、7、9、或23個核苷酸的發(fā)夾環(huán)。因此，所述正義和反義序列可以被具有3、4、5、6、7、9、或23個核苷酸長度的一段發(fā)夾環(huán)核苷酸(以及3到23個核苷酸之間的任何數(shù)量的核苷酸)隔開。還設(shè)想了所述shRNA/siRNA的長度可以變化，取決于靶mRNA序列的組成，所生成的siRNA的長度變異可高達(dá)約30個核苷酸。最后，設(shè)想了可以構(gòu)建載體以產(chǎn)生超過一種siRNA，從而靶向超過一種AIV mRNA，或利用單個載體靶向在給定AIV mRNAm內(nèi)的多個序列。然而，從單個質(zhì)粒產(chǎn)生多種siRNA可導(dǎo)致所述siRNA的不同等的轉(zhuǎn)錄。

tkRNAi載體的細(xì)胞內(nèi)攝取–為了驗證細(xì)菌攝取和細(xì)胞內(nèi)侵襲到LMH細(xì)胞中，使抗AIV_亂序載體帶有紅色熒光蛋白(RFP)標(biāo)簽。簡單地說，利用標(biāo)準(zhǔn)轉(zhuǎn)化方法，將抗AIV_亂序載體與RFP原核表達(dá)載體pE2-Crimson(Clontech)共轉(zhuǎn)化。選擇這種RFP是因為它是具有快速成熟、高度光穩(wěn)定性、降低的細(xì)胞毒性的遠(yuǎn)紅熒光蛋白，并且從lac啟動子表達(dá)以允許RFP表達(dá)的IPTG活化(Bevis和Glick 2002)。在所述抗AIV_亂序_RFP載體(RFP載體)生長后，如前面所述產(chǎn)生儲液并計數(shù)。將LMH細(xì)胞在侵襲前一天接種在8-孔腔室載玻片中以使細(xì)胞單層達(dá)到60％匯合。在載體侵襲當(dāng)日，解凍RFP載體的1ml等分試樣，以5,000x g離心5分鐘，并重懸浮于PBS/Dap中。然后將所述RFP載體放在冰上并在含有2mM L-谷氨酰胺和50μg/ml Dap的Waymouth's MB 752/1培養(yǎng)基中以1:4連續(xù)稀釋，以5e7CFU/ml開始并在7.8e5CFU/ml時結(jié)束。為了制備用于侵襲的LMH細(xì)胞并從所述生長培養(yǎng)基中去除抗生素，吸出培養(yǎng)基并且將每個孔用含有2mM L-谷氨酰胺和50μg/ml Dap的新鮮Waymouth's MB 752/1培養(yǎng)基(侵襲培養(yǎng)基)洗滌兩次。吸出沖洗培養(yǎng)基并向適當(dāng)?shù)目滋砑?ml各稀釋度的RFP載體并使其在37℃和7％CO₂存在下溫育2小時。對于每個腔室載玻片試驗，包括一個未處理孔(Waymouth's MB 752/1完全培養(yǎng)基)、一個假侵襲對照孔(只有侵襲培養(yǎng)基)和一個非RFP侵襲對照孔(3.1e6CFU/ml的抗AIV_亂序載體)。在溫育2小時后，吸出侵襲培養(yǎng)基并且將孔用Waymouth's MB 752/1完全培養(yǎng)基洗滌兩次，然后替換新鮮的Waymouth's MB 752/1完全培養(yǎng)基并讓細(xì)胞繼續(xù)再溫育2-24小時。為了固定細(xì)胞，吸出生長培養(yǎng)基并且將孔用無鈣/鎂的PBS沖洗兩次。從所述載玻片去除所述腔室并向每個孔格添加10μl有DAPI的Gold抗褪色試劑(Life Technolgies)并將所述載玻片安裝上蓋玻片。將由此產(chǎn)生的載玻片在沒有紫外光下在室溫下溫育24小時，然后利用Eclipse Ti倒置熒光顯微鏡(Nikon Instruments Inc.)在40X放大倍數(shù)下捕獲圖像。使用DAPI和CY5濾光塊，分別利用461和670發(fā)射來將所述DAPI和RFP熒光團可視化。

最佳tkRNAi載體濃度–為了確定不伴隨引起CPE的可允許的最佳載體濃度，將LMH細(xì)胞在侵襲前一天接種在24-孔板中以使細(xì)胞單層達(dá)到80％匯合。如前面所述制備抗AIV_亂序載體，并將其在侵襲培養(yǎng)基中稀釋到5e7、1.25e7、3.1e6和7.8e5CFU/ml。如上所述準(zhǔn)備LMH細(xì)胞用于侵襲。吸出沖洗培養(yǎng)基并向適當(dāng)?shù)目滓砸皇饺萏砑?ml各稀釋度的抗AIV_亂序載體，并使其在37℃和7％CO₂存在下溫育2小時。每個板包括未處理孔(Waymouth's MB 752/1完全培養(yǎng)基)和假侵襲孔(只有侵襲培養(yǎng)基)。在溫育2小時后，吸出侵襲培養(yǎng)基并且將孔用Waymouth's MB 752/1完全培養(yǎng)基洗滌兩次，然后替換新鮮的Waymouth's MB 752/1完全培養(yǎng)基并讓細(xì)胞繼續(xù)再溫育24-48小時。在侵襲后多個時間點，觀察孔的CPE視覺征象，與未處理的對照孔比較。選擇不引起CPE的可允許的最大抗AIV_亂序載體濃度用于在LMH細(xì)胞中的所有后續(xù)抗AIV_NP和抗AIV_PA侵襲試驗。

使用tkRNAi shRNA載體的雞細(xì)胞侵襲–在侵襲前一天將LMH細(xì)胞接種在24-孔板中，以讓細(xì)胞單層達(dá)到80％匯合。在載體侵襲當(dāng)日，解凍抗AIV_NP、抗AIV_PA和抗AIV_亂序載體的1ml等分試樣，以5,000x g離心5分鐘，并重懸浮于PBS/Dap中。然后將各載體放在冰上并適當(dāng)稀釋用于侵襲試驗。如前面所述準(zhǔn)備LMH細(xì)胞用于侵襲?？滓砸皇饺葸M行測試并包括抗AIV_NP、抗AIV_PA、抗AIV_亂序、和抗AIV_NP+抗AIV_PA載體的混合物(抗AIV_混合物)。因此，“混合物”是攜帶抗AIV_NP載體的大腸桿菌和攜帶抗AIV_PA載體的大腸桿菌的1:1混合物。還以一式三份包括對照孔(假侵襲和未處理的)。在溫育2小時后，洗滌LMH細(xì)胞(如前面所述的)和替換新鮮的Waymouth's MB 752/1完全培養(yǎng)基。

病毒感染–在侵襲后24小時，通過去除所述生長培養(yǎng)基并用含有0.25μg/ml TPCK的IM洗滌每個孔來準(zhǔn)備LMH細(xì)胞用于感染，如前面所描述的。去除洗滌液并向每個適當(dāng)?shù)目滋砑涌偣?50μl的IM，所述IM含有MOI為0.01或0.001的H8N4或H6N2病毒。將板在搖擺平臺上在37℃和7％CO₂存在下溫育1小時，然后去除所述病毒并用750μl/孔的新鮮IM替換。在48hpi收獲細(xì)胞培養(yǎng)上清液，離心，并在-80℃下冷凍。每個實驗包括陽性對照(AIV感染)、陰性對照(未處理的)和假侵襲對照(假侵襲+AIV感染)，各自以一式三個孔測試。

感染性病毒滴度評價–利用TCID₅₀/ml計算，通過按前面所描述的對MDCK細(xì)胞進行終點滴定來定量LMH細(xì)胞培養(yǎng)上清液。簡單地說，將收獲的上清液解凍，稀釋十倍，并將100μl/孔的病毒懸液以一式三份覆蓋到接種有MDCK的96孔板中。在48hpi時，將細(xì)胞用結(jié)晶紫染色并將有CPE的孔記分為病毒生長陽性。TCID₅₀/mL通過Reed和Muench數(shù)學(xué)技術(shù)來計算(Reed和Muench 1938)。

統(tǒng)計分析–所有實驗在不同日重復(fù)最少三次。利用0.05的統(tǒng)計顯著性水平，進行Wilcoxon秩和檢驗以比較在同一天進行的載體處理樣品和未處理的陽性對照(PC)樣品之間的中位病毒滴度。為了確定載體處理樣品和PC樣品之間的校正平均LogTCID₅₀/mL值是否有統(tǒng)計差異(p<0.05)，利用以日為控制變量的多變量線性回歸來分析數(shù)據(jù)。利用統(tǒng)計計算軟件Stata 10(Statcorp LP)進行統(tǒng)計分析。

結(jié)果

驗證tkRNAi載體在雞細(xì)胞中的細(xì)胞內(nèi)攝取–當(dāng)細(xì)菌的表面蛋白侵襲素與宿主受體β(1)整合素相互作用時，通過受體介導(dǎo)的胞吞行使上皮細(xì)胞對所述tkRNAi載體的攝取。因此重要的是驗證在正常生長條件期間和在用AIV感染期間，雞LMH細(xì)胞中β(1)整合素的存在和穩(wěn)定表達(dá)。在RNA提取和cDNA合成之后，觀察β(1)整合素在使用正常生長條件生長的LMH細(xì)胞中以及在用H8N4病毒(MOI 0.01)感染的細(xì)胞中在感染后6和24小時的表達(dá)(圖2)。這些結(jié)果表明，所述tkRNAi載體應(yīng)恰當(dāng)?shù)馗街贚MH細(xì)胞，即使當(dāng)所述細(xì)胞在感染后顯示出CPE和病變的跡象時。使所述抗AIV_亂序載體帶有RFP標(biāo)簽驗證了在侵襲后2和24小時LMH細(xì)胞內(nèi)部的細(xì)胞內(nèi)表達(dá)(圖3)。不引起CPE的可允許的最大RFP載體濃度是7.8e5CFU/ml。因此，所有后續(xù)的實驗都采用該載體濃度。總之，這些結(jié)果表明所述tkRNAi遞送平臺適合于雞上皮細(xì)胞。

TkRNAi shRNA載體在雞細(xì)胞中的抗病毒活性–前面顯示了所述NP和PA siRNA序列以100％同源性與所述H8N4和H6N2NP和PA序列對其并且沒有與任何已知雞序列的任何脫靶匹配。在用H6N2或H8N4病毒感染之前，將LMH細(xì)胞首先用載體處理并在感染之后收集培養(yǎng)上清液用于TCID₅₀分析。

正如所料，各載體的抗病毒活性按日而且按用于感染的病毒和MOI變化(圖4)。然而，在H6N2和H8N4二者感染的抗AIV_NP、抗AIV_PA和抗AIV_混合物樣品中，觀察到顯著的抗病毒活性。在至少一個實驗性試驗日，與相應(yīng)的PC樣品相比，在MOI 0.01的這兩種病毒下，抗AIV_NP、抗AIV_PA和抗AIV_混合物顯著降低中位病毒滴度。所述載體似乎在病毒MOI 0.001下具有略微不顯著的抗病毒效應(yīng)。盡管沒有顯著差異可能與樣本量小有關(guān)，但與其適當(dāng)?shù)奈刺幚鞵C相比，100％、89％和100％的所有NP、PA和抗AIV_混合物載體處理都分別導(dǎo)致中位病毒滴度降低。應(yīng)該注意，所述抗AIV_亂序載體也導(dǎo)致中位病毒滴度降低，其中有一些與PC樣品存在顯著差異(圖4)。

以日為控制變量，利用多變量線性回歸(MLR)分析，跨所有實驗日比較載體處理的LMH細(xì)胞與未處理的PC細(xì)胞。表2中示出了載體處理的樣品和未處理的PC樣品之間校正平均病毒滴度的顯著差異。MLR分析指出了在用H6N2和H8N4二者以MOI 0.01感染后，所有載體處理(除了抗AIV_亂序載體以外)和它們相應(yīng)的PC樣品之間的顯著差異。除了用H8N4MOI0.001感染之外，在所有實驗組中，所述混合物載體與適當(dāng)?shù)腜C滴度相比導(dǎo)致顯著降低的病毒滴度(p<0.05)。計算載體處理樣品和未處理樣品之間感染性病毒的log10降低。所有載體處理樣品產(chǎn)生至少0.8log10降低(降低6-倍)。最顯著的是來自NP(3.8log降低或降低6,918-倍)、PA(2.5log降低或降低331-倍)和抗AIV_混合物載體處理(4log降低或降低10,965倍)后MOI 0.01的H8N4感染以及抗AIV_PA載體處理后MOI 0.001的H8N4感染(3.0log降低或降低1,000-倍)。有趣的是，除了用H6N2以MOI 0.001感染之外，所述亂序載體在所有實驗組中也顯示出抗病毒活性(表2)。

表2–通過脫落滴度的log降低和降低倍數(shù)度量的在雞LMH細(xì)胞中的抗AIV載體保護

本實施例的目標(biāo)和它的教導(dǎo)的應(yīng)用是在用所述抗AIV載體處理LMH細(xì)胞后，提供不一定防止感染、但減少脫落到培養(yǎng)上清液中的感染性病毒的量的手段。用這些抗病毒載體體外處理顯著降低了用在家禽中分離的兩種不同AIV亞型H8N4和H6N2感染后的感染性滴度。在除了一個樣品組(H8N4/MOI 0.001)之外的全部樣品組中，所述混合物載體顯著降低病毒滴度。然而，即使當(dāng)沒有觀察到載體處理的樣品和未處理的PC樣品之間的顯著差異時，從所有載體處理的樣品組都觀察到感染性滴度的顯著log10降低。感染性病毒脫落的最強效抑制發(fā)生在LMH細(xì)胞用抗AIV_混合物處理并用H8N4或H6N2感染后，導(dǎo)致在1.7-4.0范圍內(nèi)的顯著log10降低(降低50-10,965倍)。

如上所述，用亂序載體處理也在除H6N2/MOI 0.001感染樣品組以外的全部樣品組中降低感染性滴度。對這種觀察結(jié)果有可能的解釋。先天免疫應(yīng)答是宿主早期防御機制的一部分。Toll樣受體(TLR)通過識別并結(jié)合作為宿主細(xì)胞感染的標(biāo)志物的細(xì)菌組分而在先天應(yīng)答中發(fā)揮關(guān)鍵作用。這些細(xì)菌組分，也稱為病原體相關(guān)分子模式(PAMP)，包括充當(dāng)免疫增強劑的內(nèi)毒素樣脂多糖(Bessler等1990)。這些抗AIV載體由非致病性大腸桿菌遞送，因此這些雞上皮細(xì)胞將可能通過TLR-4識別來察覺到這些細(xì)菌內(nèi)毒素的細(xì)胞外存在，是不意外的(Schoen等2004)。這種結(jié)合事件將導(dǎo)致炎性轉(zhuǎn)錄因子——核因子kappaβ的表達(dá)，并最終導(dǎo)致作為所述先天應(yīng)答的一部分的下游促炎性細(xì)胞因子和趨化因子的釋放。在這種情況下，這些細(xì)菌組分的作用可能非常像疫苗佐劑，從而在AIV感染之前刺激所述先天應(yīng)答并在本質(zhì)上設(shè)置對抗病毒感染的額外保護水平。

本實施例演示了概念的體外證據(jù)并顯示這些新型抗AIV載體在禽類組織模型中的抗病毒潛力。然而，該數(shù)據(jù)是否表明靶向NP和PA的抗AIV載體混合物可以顯著降低雞中的AIV脫落？這種方法能轉(zhuǎn)變成限制AIV在家禽中爆發(fā)和傳播的抗病毒技術(shù)嗎？再有，這能代表在其他物種中控制流感的變革性方法嗎？本工作代表了回答這些疑問的第一步。本研究的目標(biāo)是將所公開的預(yù)防藥開發(fā)成家禽的傳統(tǒng)AIV疫苗的新補充。因而，來自本工作的發(fā)現(xiàn)已經(jīng)被轉(zhuǎn)化為目的在于如下面緊接的實施例3中所述的在實驗性攻擊的雞中評估這些抗病毒載體的功效的工作。長期目標(biāo)是開發(fā)創(chuàng)新的抗流感預(yù)防藥，其將促進更有效和強大的家禽AIV控制方法的開發(fā)。

實施例3–用抗AIV載體預(yù)防性處理雞群

在面對AIV爆發(fā)時，幾個因素對于有效控制病毒在家禽之間和家禽之中蔓延是關(guān)鍵的。它們包括應(yīng)用控制方法或疫苗的速度、預(yù)防工作有多迅速地起到保護作用、和防御AIV的任何亞型或病毒株的能力。開發(fā)強有力的家禽抗流感技術(shù)是有效管理和控制這種疾病在全世界蔓延的關(guān)鍵步驟。以前的工作證明了使用靶向所述病毒NP和PA基因的新型抗AIV載體來體外降低病毒脫落滴度的價值，但還有待于使用實驗性攻擊的雞進行體內(nèi)測試。首先使用帶有熒光紅色蛋白標(biāo)簽以便可視化的載體評估載體攝取到雞呼吸組織中。一旦在雞中證明了載體攝取并且沒有載體相關(guān)的致病性，就用混合物載體(n＝10)、亂序載體(n＝10)或安慰劑(n＝10)處理商業(yè)雞組。24小時后，將所有雞用H6N2病毒攻擊。用抗AIV混合物載體預(yù)防性處理的雞與未處理的雞相比，脫落顯著更少的病毒(p<0.05)。同樣地，與未處理的雞相比，在抗AIV混合物處理的雞中脫落病毒的雞的比例顯著減少(p<0.05)。所述抗AIV混合物還防止AIV傳播到崗哨雞。本工作演示了利用這種新型RNAi抗病毒技術(shù)保護雞對抗AIV復(fù)制、病毒脫落和傳播的概念的體內(nèi)證據(jù)。

材料和方法

動物–四周齡商業(yè)來亨雞是由科羅拉多(Colorado)的商業(yè)養(yǎng)殖場惠贈的并安置在生物安全2級設(shè)施中。到達(dá)后，通過盲法選擇放在盒子中的顏色編碼的腿帶，將禽隨機分派到處理組。到達(dá)當(dāng)天，從臂靜脈收集血液并取得口咽(OP)拭子以利用血清學(xué)測試和實時RT-PCR驗證無AIV狀態(tài)。依照實驗動物護理和使用指南(Guide for the Care and Use of Laboratory Animals)，將禽組安置在包含分開的12平方英尺隔間的房間中。保持負(fù)壓氣流以防止隔間之間的交叉污染，因此在整個研究過程期間，房間中間過道的空氣是正壓的。允許雞組在每個隔間內(nèi)自由走動并且隨意接近飼料和水。將室溫保持在70°F并控制每天照明以允許足夠時間進行日間活動和休息。各實驗的動物護理在科羅拉多州立大學(xué)(Colorado State University)的IACUC委員會批準(zhǔn)下進行。為了給雞適應(yīng)它們新環(huán)境的時間，在到達(dá)以后至少4天才開始所有的實驗研究。

病毒–LPAI A/雞/德克薩斯/473-2/10(H6N2)由在IA，Aimes的美國國立獸醫(yī)服務(wù)實驗室(United States National Veterinary Services Laboratory)(NVSL)惠贈。選擇H6N2病毒是由于它從2010年德克薩斯州(Texas)發(fā)生的爆發(fā)期間收集的雞呼吸拭子分離出來的歷史。將所述病毒在10-日胚齡的無特定病原體(SPF)的雞蛋的尿囊腔中在37℃下增殖和滴定2天。簡單地說，在病毒生長后，收獲羊膜尿囊液(AAF)并合并以代表單一病毒儲液。為了滴定所述病毒，將所述儲液的等分試樣在含有1X抗生素混合物(2000U/ml青霉素G，4mg/ml鏈霉素，16μg/ml慶大霉素，100U/ml制霉菌素，650μg/ml卡那霉素)的腦心浸液肉湯(BHI)中從1:10至1:10¹⁰十倍稀釋，并在各稀釋度用0.1ml接種3SPF蛋。收獲AAF，并根據(jù)Reed和Muench數(shù)學(xué)公式計算50％蛋感染性滴度(EID₅₀/ml)。

載體施用–產(chǎn)生載體儲液并以適當(dāng)?shù)腃FU/ml濃度(如前面所述)凍回，因此額外的生長和計數(shù)不是必要的。這本質(zhì)上允許將載體等分試樣直接用作適合于直接施用于禽類的處理劑量。簡單地說，將適當(dāng)體積的載體儲液解凍，以5,000x g離心5分鐘，并重懸浮在含有50μg/ml 2,3-二氨基丙酸(Dap)的PBS中。所述混合物載體表示相等濃度(CFU/ml)和相等體積(基于總劑量體積)的NP(NP_pmbv43/CEQ)和PA(PA_pmbv43/CEQ)載體。將所述載體在冰上運輸?shù)桨仓盟鲭u的設(shè)施。載體通過鼻內(nèi)途徑來施用(0.3-0.5ml/禽)。在給藥期間溫柔地約束每只雞并在每個鼻孔中施用等體積。將所述禽再約束一分鐘以防止打噴嚏并讓所述載體沉降到鼻組織中以便有效侵襲。

病毒攻擊–為了在實驗環(huán)境中模仿AIV的天然感染途徑，在5周(±4天)齡時用10⁶EID₅₀/0.1ml H6N2病毒溶液對雞進行接種。在接種之前，將病毒在無菌PBS中稀釋到預(yù)定劑量并冷藏直到準(zhǔn)備攻擊。在攻擊期間，每個動物被溫柔地約束，同時受過訓(xùn)練的人員將50μl病毒接種到每個鼻孔中。在攻擊后，將每只禽再約束一分鐘以防止打噴嚏并讓所述病毒沉降到鼻組織中以便有效感染。每天評估雞的臨床病癥。

數(shù)據(jù)和樣品收集–在載體和/或病毒接種后，利用臨床病癥(0-4)評分系統(tǒng)每天檢查雞：1＝因?qū)︼暳先狈εd趣、行動緩慢、對外界環(huán)境反應(yīng)低下的輕度嗜睡跡象；2＝輕度呼吸道疾病(張口呼吸，吸鼻(snicking)，打噴嚏)，伴有輕度嗜睡；3＝中度呼吸道疾病(吸鼻，打噴嚏，輕咳，呼吸粗重)，伴有中度嗜睡；和4＝重度呼吸道疾病(咳嗽，打噴嚏，呼吸困難)，伴有缺少進食以及行動或?qū)ν饨绛h(huán)境的反應(yīng)有限。在用H6N2病毒攻擊后，在2、3、4、5、6、7、和10個感染后天數(shù)(dpi)時從感染的禽收集OP拭子。將拭子立即在含有1ml腦心浸液(BHI)肉湯儲存培養(yǎng)基并放在冰上的falcon管中浸泡和漂洗。收集所述拭子的人員在組之間更換手套和靴子以避免潛在的交叉污染。將樣品儲存在-70℃，直到后來的逆轉(zhuǎn)錄酶定量實時PCR(RT-qPCR)。在適當(dāng)?shù)臅r間，將禽通過CO₂安樂死并在尸檢時收集組織以評估RFP載體攝取、載體相關(guān)的致病或病毒感染。

通過RT-qPCR檢測病毒脫落–對在整個感染期間收集的所有OP拭子樣品進行處理以用于RT-qPCR，從而測定H6N2病毒滴度。簡單地說，利用Trizol LS(Life Technologies，Grand Island，NY)和MagMAX 96AI/ND病毒RNA分離試劑盒(Life Technologies)與KingFisher磁粒子處理器(Thermo Scientific，Waltham，MA)，從50μl的OP拭子樣品提取總RNA。利用ABI 7500平臺(Applied Biosystems)并用先前描述的對禽流感基體基因中的保守序列而言特異性的引物和探針(Spackman等2002)并按照NVSL規(guī)程AVSOP1521.01進行RT-qPCR。引物和探針序列如下：正向引物(5′-AGA TGA GTC TTC TAA CCG AGG TCG-3′)，反向引物(5′-TGC AAA AAC ATC TTC AAG TCT CTG-3′)，和5′報告染料(5’-6-羧基熒光素[FAM])(5′-FAM-TCA GGC CCC CTC AAA GCC GA-TAMRA-3′)3’報告染料(6-羧基四甲基羅丹明[TAMRA])標(biāo)記的探針。RT步驟條件是在50℃下30min和在94℃下15min，接著是45個在94℃下0s和在60℃下20s的循環(huán)。利用H6N2儲液病毒的從1:10至1:10¹⁰的10倍稀釋液系列，以一式三份產(chǎn)生用于病毒定量的標(biāo)準(zhǔn)曲線，由此可以計算每個RNA樣品的EID₅₀當(dāng)量/ml(EID₅₀eq/ml)樣品培養(yǎng)基。測得檢測限是10¹EID₅₀/ml(1log₁₀EID₅₀/ml)/反應(yīng)。

血清學(xué)–在到達(dá)安置設(shè)施后，從所有的禽收集的血清通過瓊脂凝膠免疫擴散(AGID)試驗進行測試并顯示出對任何A型流感病毒抗原呈抗體陰性。將感染的雞在感染后第10日取血并再次利用AGID試驗測試血清。

統(tǒng)計分析–描述性統(tǒng)計包括帶95％置信區(qū)間(CI)的中位病毒滴度、滴度峰值和范圍、脫落病毒的雞的比例、和脫落滴度的降低倍數(shù)。脫落病毒的雞的比例的差異利用費舍爾精確檢驗(Fisher's exact test)來分析(p<0.05)。處理和未處理的雞之間中位病毒滴度差異利用Wilcoxon秩和檢驗來分析(p<0.05)。利用以日為控制變量的多變量線性回歸(MLR)確定來自從載體處理和未處理的PC雞收集的OP樣品的校正中位Log EID₅₀eq/ml值是否有統(tǒng)計差異(p<0.05)。利用對數(shù)回歸分析確定處理的雞與未處理的PC雞相比在單日以及跨所有天數(shù)的脫落比值比(OR)(p<0.05)。利用統(tǒng)計計算軟件Stata 10(Statcorp LP)進行統(tǒng)計分析。

實驗設(shè)計–本工作包括三個初始的試驗性研究，每個都需要禽的比較性檢查，以便驗證抗AIV載體攝取到雞呼吸組織中、確定正確的抗AIV載體劑量、和驗證H6N2病毒適合于攻擊雞。來自這些試驗性的探索性實驗的發(fā)現(xiàn)結(jié)果是計劃所描述的體內(nèi)工作的第四部分——最后的概念證據(jù)(POC)研究的重要組成部分。由于樣本量有限并且缺乏檢驗力，來自所述初始的試驗性研究的發(fā)現(xiàn)結(jié)果不用于推廣到雞群。

試驗性研究1：將兩組各兩只雞安置在分開的隔間中并在500μl的單劑量中施用1.6e8CFU的所述RFP載體(親本_pmbv43/CEQ_RFP，如前面所述)。每組的兩只雞在RFP載體處理后15和27小時通過吸入CO₂安樂死。在尸檢時收集呼吸組織，包括鼻竇、氣管、咽和肺，并類似地收集每只動物的腺胃。在三個小時之內(nèi)，這些組織準(zhǔn)備用于熒光顯微術(shù)，隨后的RFP表達(dá)觀察結(jié)果表明載體附著和細(xì)胞內(nèi)攝取。簡單地說，將所述組織低溫冷凍并利用低溫恒溫器切片。利用具有DAPI的Gold抗褪色試劑將組織切片安裝在玻璃蓋玻片上并用蓋玻片覆蓋。在室溫下溫育24小時后，將載玻片保持在4℃，直至使用Eclipse Ti倒置熒光顯微鏡利用461和670發(fā)射來捕獲圖像。這種試驗性研究的目標(biāo)是驗證這些大腸桿菌是特異性靶向雞呼吸組織并向雞呼吸組織遞送抗AIV載體的適當(dāng)?shù)拿浇?。統(tǒng)計計算和檢驗力證明(power justification)不適用于確定實現(xiàn)與試驗性研究1有關(guān)的目標(biāo)所必需的雞數(shù)量。這些是定性觀察，目的不在于檢測所述兩個組之間測量到的效果的差異，而是對確定這些載體是否是雞呼吸組織的最佳遞送媒介感興趣。每組兩只雞的樣本量足以為所提議的分析提供多個組織樣品。

試驗性研究2：將兩組各五只雞安置在分開的隔間中并施用以下兩種劑量之一的所述亂序載體(親本_pmbv43/CEQ，如前面所述)：1.36e7或3.6e8CFU/500μl劑量。試驗性研究2需要一組五只雞來充當(dāng)未處理的對照組。這些雞被施用500μl的PBS/Dap并充當(dāng)基線以與臨床病癥得分和組織學(xué)比較。每天監(jiān)測雞的臨床病癥，載體處理的雞在第3天(n＝2)、第7天(n＝2)和第14天(n＝1)安樂死。未處理的對照禽在第3天(n＝1)、第7天(n＝2)和第14天(n＝2)安樂死。在尸檢期間，評估雞的指示細(xì)菌感染的致病和/或炎癥的大體征象，并收集鼻竇、氣管、咽、肺和腺胃組織。將組織在10％中性緩沖福爾馬林溶液中固定，切片，并用蘇木精和伊紅染色。該試驗性研究的目標(biāo)是驗證這些載體在所施用的兩種劑量下是耐受良好的，與未處理的組織相比，在處理后第3、7和14日沒有伴隨引起上皮損傷的大體或微觀征象。統(tǒng)計計算和檢驗力證明不適用于確定實現(xiàn)與試驗性研究2有關(guān)的目標(biāo)所必需的雞數(shù)量。這些是定性觀察，目的在于基于最低平均臨床病癥和上皮損傷的最小可觀察的大體或微觀征象，確定最高可耐受的載體劑量。每組五只雞的樣本量足以計算各組的平均臨床病癥得分。為了為最后的POC實驗確定最佳抗AIV載體劑量，試驗性研究2是必需的。

試驗性研究3：將一組十只雞用LPAI H6N2病毒攻擊。每天評價雞的臨床病癥并收集OP拭子以利用RT-qPCR檢測病毒脫落。在10dpi時，將雞安樂死。試驗性研究3的目的是通過臨床病癥得分和/或用RT-qPCR檢測來驗證雞在H6N2攻擊之后對感染的易感性。

概念證據(jù)(POC)：將安置在三個分開的隔間中的三組各十只雞以300μl劑量施用3.6e8CFU的載體或安慰劑。這些組包括組1＝抗AIV混合物載體，組2＝亂序載體，和組3＝陽性對照(PBS/Dap溶液)。所有的禽在處理后20小時(±2小時)通過鼻內(nèi)(IN)途徑用H6N2病毒攻擊。每天評價雞的臨床病癥并收集OP拭子。在10dpi時，將雞安樂死并尸檢以獲得疾病征象和收集鼻竇、氣管、咽、肺、肝和脾。將組織切片的一半在10％中性緩沖福爾馬林溶液中固定，而將剩下一半的新鮮組織儲存在-80℃。這項工作需要三組動物(每組n＝10)來統(tǒng)計確定用所述抗AIV載體處理的雞和未處理的陽性對照雞之間病毒脫落的差異。計算估算的樣本量，以利用前面指出的統(tǒng)計分析(Wilcoxon秩和檢驗，費舍爾精確檢驗，多變量線性回歸，和對數(shù)回歸)，在95％的顯著性水平下達(dá)到至少80％的檢驗力。最關(guān)鍵的測量結(jié)果是EID₅₀/ml，因為這個值代表病毒滴度，其指示病毒脫落。因此，檢驗力計算是基于預(yù)計的EID₅₀/ml測量結(jié)果。據(jù)估算，未處理的雞中平均病毒滴度是5.5log EID₅₀/ml，標(biāo)準(zhǔn)偏差(SD)±0.5log EID₅₀/ml(Swayne和Beck，2005)。對于本工作而言，病毒滴度降低至少5-倍(0.7log EID₅₀/ml差)被認(rèn)為是統(tǒng)計學(xué)顯著性的。因此，處理的雞的估算的平均病毒滴度是4.8log EID₅₀/ml，SD±0.5log EID₅₀/ml。計算的效應(yīng)量是1.4((最大平均值-最小平均值)/SD＝(5.5-4.8)/0.5)。利用Stata碼fpower，輸出表指示需要9至10之間的樣本量來達(dá)到在α＝0.05下檢驗力為0.8。樣本量為10足以證明與未處理的PC雞或亂序載體處理的雞相比，與用表達(dá)病毒特異性shRNA的混合物載體處理的雞相關(guān)的病毒脫落降低≥5-倍。

崗哨雞：將另外兩只4-周齡商業(yè)雞加到運輸?shù)娜粍游镏杏糜谧詈蟮腜OC研究。代替將這些額外的動物安樂死，它們被安置在H6N2攻擊的十只雞之中，這十只雞已另外接受抗AIV混合物載體。這些崗哨雞與這些感染動物直接接觸并共享相同的食物和水。使用這兩只崗哨雞的目的是監(jiān)測可能的傳播。

結(jié)果

RFP載體定位在雞呼吸組織中–在試驗性研究1中，在雞用所述RFP載體處理后15和27小時，動物被安樂死并收集組織。將這些組織準(zhǔn)備用于熒光顯微術(shù)并捕獲處理和未處理的組織的圖像。這種RFP由原核表達(dá)載體pE2-Crimson(Clontech)產(chǎn)生。這種熒光蛋白是很明亮的、光穩(wěn)定的、并且由于它在宿主細(xì)胞的細(xì)胞溶質(zhì)中的可溶性而沒有細(xì)胞毒性(Strack等2011)。選擇它還因為它的遠(yuǎn)紅激發(fā)和發(fā)射性質(zhì)，允許在這種紅色熒光信號和由于自發(fā)熒光產(chǎn)生的可能的背景之間進行區(qū)分。圖5中顯示，表達(dá)RFP的細(xì)菌看起來在這兩個時間點定位到鼻竇組織、氣管和肺的上皮。這與從PBS/Dap處理的雞收集的那些組織中缺乏可見的紅色表達(dá)形成對比。

最佳載體劑量和相關(guān)的致病性–在試驗性研究2中，雞被施用亂序載體的兩種劑量之一并觀察14天。在處理后1-14天之間，所有組中的禽都沒有顯示出任何痛苦或臨床病癥的征象。在這兩種載體劑量下，雞組在處理后第3(n＝2)、7(n＝2)和14日(n＝1)被安樂死，并且在尸檢時，所有組織與來自用安慰劑(PBS/Dap)處理的禽的組織相比看起來正常。在腺胃組織中沒有觀察到明顯的致病。組織學(xué)評估表明，當(dāng)與PBS/Dap處理的組織相比時，載體處理與呼吸組織致病不相關(guān)。組織學(xué)確實表明在一些處理和未處理的組織中存在少量潛在疾病，其可能在開始研究之前就已經(jīng)存在于這些商業(yè)雞中了。因此，難以確定疾病是否與所述載體、處理體積(500μl)有關(guān)，或者是否所述動物來自以前患病的群體。

為此，決定使用只給予較高載體劑量(3.6e8CFU/500μl劑量)的禽來重復(fù)這項工作，將所述禽與用500μl PBS/Dap處理的禽、未處理的禽相比、和從商業(yè)性經(jīng)營中新到的禽相比較。包括最后一組禽是為了確定在未處理的禽中發(fā)現(xiàn)的疾病是在到達(dá)之前就存在還是在到達(dá)安置設(shè)施后發(fā)展的疾病。簡單地說，向四個組的每組隨機分派兩只禽。除了新到的禽在到達(dá)時被安樂死和尸檢之外，將其余三個組中的禽用載體、PBS/Dap處理或什么也不處理并觀察14天。在第14日，所有禽被安樂死并尸檢。在尸檢時，任何組中的禽均未顯示出任何疾病或反常的征象，并且病理學(xué)者是盲法分析組織學(xué)載玻片的以去除任何潛在的偏倚。組織學(xué)揭示，任何禽的肺、氣管和肺泡中的病理或巨噬細(xì)胞浸潤都非常少，特別是在氣道和間質(zhì)組織中，所述病理或巨噬細(xì)胞浸潤會指示對載體或劑量體積的不良反應(yīng)。在一些所述組織中注意到有輕度的血管周圍炎癥，但在所有組中的出現(xiàn)是輕微和隨機的。此外，鑒于這些禽是商業(yè)的而不是SPF，這種出現(xiàn)并不異常。

對H6N2攻擊的易感性–在試驗性研究3中，將十只雞用H6N2病毒攻擊。收集OP拭子并記錄臨床病癥。雖然沒有預(yù)料到死亡，但發(fā)現(xiàn)一只雞在7dpi時死亡。在8dpi時，9只剩余的雞中有6只在AGID測試后是AIV血清陽性的，將雞在10dpi時安樂死。本試驗性研究的目的是驗證在實驗性攻擊后H6N2感染和脫落。因此，在3、4和5dpi時收集的OP拭子是利用RT-qPCR測試的第一組和唯一一組樣品。結(jié)果揭示了在3、4和5dpi時分別在7/10、10/10和8/10只雞中的脫落。該數(shù)據(jù)足以證實雞對H6N2攻擊的易感性，并且對其余樣品沒有進行進一步的RT-qPCR測試。

在實驗性攻擊的雞中的載體抗病毒活性–在最后的POC研究中，將禽組用所述混合物載體、亂序載體、或給定的安慰劑(PBS/Dap)預(yù)防性處理，然后用H6N2病毒感染。收集OP拭子并每天記錄臨床病癥。在8dpi時，PC組中的一只雞死亡。這是所有組中唯一的死亡。其余的雞在10dpi時被安樂死。在安樂死之前收集的血液揭示，混合物、亂序載體和PC雞中分別有4/10、6/10和6/9是AIV血清陽性的。H6N2攻擊產(chǎn)生亞臨床病癥，因為沒有雞出現(xiàn)任何明顯的疾病征象。因此，沒有使用所述臨床病癥評分系統(tǒng)并且不分析得分。

表3中顯示了通過與PC雞相比從載體處理的雞收集的總拭子中中位病毒滴度和陽性O(shè)P拭子的比例的累計降低來測量的載體保護。該原始數(shù)據(jù)表代表了在整個研究中的差異，沒有對日進行校正。顯示出在所述混合物處理的雞(1.5，95％CI＝0，3.0)和PC雞(4.1，95％CI＝2.8，4.8)之間中位滴度的顯著差異(Wilcoxon秩和，p<0.0001)。同樣地，在亂序載體處理的雞(3.2，95％CI＝0，3.9)和PC雞之間的中位滴度也有顯著差異(p＝0.003)。從所述混合物組收集的陽性O(shè)P拭子的比例36/70(51％)，與PC組的58/70(83％)相比有顯著差異(費舍爾精確檢驗，p<0.0001)。在亂序載體處理的禽(42/70，60％)和PC禽之間也觀察到這種顯著差異(p＝0.002)。雖然在這兩種測量中混合物組和亂序載體組之間累計中位滴度或陽性拭子的比例沒有顯著差異，但所述混合物組中抗病毒效應(yīng)更顯著。表3指示了載體保護，但沒有揭示在感染期間哪日存在這些顯著性差異。

表4示出了每天的載體保護。對于每個處理組，顯示了感染后每一日的滴度峰值和范圍、中位滴度、和脫落比例。對中位滴度的差異進行Wilcoxon秩和檢驗指示了混合物處理的雞和PC雞之間在感染后第3和4日的顯著差異。在所述亂序載體處理的雞和PC雞之間在任何一天都沒有觀察到中位滴度的顯著差異。在3dpi時，混合物組(5/10)與PC組(10/10)相比，禽脫落比例有顯著差異(p＝0.016)。然而，脫落比例的差異在亂序載體處理組和PC組之間在任何一天都不顯著。

圖6顯示了每日時間間隔下的中位H6N2病毒滴度和脫落病毒的雞的比例。觀察代表每組中所有雞(包括沒有脫落的那些)的按日繪制的中位滴度曲線，在混合物雞與在亂序載體和PC組中的那些雞之間脫落的病毒載量有不同的趨勢(圖6A)。在感染后第2和7日之間，所述亂序載體和PC組二者的中位滴度顯得上升，而混合物組中中位滴度下降并持續(xù)降低直至感染后第5日。所述混合物組中的滴度在6和7dpi時短暫上升，但脫落的病毒載量仍比從亂序載體和PC雞脫落的病毒載量低得多。當(dāng)將代表每組中脫落的那些雞的中位滴度按日繪圖時，觀察到的趨勢較不明顯(圖6B)。此處，每個中位滴度代表來自圖6C的每天的雞脫落的比例。除了感染后第3和10日之外，每日脫落的病毒的中位載量在混合物禽中比PC的脫落禽低。雖然觀察到的病毒滴度在所述混合物和PC組之間在這兩日具有這種明顯轉(zhuǎn)換，但重要的是要認(rèn)識到，在第3和10日，PC組(10/10和5/9)與混合物組(5/10和4/10)相比，仍有更多數(shù)量的禽在脫落(圖6C)。

正如所預(yù)期和觀察到的，來自各組禽的中位脫落滴度按日變化。在原始中位滴度之間觀察到顯著差異(表3)，然而為了確定跨感染后所有天數(shù)的顯著差異，有必要在分析中以日為控制變量。通過中位滴度降低測量的載體保護利用以日為控制變量的MLR來分析(表5)。不論是感染后哪天，與所述混合物(p<0.0001)雞相比和與所述亂序載體(p＝0.002)雞相比，PC雞中的中位滴度都具有顯著差異。在做出這點的大部分分析和比較中，與所述亂序載體處理相比，所述混合物處理保護往往更優(yōu)越。然而，利用MLR并以日為控制變量，這種差異是無顯著性的(p＝0.251)。

利用簡單和多元對數(shù)回歸分析來評估通過陽性對照雞與載體處理的雞相比脫落H6N2病毒的比值而測量的載體保護(表6)。對每個單日和以日為控制變量后(跨所有天數(shù))計算OR、95％CI、和顯著性水平(p<0.05)。除了3dpi之外，PC雞中單日的脫落比值與所述混合物或亂序載體處理的雞相比沒有顯著性。在感染后第3日，因為10/10(100％)PC雞在脫落病毒，所以不能計算脫落比值。當(dāng)以日為控制變量時，在PC雞之中脫落H6N2的比值與混合物處理的雞相比大4.83(95％CI＝2.17，10.72)(p<0.0001)。與所述亂序載體處理的雞相比，所述PC雞中跨所有天數(shù)脫落的可檢測到的病毒的比值稍低(3.48；95％CI＝1.57，7.86)，但仍然顯著(p＝0.003)。雖然不顯著，但在所述亂序載體組中跨所有天數(shù)的脫落病毒的比值比所述混合物組中脫落的比值大1.42(p＝0.303)。

表7中顯示了通過復(fù)制和脫落滴度的log降低和降低倍數(shù)而測量的載體保護。載體處理的雞和PC雞之間中位滴度(log EID₅₀eq/mL)的差異以log降低計算。利用幾何中位值，計算病毒滴度的降低倍數(shù)?？缢刑鞌?shù)(利用未校正的中位滴度)和為每個單日計算這兩種降低測量結(jié)果?？缢刑鞌?shù)，所述混合物處理與PC雞相比在病毒滴度上具有2.6中位log降低(降低398-倍)。在感染后的每個單日，所述混合物處理導(dǎo)致可測量的中位log降低。最顯著的是在感染后第3、4、5、6和7日，其中與所述PC雞相比，病毒脫落在2.5和3.8中位log降低(降低288至6309-倍)之間。病毒脫落的log降低在亂序載體處理的雞中不明顯得多。然而，總體仍然產(chǎn)生0.9中位log降低(降低7.9-倍)，并且在每個單日產(chǎn)生至少0.3中位log降低(降低1.8-倍)。所述亂序載體處理最顯著的是在感染后第10日(1.4中位log降低)，其代表在混合物組中觀察到的最小的有效降低，也在感染后第10日。

崗哨雞–將沒有接受過處理的雞(n＝2)與混合物處理的禽從載體施用時到H6N2攻擊后10日安置在一起。從這兩只禽中，只在引入后第7日檢出一個OP陽性拭子(1.5log EID50eq/mL)。在感染后第2日和第10日之間從這些崗哨禽收集的所有其他拭子都是陰性的?？偟膩碚f，從這些接觸禽收集的OP拭子中13/14(92.8％)是陰性的。

本研究利用所述tkRNAi遞送平臺首次顯示了有效遞送和細(xì)菌介導(dǎo)的向禽類鼻竇、氣管和肺組織的侵襲。在兩個時間點，即處理后15和27小時評估RFP載體攝取。在遞送和侵襲到雞呼吸組織后，這些載體能有多長時間向這些非吞噬性上皮細(xì)胞接受體主動供應(yīng)shRNA仍是未知的。為了證明初始功效，決定評估和驗證瞬時載體攝取來模擬24小時內(nèi)的病毒防護。圖5中捕獲的圖像表明，在這兩個時間點RFP載體定位到所述呼吸組織使得足以作出以下結(jié)論：載體遞送和理論上shRNA的卸載將先于病毒攻擊。

與安慰劑(PBS/Dap)和未處理的禽相比，鼻內(nèi)施用所述亂序載體在處理后14日內(nèi)不伴有任何觀察到的致病。沒有任何觀察到的臨床病癥以及有利的組織病理學(xué)結(jié)果提示這些載體在所施用的劑量下耐受良好。作為后續(xù)行動，可以進行其他的研究。試驗性研究2沒有測試如果在數(shù)日中連續(xù)施用載體劑量，是否會存在組織特異性致病。在該工作中也沒有評價定量測量載體處理響應(yīng)的可選方式，包括蛋禽的產(chǎn)蛋減少和肉雞不增重。在未來的工作中，這種預(yù)防技術(shù)可以包括超過14日和多次劑量后的評價。然而，這些載體是Dap營養(yǎng)缺陷型的，一旦施用后，不能在補充培養(yǎng)基之外生存或增殖。懷疑由于在處理后2周時沒有任何大體或微觀的組織損傷，在超過14日時會引起慢性炎性響應(yīng)。這些初始的試驗性結(jié)果是有希望的，并且表明了這種tkRNAi系統(tǒng)適合于禽類呼吸組織遞送并且不觸發(fā)禽類宿主在14日內(nèi)不能克服的炎性響應(yīng)。

試驗性研究3驗證了H6N2病毒在所述攻擊劑量下在5周齡商業(yè)蛋雞中是感染性的。該劑量(10⁶EID₅₀/0.1mL)常用于雞中的LPAI疫苗功效試驗和其他實驗性攻擊研究(Claes等2013，Pantin-Jackwood等2012，Abbas等2011)。試驗性研究1、2和3一起驗證了24小時內(nèi)的載體攝取，鑒定了適當(dāng)?shù)妮d體劑量和最佳的LPAI攻擊病毒。這些參數(shù)被結(jié)合到最后的POC研究中。

將三組各十只雞預(yù)防性施用所述混合物、亂序載體或安慰劑載體并在處理后20小時(±2)用H6N2攻擊。表3中提供的原始數(shù)據(jù)表明當(dāng)將所述混合物或亂序載體處理的禽與所述PC禽比較時，跨感染后所有天數(shù)的脫落滴度和收集的陽性拭子的比例有顯著差異。當(dāng)以日為控制變量進行MLR分析時，進一步支持了這些結(jié)果。有趣的是按日展開這些結(jié)果，以鑒定這些差異在處理組之間哪里出現(xiàn)和暗示為什么出現(xiàn)。在H6N2攻擊之后，看起來在2dpi時的雞脫落比例比較相似；意味著成功的實驗性感染在所有組中比較相等。還有，在第2日脫落的禽中，混合物禽中的脫落滴度與所述亂序和PC禽相比降低。另外，個體禽脫落(未提供)指出，一只混合物處理的禽在2dpi時脫落，但在隨后的天數(shù)中停止以可檢測的水平脫落。這在直觀上是有道理的，因為所述載體的作用模式旨在防止復(fù)制而不是感染。

在第3日，雖然亂序載體(7/10)和PC(10/10)組中的脫落比例看起來突增，但所述混合物組顯著下降到5/10并且在第3、4和5日間形成平臺。作為對這種觀察結(jié)果的支持，混合物處理的雞和PC雞之間在感染后第3和4日脫落滴度顯著不同。同樣地，觀察脫落趨勢(圖6A)，在感染后3至5日，所述混合物組中中位滴度下降，但在所述亂序載體和PC組二者中，連續(xù)增加直到感染后第7日。這些觀察結(jié)果可以解釋所述NP和PA shRNA的抗病毒活性，在感染期期間干擾有效的病毒復(fù)制。還有別的方式能解釋這些觀察結(jié)果。在所述混合物處理組中，與感染后第3-5日相比，在感染后第2日有更多的雞脫落病毒。這可能表明，如果在攻擊之前>24小時施用以允許更多的時間用于shRNA卸載和加工的話，載體保護將更有效。

按日的脫落滴度和比例支持所提議的載體保護模型。在病毒進入和感染之后，所述載體干擾病毒復(fù)制，抑制要繼續(xù)感染相鄰細(xì)胞和組織的感染性毒粒的增殖。這減少了呼吸組織內(nèi)的感染性病毒載量，從而減少了每只雞中的病毒脫落。因為AIV主要通過雞的直接接觸傳播，這防止了該組中易感禽的后續(xù)感染?？傊@些發(fā)現(xiàn)暗示了混合物載體處理破壞了有效的病毒復(fù)制和脫落。

脫落持續(xù)時間直接影響感染期或從首次檢出病毒時到不再檢出病毒時的時間。它提供了評估載體保護的另一種方式。然而，可以爭論：脫落持續(xù)時間與脫落滴度相比在傳播中發(fā)揮的作用較小。動物可能在較長的持續(xù)時間內(nèi)脫落，但脫落滴度太低而不支持成功的傳播。另外，盡管脫落期較長，但禽密度可能不支持傳播。為此，脫落持續(xù)時間通常不用作評價疫苗功效的度量。本研究在10dpi時終止，雖然在各組的雞當(dāng)中脫落繼續(xù)。因此，如果所述研究持續(xù)超過10日，有可能精確測量所述載體對脫落持續(xù)時間的影響。所述混合物載體降低口咽部病毒脫落滴度，但看起來不限制脫落持續(xù)時間。也許這表明了所述載體在感染周期的早期恰當(dāng)提供瞬時保護，而且還可以表明需要施用后續(xù)的載體劑量，很像加強疫苗。這還可以保護易感禽免受被感染禽的影響，從而阻斷傳播鏈。

除了評估脫落持續(xù)時間以及脫落滴度和脫落比例的差異之外，所述PC雞與載體處理的雞相比脫落病毒的比值提供了測量載體保護的另一種方式。在跨感染后的所有天數(shù)進行控制下，與所述混合物處理的雞相比，所述PC雞脫落H6N2病毒的可能性高4.83倍(p<0.0001)。與所述亂序載體處理的雞相比，PC雞也更可能脫落病毒。雖然這些比值比提供了對載體保護的更大支持，但它們不是業(yè)內(nèi)評價疫苗功效的標(biāo)準(zhǔn)化方法。

呼吸道中病毒復(fù)制的定量降低是用于評價限制病毒傳播和控制疾病的預(yù)防能力的關(guān)鍵度量(Swayne和Kapczynski 2008)。為了被認(rèn)為是臨床相關(guān)的，AIV疫苗必須表現(xiàn)出，與未接種疫苗的禽相比，在接種疫苗的禽中來自呼吸道的病毒復(fù)制和脫落滴度至少降低10²EID₅₀(2log或100-倍)(Suarez等2006)，和/或所述差異應(yīng)該是統(tǒng)計顯著性的(Swayne等1997)。雖然所述亂序載體沒有表現(xiàn)出這種最低要求的降低，但它的確表現(xiàn)出跨所有天數(shù)的脫落滴度的統(tǒng)計顯著性差異(表5)。除感染后第2和10日之外，來自所述混合物載體的脫落滴度與所述PC禽相比，表現(xiàn)出最低2.5log降低(288-倍)和最高3.8log降低(6,309-倍)?？缢刑鞌?shù)，所述抗AIV混合物組與所述PC組相比，脫落的感染性病毒少398-倍。這些測量結(jié)果全部是統(tǒng)計顯著性的?；谶@兩種可測量的標(biāo)準(zhǔn)，所述混合物載體處理在所述參數(shù)內(nèi)是良好的，被認(rèn)為提供了臨床相關(guān)的AIV防護。

利用幾種其它測量來評估疫苗保護。在用10²至10⁵EID₅₀的更高劑量攻擊后，與未接種疫苗的禽相比，測試接種疫苗的禽的可量化的耐受性(Swayne和Kapczynski 2008)。另外，由蛋禽中產(chǎn)蛋減少定義的臨床病癥能夠可定量地測量保護。產(chǎn)蛋直至18-20周齡時方開始。為了模擬產(chǎn)業(yè)通常應(yīng)用疫苗方案的齡期，本研究中使用的禽是4-6周齡。因此不可能測量產(chǎn)蛋。將來利用這種載體系統(tǒng)的研究將使用這兩種評估來定量地測量載體保護。防止死亡是疫苗保護的另一種直接度量。LPAI根據(jù)定義是低致病性的并且經(jīng)常與死亡不相關(guān)。然而，這種H6N2病毒充分適應(yīng)雞，在試驗性研究3中所述PC雞和攻擊的雞中造成了10％死亡。相反，所述混合物和亂序載體二者看起來防止死亡，因為接受任一種載體的禽均未在H6N2感染之后死亡。

最后，防止接觸傳播是證明疫苗的保護性功效和限制現(xiàn)場傳播的傾向的直接方法。因此，臨床相關(guān)的脫落降低可以通過顯示出減少蔓延到接觸禽來證明，這是國立獸醫(yī)生物管理機構(gòu)經(jīng)常要求的做法。這在實驗環(huán)境中是難以評估的，因為在傳播中起作用的因素不是標(biāo)準(zhǔn)化的。這些因素包括禽密度、通風(fēng)、濕度、溫度、攻擊病毒和劑量、給藥途徑、攻擊時的齡期、病毒-宿主適應(yīng)、和室內(nèi)衛(wèi)生。鼻內(nèi)50％禽感染劑量(BID₅₀)已被建議作為在實驗室環(huán)境中攻擊的雞中可定量地評估AIV啟動感染和支持傳播的潛力的方式(Tumpey等，2004)。在本研究中，可以說，所述禽是用啟動感染和支持傳播的適當(dāng)?shù)腂ID50攻擊的，因為大于50％的PC雞脫落病毒。與所述混合物處理的禽安置在一起的兩只沒有經(jīng)過處理的崗哨雞充當(dāng)監(jiān)測在密度為1.0平方英尺/禽的密度下這個組內(nèi)病毒蔓延的方式。除了在引入后第7日的一個陽性拭子之外，在兩只崗哨雞中沒有檢測到禽-禽傳播。從這一個拭子檢測到的滴度剛剛超過RT-qPCR試驗的檢測限。有可能這個陽性樣品確實是由H6N2傳播引起的。然而，也可能這個偶發(fā)的陽性拭子是來自收集期間的手套或提取程序期間的病毒RNA的交叉污染的結(jié)果。

在一個基于實驗室的傳播研究中，研究人員用LPAI A/Ck/HN/1/98(H9N2)實驗性攻擊3周齡的SPF雞(n＝10)(Guan等2013)。當(dāng)以0.5平方英尺/禽的密度安置時，在2dpi時2.1log 10EID₅₀eq/mL的平均OP病毒滴度足以傳播到?jīng)]有接受過處理的雞(n＝2)。第二個研究用含有10⁶EID₅₀的A/雞/CA/1255/02(H6N2)病毒的0.1mL鼻內(nèi)攻擊46周齡SPF來亨雞(n＝10)并在3dpi時加入兩只崗哨禽以監(jiān)測接觸傳播(Pantin-Jackwood等2012)。在被攻擊的雞中，在2和4dpi時的平均OP滴度±SD(log10EID₅₀eq/mL)分別是4.8±0.5和5.3±0.5。在引入后4日，這兩個崗哨禽都是陽性(3.7和3.1log10EID₅₀eq/mL滴度)。雖然本研究中沒有給出禽密度，但在感染后第2和4日，攻擊的禽中的脫落滴度類似于在當(dāng)前PC雞中檢測到的那些滴度。如果將崗哨禽也與所述PC雞安置在一起的話，將更好地說明通過降低傳播潛力來測量的載體保護。令人遺憾的是，這是不可能的，因為商業(yè)農(nóng)場只提供了兩只額外的禽。除了使用適當(dāng)?shù)腂ID₅₀之外，這些前面的研究還表明，如果將崗哨禽安置在PC雞之中的話，脫落滴度將足夠支持傳播。不管怎樣，看起來所述混合物載體成功地抑制了傳播到這些接觸禽。為了做出關(guān)于這些抗AIV載體打斷傳播鏈的能力的任何有效推論，需要標(biāo)準(zhǔn)化的實驗室接觸傳播模型來更準(zhǔn)確地復(fù)制現(xiàn)場或農(nóng)場環(huán)境。

家禽呼吸道的粘膜表面是已知的AIV進入通路(Zarzaur和Kudsk2001)。因為AIV侵襲所述粘膜表面，將這些載體靶向遞送到雞的粘膜呼吸道是靶向病毒復(fù)制的附加益處。以這種方式，這些載體可以在防御的第一線為宿主提供強保護。然而，關(guān)于免疫激活的顧慮是要重要考慮的，因為激活呼吸組織中的免疫應(yīng)答是有有利弊的。與存在于家禽胃腸道中的天然微生物菌群不同，呼吸組織不可能發(fā)展出對細(xì)菌組分的免疫耐受性。適中的免疫應(yīng)答可能是有益的，尤其是對抗流感感染。這可能有助于解釋與亂序載體處理相關(guān)的抗病毒活性。

然而，重要的是避免刺激強粘膜免疫應(yīng)答。這可能干擾這種鼻內(nèi)應(yīng)用載體的功效，尤其是如果需要多個劑量來更好地防御AIV的話。在結(jié)束所述POC工作后，得悉這些4周齡小母雞已經(jīng)在7日齡時接種了大腸桿菌改良型活疫苗(Zoetis，F(xiàn)lorham Park，新澤西)。這種新批準(zhǔn)的疫苗已被研究以確定它對抗禽類致病性大腸桿菌(APEC)的廣譜保護機制。當(dāng)通過噴霧或飲用水施用時，看起來所述疫苗刺激APEC特異性免疫球蛋白A在粘膜組織中產(chǎn)生以及CD8記憶細(xì)胞的增殖，這二者指示一類MHC的激活，引起細(xì)胞應(yīng)答而不是體液應(yīng)答(Filho等2013)。激活細(xì)胞免疫應(yīng)答將幫助預(yù)防將來組織被APEC侵襲，特別是在呼吸道中，因為這是APEC感染的主要途徑(Sadeyen等2014)。疫苗接種可能已經(jīng)在4周齡時導(dǎo)致粘膜炎癥。也許大腸桿菌疫苗接種解釋了在試驗性研究2(第一輪)中觀察到的潛在疾病并導(dǎo)致了在對照和載體處理的兩種禽的呼吸組織中觀察到的炎癥和淋巴細(xì)胞聚集。

除了對大腸桿菌疫苗誘導(dǎo)的粘膜炎癥的顧慮以外，對這種大腸桿菌疫苗的明顯的警告是它是否通過引發(fā)細(xì)胞介導(dǎo)的應(yīng)答來阻止載體侵襲呼吸上皮從而影響載體功效。雖然這種顧慮是正當(dāng)?shù)?，但它可以用幾種方式解決。所述抗AIV載體系統(tǒng)中使用的細(xì)菌是非移動性大腸桿菌菌株CEQ221。這些細(xì)菌是K-12衍生物，表型粗糙，并且雖然它們的脂多糖具有完整的核心結(jié)構(gòu)，但它們?nèi)狈抗原(Liu和Reeves 1994)。這意味著這些載體在LPS O-抗原生物合成中是有缺陷的并且可能缺乏有效的LPS表達(dá)，導(dǎo)致在它們的外膜上LPS的水平較低。因此CEQ221不可能誘導(dǎo)強大的免疫應(yīng)答。CEQ221是非致病的侵襲性細(xì)胞內(nèi)細(xì)菌并且已經(jīng)被遺傳工程改造成靶向粘膜上皮細(xì)胞。這些侵襲性大腸桿菌需要粘膜上皮細(xì)胞表面上的(β)1整合素表達(dá)。進入依賴于這種侵襲素-(β)1整合素受體相互作用，這種相互作用使得細(xì)菌通過受體介導(dǎo)的胞吞被攝取(Xiang等2006，Isberg和Barnes 2001，Conte等1994，Isberg and Leong 1990)。要不是所述遺傳工程改造的細(xì)菌表達(dá)所述侵襲素蛋白，這些CEQ221細(xì)菌原本應(yīng)是細(xì)胞外的并被專職抗原遞呈細(xì)胞(APC)識別。上皮細(xì)胞通常不被表征為專職APC。因為這種特異性粘膜上皮靶向系統(tǒng)，樹突狀細(xì)胞和其他APC不大可能與這些載體相互作用或?qū)@些載體作出應(yīng)答。CEQ221是Dap營養(yǎng)缺陷體并在侵襲到宿主細(xì)胞中后經(jīng)歷快速裂解。即使CEQ221對APC和其他免疫細(xì)胞是侵襲性的，但細(xì)菌在吞噬體中裂解后LLO的表達(dá)將破壞所述細(xì)胞的吞噬體和溶酶體之間的融合。這種破壞將阻斷I類MHC呈遞并通過CD8記憶細(xì)胞增殖來防止細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答的激活(Grillot-Courvalin等1998)。因此，這些CEQ221載體不是非常適合于發(fā)展細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答或甚至體液免疫應(yīng)答。這些特性、或缺乏這些特性可以解釋這種載體在這些商業(yè)雞中逃避由大腸桿菌疫苗產(chǎn)生的細(xì)胞應(yīng)答的能力。

如果在該研究中使用的動物是SPF禽，則載體保護可能已被更直接地測量到。然而，為了最好地模擬這種載體系統(tǒng)在現(xiàn)場的功效，可以對使用這些商業(yè)禽作出爭議。最終，難以解讀在這項初步的試驗性工作中，這種大腸桿菌疫苗對所述抗AIV載體可能產(chǎn)生的影響。然而，如果所述大腸桿菌疫苗具有任何有害效應(yīng)的話，這將提示這項工作的結(jié)果低估了載體在雞中對AIV的防御。

雖然結(jié)果提示所述混合物載體提供更大的保護，但單獨的亂序載體具有抗病毒能力并不異常。這些細(xì)菌載體在特性上是LPS粗糙型的，然而即使很低水平的LPS仍能充當(dāng)免疫增強劑(Bessler等1990)。LPS通常被宿主組織識別并刺激先天免疫應(yīng)答。LPS識別可以引起刺激I型IFN產(chǎn)生的下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。鑒于過去的一些與CEQ508大腸桿菌相關(guān)的研究，CEQ221菌株的衍生物充當(dāng)抗AIV載體遞送工具這種情形是可能的。在以前的工作中(Steinbach等2010)，與LPS注射相比，口服CEQ508不引起小鼠中循環(huán)促炎性細(xì)胞因子的顯著增加。然而，這些細(xì)菌載體確實刺激了很低水平的這些細(xì)胞因子，包括TNF-α、IL-6、MCP-1和IL-12。這些是參與先天免疫應(yīng)答的所有關(guān)鍵細(xì)胞因子，先天免疫應(yīng)答是對抗病毒感染、特別是流感的公知的細(xì)胞防御機制(Garcia-Sastre和Biron 2006)。當(dāng)這些細(xì)菌載體通過鼻內(nèi)途徑施用于雞時，這些載體觸發(fā)先天應(yīng)答是很可能的，導(dǎo)致對抗H6N2以及復(fù)制和脫落的附加防護。在這種先天激活期間產(chǎn)生的促炎性細(xì)胞因子將增加任何未感染的宿主細(xì)胞抵抗被新產(chǎn)生的病毒新感染的能力。

正如已經(jīng)介紹和討論的，有幾種方式用于測量和描述來自該POC工作的載體保護。不論是看按日計和跨所有天數(shù)二者的脫落比例、脫落滴度還是比值比的差異，都出現(xiàn)相似的模式。與陽性對照相比，用所述抗AIV混合物載體預(yù)防性處理的雞在用H6N2實驗性攻擊之后受到保護。雖然在任何單日的分析無顯著性，但總體(跨所有天數(shù))的顯著性保護與亂序載體處理有關(guān)聯(lián)。雖然，來自所述亂序載體的保護不太明顯，提示所述混合物載體具有更大的抗病毒潛力。這種附加的保護可能是由于NP和PA shRNA的雙重抗病毒作用。

平均后，在感染后第3-7日之間，48％的混合物載體處理的雞沒有脫落。與此相反，PC組中只有10％的雞沒有脫落。脫落滴度降低的分析結(jié)果顯示所述混合物載體提供臨床相關(guān)的保護。

如之前所述，這項工作的長期目標(biāo)是將這種抗流感技術(shù)開發(fā)成為能促進更有效和強大的家禽AIV控制方法的開發(fā)的預(yù)防藥。成功開發(fā)這種技術(shù)將不僅降低爆發(fā)對行業(yè)和發(fā)展中國家的經(jīng)濟負(fù)擔(dān)，它還將直接降低傳播給人類的風(fēng)險并為科學(xué)和醫(yī)學(xué)界開發(fā)用于人類的類似的抗流感預(yù)防藥提供概念證據(jù)。與開發(fā)任何新技術(shù)一樣，需要額外的研究并且不應(yīng)被低估。這項工作證明了這些抗AIV載體在雞中對抗禽流感的保護性功效并提供了繼續(xù)評價這種技術(shù)的強論據(jù)。

權(quán)利要求項的術(shù)語表

術(shù)語“施用”及其變化形式(例如“施用”化合物)在指代本發(fā)明的化合物時是指將所述化合物引入需要治療的對象的身體中。當(dāng)本發(fā)明的化合物與一種或多種其他活性劑(例如AIV疫苗等)相組合提供時，“施用”以及它的變化形式各自被理解為包括同時和相繼引入所述化合物和其他活性劑。

用在本文中時，術(shù)語“組合物”意圖涵蓋包含指定量的指定成分的產(chǎn)物，以及由指定量的指定成分的組合直接或間接產(chǎn)生的任何產(chǎn)物。

術(shù)語“治療有效量”用在本文中時是指在組織、全身、動物或人類中引起研究者、獸醫(yī)、醫(yī)生或其他臨床醫(yī)師所尋求的生物或醫(yī)學(xué)應(yīng)答的活性化合物或藥劑的量。在指代AIV感染時，有效量包括足以防止感染疾病或足以減輕疾病嚴(yán)重性的量，如通過對象的臨床癥狀、病毒滴度或病毒脫落所證實的，或通過防止或減少動物之間傳播的能力所證實的。在一些實施方式中，有效量是足以延遲癥狀發(fā)作或預(yù)防所述疾病的量。在一些實施方式中，有效量是足以降低病毒滴度和/或減少病毒脫落的量。有效量可以在一劑或多劑中施用。

術(shù)語“治療AIV”或“AIV的治療”是指施用于具有感染AIV的風(fēng)險的動物，特別是家禽，并且是指通過抑制AIV的復(fù)制來緩解所述疾病的效應(yīng)，而且還指的是導(dǎo)致臨床癥狀、病毒滴度和/或病毒脫落減少的效應(yīng)。

用在本文中時，“治療”是指獲得有益的或期望的臨床結(jié)果。有益的或期望的臨床結(jié)果包括但不限于下列的任何一種或多種：緩解一種或多種癥狀，減輕AIV的程度，穩(wěn)定的AIV狀態(tài)(即不惡化)，阻止或延遲AIV的蔓延(例如脫落)，阻止、延遲或減慢AIV進展，和/或保持重量/重量增加或產(chǎn)蛋，從而保持動物生產(chǎn)力。本發(fā)明的方法設(shè)想了這些治療方面的任何一種或多種。

“需要治療的對象”是具有感染AIV的風(fēng)險的動物。

“可藥用的”組分是適合用于人類和/或動物并且與合理的利益/風(fēng)險比相稱沒有過度的不良副作用(例如毒性，刺激和變態(tài)反應(yīng))的組分。

“安全有效量”是指當(dāng)以本發(fā)明的方式使用時足以產(chǎn)生期望的治療反應(yīng)并且與合理的利益/風(fēng)險比相稱沒有過度的不良副作用(例如毒性、刺激或變態(tài)反應(yīng))的組分量。

用在整個申請中時，不帶具體數(shù)量的指稱以它們是指“至少一個”、“至少第一”、“一個或多個”或“多個”所指稱的組分或步驟的意義使用，除非上下文明確地另有指定。例如，術(shù)語“細(xì)胞”包括多個細(xì)胞，包括其混合物。

術(shù)語“和/或”無論用在本文中何處都包括“和”、“或”和“由所述術(shù)語連接的元素的全部或任何其他組合”。

用在本文中時，術(shù)語“包含”意圖是指所述產(chǎn)物、組合物和方法包括所提及的組分或步驟，但不排除其他組分或步驟?！盎居?..組成”當(dāng)用于定義產(chǎn)物、組合物和方法時，應(yīng)該是指排除任何有實質(zhì)意義的其他組分或步驟。因此，基本由所列舉的組分組成的組合物不排除痕量的染污物和可藥用的載體。“由...組成”應(yīng)該是指排除痕量元素以外的其他組分或步驟。

用在本文中時，術(shù)語“侵襲性的”當(dāng)涉及微生物例如細(xì)菌或細(xì)菌治療粒子(BTP)時，是指能夠向靶細(xì)胞遞送至少一種分子例如RNA或編碼RNA的DNA分子的微生物。侵襲性的微生物可以是能夠穿越細(xì)胞膜從而進入所述細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)并將至少一部分它的內(nèi)容物例如RNA或編碼RNA的DNA遞送到所述靶細(xì)胞中的微生物。將所述至少一種分子遞送到靶細(xì)胞中的過程優(yōu)選不顯著改變侵襲器官。

侵襲性微生物包括：天然能夠向靶細(xì)胞遞送至少一種分子的微生物，例如通過穿越細(xì)胞膜例如真核細(xì)胞膜并進入細(xì)胞質(zhì)；以及不是天然侵襲性的并且已被修飾、例如遺傳修飾成侵襲性的微生物。在另一種優(yōu)選實施方式中，通過將細(xì)菌或BTP與也稱為“進入因子”或“細(xì)胞質(zhì)靶向因子”的“侵襲因子”連接，可以將不是天然侵襲性的微生物修飾變成侵襲性的。用在本文中時，“侵襲因子”是指當(dāng)被非侵襲性細(xì)菌或BTP表達(dá)時致使所述細(xì)菌或BTP變成侵襲性的因子，例如，蛋白質(zhì)或一組蛋白質(zhì)。用在本文中時，“侵襲因子”是由“細(xì)胞質(zhì)靶向基因”編碼的。在本領(lǐng)域中已全面描述了侵襲性的微生物，例如，美國專利公布No.US 20100189691 A1和US20100092438 A1以及Xiang，S.等，Nature Biotechnology 24，697-702(2006)。它們各自通過引用以其全文并入用于所有目的。

在優(yōu)選實施方式中，所述侵襲性微生物是大腸桿菌，如本申請的實施例中所教導(dǎo)的。然而，設(shè)想了其他的微生物也有可能被修改成充當(dāng)遞送抗AIV siRNA的tkRNAi載體。這些無毒力并且侵襲性的細(xì)菌和BTP將表現(xiàn)出侵襲性質(zhì)，或者將被修飾成表現(xiàn)出侵襲性質(zhì)，并且可以通過各種機制進入哺乳動物宿主細(xì)胞。與由專職吞噬細(xì)胞攝取細(xì)菌或BTP常規(guī)導(dǎo)致所述細(xì)菌或BTP在專門的溶酶體內(nèi)破壞相反，侵襲性的細(xì)菌或BTP株具有侵襲非吞噬性宿主細(xì)胞的能力。這類細(xì)胞內(nèi)細(xì)菌的天然存在的實例是耶爾森氏菌(Yersinia)、立克次氏體(Rickettsia)、軍團桿菌(Legionella)、布魯氏菌(Brucella)、分支桿菌(Mycobacterium)、螺桿菌(Helicobacter)、考克斯氏體(Coxiella)、衣原體(Chlamydia)、奈瑟氏菌(Neisseria)、伯克霍爾德氏菌(Burkolderia)、博德特氏菌(Bordetella)、包柔氏螺旋體(Borrelia)、李斯特菌(Listeria)、志賀菌(Shigella)、沙門氏菌(Salmonella)、葡萄球菌(Staphylococcus)、鏈球菌(Streptococcus)、卟啉單胞菌(Porphyromonas)、密螺旋體(Treponema)和弧菌(Vibrio)，但這種性質(zhì)也可以轉(zhuǎn)移給其他細(xì)菌或BTP，例如大腸桿菌、乳桿菌(Lactobacillus)、乳球菌(Lactococcus)或雙歧桿菌(Bifidobacteriae)，包括通過轉(zhuǎn)移侵襲相關(guān)基因的益生菌(P.Courvalin，S.Goussard，C.Grillot-Courvalin，C.R.Acad.Sci.Paris 318，1207(1995))。當(dāng)評價其他細(xì)菌物種作為用作tkRNAi載體的候選物時要考慮或解決的因素包括候選物的致病性或缺乏致病性，候選細(xì)菌對靶細(xì)胞的趨向性，或者細(xì)菌可以被工程改造成向靶細(xì)胞內(nèi)部遞送siRNA的程度，以及候選細(xì)菌可能通過觸發(fā)宿主的先天免疫而提供的任何協(xié)同價值。

禽流感病毒是對動物和人類健康造成重大威脅的疾病，并且是使得大流行性流感出現(xiàn)的遺傳多樣性的來源。用在本文中時，禽流感是通過在家禽中引起流感癥狀和可能的死亡而不利地影響至少一部分家禽的流感。流感可以被一些家禽攜帶而不產(chǎn)生流感癥狀或沒有不利地影響所述家禽的健康這一事實不會改變只要所述流感不利地影響至少一部分家禽的健康，則所述流感就是禽流感并且是疾病這一事實。用在本文中時，感染禽流感病毒并且沒有表現(xiàn)出癥狀和/或起到病毒載體的作用的家禽仍然被稱為已經(jīng)感染所述禽流感疾病。當(dāng)所述病毒在家禽身體內(nèi)時，所述家禽感染禽流感病毒。

用在本文中時，如果(1)將藥物組合物通過內(nèi)部(通過吞食、吸入、注射等)、局部(在皮膚上吸收到體內(nèi))或以其它方式施用于動物，并且(2)所述藥物組合物防止家禽感染所述疾病并經(jīng)歷通常與所述疾病有關(guān)的癥狀，或者，如果家禽感染所述疾病并經(jīng)歷或不經(jīng)歷不同程度的嚴(yán)重性的一些或全部通常與所述疾病有關(guān)的癥狀，所述家禽從所述疾病恢復(fù)到正常健康狀態(tài)，則在家禽暴露于疾病之前或之后防止了所述疾病。以類似的方式，如果家禽的病毒脫落降低(例如脫落滴度降低)，不管所述家禽是否在禽流感病毒感染中存活，則禽流感蔓延風(fēng)險降低。如上文所討論的，本發(fā)明的主要目標(biāo)之一是遏止或減少禽流感的蔓延，這種減少可以通過減少從感染的家禽傳播到其他動物或人類來解決。

用在本文中時，如果將藥物組合物在家禽已經(jīng)感染疾病后施用于所述家禽，則是治療疾病。如上所述，感染疾病的家禽可以或可以不表現(xiàn)出與所述疾病有關(guān)的癥狀。

在家禽中由禽流感產(chǎn)生的癥狀范圍為從輕度患病到高度傳染性和迅速致死的“高度致病的”疾病形式，后者可以產(chǎn)生嚴(yán)重的流行病。高度致病性禽流感的特征在于突然發(fā)作、嚴(yán)重和迅速死亡，并且死亡率可以接近100％。

還提供了實踐本發(fā)明方法的試劑盒?！霸噭┖小币鈭D是指包含本發(fā)明的至少一種試劑、例如pH緩沖劑的任何制品(例如，包裝或容器)。所述試劑盒可以作為執(zhí)行本發(fā)明方法的單位來推銷、分配或銷售。另外，所述試劑盒可以含有描述所述試劑盒及其使用方法的包裝插頁。任何或所有的試劑盒試劑都可以被提供在保護它們抵御外界環(huán)境的容器內(nèi)，例如在密封容器或小袋內(nèi)。

除非另有陳述，本發(fā)明的實踐可以使用有機化學(xué)、聚合物技術(shù)、分子生物學(xué)(包括重組體技術(shù))、細(xì)胞生物學(xué)、生物化學(xué)和免疫學(xué)的常規(guī)技術(shù)和說明，它們在本領(lǐng)域技術(shù)人員的范圍之內(nèi)。這樣的常規(guī)技術(shù)包括聚合物陣列合成、雜交、連接、和利用標(biāo)簽檢測雜交。適用技術(shù)的具體說明可以通過參考上文的實例來獲得。然而，當(dāng)然也可以使用其他等效的常規(guī)程序。這樣的常規(guī)技術(shù)和說明可以在標(biāo)準(zhǔn)實驗室手冊中找到，例如《基因組分析：實驗室手冊系列》(Genome Analysis：A Laboratory Manual Series)(I-IV卷)，《抗體使用：實驗室手冊》(Using Antibodies：A Laboratory Manual)，《細(xì)胞：實驗室手冊》(Cells：A Laboratory Manual)，《PCR引物：實驗室手冊》(PCR Primer：A Laboratory Manual)，和《分子克?。簩嶒炇沂謨浴?Molecular Cloning：A Laboratory Manual)(全部來自Cold Spring Harbor Laboratory Press)，Stryer，L.(1995)《生物化學(xué)》(Biochemistry)(第四版)Freeman，N.Y.，Gait，“寡核苷酸合成：實用方法(Oligonucleotide Synthesis：A Practical Approach)”1984，IRL Press，London，Nelson和Cox(2000)，Lehninger，《生物化學(xué)原理》(Principles of Biochemistry)第三版，W.H.Freeman Pub.，New York，N.Y.，和Berg等(2002)《生物化學(xué)》(Biochemistry)第五版，W.H.Freeman Pub.，New York，N.Y.，它們?nèi)恳云淙耐ㄟ^引用并在本文中用于所有目的。

在有利的實施方式中，所述試劑盒容器還可以包括可藥用的載體。所述試劑盒還可以包括無菌稀釋劑，其優(yōu)選儲存在分開的其他容器中。在另一種實施方式中，所述試劑盒還包含包裝插頁，其包含印刷的說明書，指導(dǎo)使用pH緩沖劑和所述抗AIV劑的聯(lián)合治療作為治療對象中的禽流感的方法。所述試劑盒也可以包含其他容器，其包含其他抗流感藥劑(例如金剛烷胺、金剛烷乙胺和奧塞米韋)、增強這種藥劑的效應(yīng)的試劑、或改善所述治療的功效或耐受性的其他化合物。

本申請中引用的所有參考文獻(xiàn)在與此沒有不一致的程度上，通過引用以它們的全文結(jié)合到本文中。

可以看出，有效獲得了上文闡述的優(yōu)點，和從前面的描述變得顯而易見的那些優(yōu)點，并且因為在不背離本發(fā)明范圍的情況下可以在上述構(gòu)建物中做出某些變化，所以在前面的描述中包含的或在附圖中顯示的所有主題都應(yīng)該意欲被解釋為說明性而不是限制性的。

還要理解，權(quán)利要求意欲覆蓋在本文中描述的本發(fā)明的所有上位和下位特征，以及作為語言問題可以被認(rèn)為落在其間的本發(fā)明范圍的所有陳述?，F(xiàn)在本發(fā)明已經(jīng)被描述。