一種含枯草芽孢桿菌g10的功能型蔬菜育苗生物基質(zhì)及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種含枯草芽孢桿菌G10的功能型蔬菜育苗生物基質(zhì)及其制備方法。一株枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)G10，保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏日期為2014年11月3日，保藏編號為CGMCC NO.9921。一種功能型蔬菜育苗生物基質(zhì)，由普通育苗基質(zhì)中添加本發(fā)明所述的枯草芽孢桿菌G10發(fā)酵液得到。使用該功能型蔬菜育苗生物基質(zhì)，對蔬果苗期的促生效果好，能夠得到優(yōu)質(zhì)的種苗，同時(shí)有益微生物能夠在種苗根際大量定殖，能夠顯著增強(qiáng)所育種苗后期田間種植中的生長。
CGMCC NO.9921
20141103
【專利說明】一種含枯草芽孢桿菌G10的功能型蔬菜育苗生物基質(zhì)及其 制備方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于農(nóng)業(yè)微生物領(lǐng)域，涉及一種含枯草芽孢桿菌GlO的功能型蔬菜育苗生 物基質(zhì)及其制備方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 隨著我國現(xiàn)代農(nóng)業(yè)的發(fā)展，蔬菜工廠化育苗越來越受到人們的重視，穴盤育苗是 當(dāng)前工廠化育苗的主要措施。據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，我國需要育苗的作物面積非常大，其中水稻種 植面積就超過3億畝/年，經(jīng)濟(jì)作物超過5億畝次/年。目前國內(nèi)一般以富含有機(jī)質(zhì)的材 料（如泥炭、腐熟植物殘?bào)w等）為主，再配以適當(dāng)比例的輕質(zhì)無機(jī)材料，如蛭石、膨脹珍珠巖 等制成育苗基質(zhì)。由于材料來源受地區(qū)和成本的限制，且泥炭為不可再生資源，限制著基質(zhì) 無土育苗的可持續(xù)發(fā)展，現(xiàn)已成為草炭匱乏地區(qū)蔬菜工廠化育苗發(fā)展的瓶頸。國外工廠化 育苗發(fā)展很快，進(jìn)口基質(zhì)保水性明顯優(yōu)于國產(chǎn)泥炭基質(zhì)，進(jìn)口基質(zhì)中有機(jī)質(zhì)和速效磷、鉀含 量明顯高于國產(chǎn)泥炭基質(zhì)。因此提升國內(nèi)育苗基質(zhì)的整體水平變得尤為迫切。將促進(jìn)作物 生長的根際微生物與不同腐熟廢棄物料（普通完全或部分替代泥炭物料研制成的基質(zhì)）相 結(jié)合，研制成有機(jī)活性育苗生物基質(zhì)，將打破傳統(tǒng)育苗基質(zhì)的配方及工藝，成為提升我國育 苗基質(zhì)整體水平的一個(gè)重大突破。目前，國內(nèi)已有部分專家在嘗試此方面工作，主要集中在 利用AM菌根接種現(xiàn)有基質(zhì)進(jìn)行育苗，雖取得一些成果，但研究均不夠系統(tǒng)深入，也沒有形 成大規(guī)模推廣并被廣大農(nóng)民認(rèn)可的產(chǎn)品，因而本專利的研究變得尤為重要。
[0003] 植物根際促生菌是指定殖于植物根際系統(tǒng)，并能促進(jìn)植物生長的一類微生物總 稱。能依靠直接產(chǎn)生信號物質(zhì)，或者提高植物抗性、加速土壤養(yǎng)素循環(huán)等方式促進(jìn)植物生 長、提高防病能力、增加作物的產(chǎn)量。因而成為許多學(xué)者研究的熱點(diǎn)。
[0004] 植物根際（rhizosphere)是一個(gè)非常特殊的生態(tài)環(huán)境，是土壤-植物生態(tài)系統(tǒng)物 質(zhì)交換的活躍界面，植物進(jìn)行光合作用，將光合產(chǎn)物運(yùn)至地下，促進(jìn)根際微生物的生長和代 謝，而根際微生物將有機(jī)態(tài)養(yǎng)分轉(zhuǎn)化為無機(jī)形態(tài)，利于植物吸收，同時(shí)，很多根際微生物能 分泌促進(jìn)根系生長的促生物質(zhì)、拮抗土傳病原菌的拮抗物質(zhì)。植物根際形成了根際微生物 的生態(tài)環(huán)境，特定作物根系分泌物造就了特定的土壤細(xì)菌和真菌的群落結(jié)構(gòu)。與動物不同， 植物生長位點(diǎn)是固定的，植物與其他生物的互作主要依靠分泌的各種化學(xué)信號物質(zhì)。植物 通過根系分泌能被土壤微生物識別的信號分子啟動微生物與植物根系的對話，這種對話又 反過來使微生物產(chǎn)生一些信號來啟動微生物在根部的定殖。自然條件下，特定作物的根系 分泌物被某些有益微生物所愛好，如果我們在育苗的時(shí)候能夠?qū)⑦@些特定的針對不同作物 根際的功能微生物，?；钐砑拥交|(zhì)中，研制成具有不同功能的活性微生物育苗基質(zhì)，從而 進(jìn)一步育出根際帶有大量活性功能微生物的優(yōu)質(zhì)種苗，必定能夠提高該類作物在大田種植 中的產(chǎn)量。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是提供一株辣椒促生益生菌枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis) G10。
[0006] 本發(fā)明的另一目的是提供一種含有該菌株的功能型蔬菜育苗生物基質(zhì)。
[0007] 本發(fā)明的又一目的是提供該功能型蔬菜育苗生物基質(zhì)的制備方法。
[0008] 本發(fā)明的目的可通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：
[0009] -株枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis)G10,保藏于中國微生物菌種保藏管理委 員會普通微生物中心，保藏日期為2014年11月3日，保藏編號為CGMCC NO. 9921。
[0010] 菌株GlO在LB平板上的菌落呈乳白色，皺褶，邊緣不整齊，具有一定的黏性，易挑 起。在顯微鏡下所觀察到的營養(yǎng)體細(xì)胞，革蘭氏染色陽性，菌體著色均勻，呈桿狀，兩端鈍 平，多數(shù)菌體連接成串，呈不規(guī)則形狀（圖1)。淀粉水解反應(yīng)，V. P反應(yīng)，接觸酶反應(yīng)，利用 檸檬酸鹽反應(yīng)，硝酸鹽還原，石蕊牛奶還原胨化，甲基紅反應(yīng)，明膠液化反應(yīng)均呈陽性，D-果 糖，麥芽糖，阿拉伯糖，木糖，乳糖利用均呈陽性，發(fā)酵葡萄糖產(chǎn)酸不產(chǎn)氣，厭氧條件下不生 長，7% NaCl生長。菌株16S rDNA序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹見附圖2。菌株GlO位于Bacillus subtilis分支上，與枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis DSMlO相似性在99%以上，結(jié)合 生理生化試驗(yàn)將GlO鑒定為枯草芽孢桿菌。
[0011] 本發(fā)明所述的枯草芽孢桿菌GlO在制備蔬菜育苗生物基質(zhì)中的應(yīng)用，優(yōu)選在制備 辣椒育苗生物基質(zhì)中的應(yīng)用。
[0012] 一種功能型蔬菜育苗生物基質(zhì)，由普通育苗基質(zhì)中添加本發(fā)明所述的枯草芽孢桿 菌GlO發(fā)酵液得到。
[0013] 其中，所述的普通育苗基質(zhì)中含有機(jī)質(zhì)（基質(zhì)干重，下同）彡20%，總養(yǎng)分 (N+P20 5+K20) 1. 5%?7%，7jc分彡 55%，pH 值 5. 5 ?7. 5, Ec 彡 2. 5ms/cm。
[0014] 所述的功能型蔬菜育苗生物基質(zhì)中枯草芽孢桿菌GlO活菌數(shù)優(yōu)選> 2. OX IO7CFU/ g基質(zhì)干重。
[0015] 所述的枯草芽孢桿菌GlO發(fā)酵液通過以下方法制備：將保藏號為CGMCC NO. 9921 的枯草芽孢桿菌GlO接種到PDA培養(yǎng)液中，進(jìn)行液體發(fā)酵生產(chǎn)，發(fā)酵生產(chǎn)的條件為： pH6. 0?7. 0,發(fā)酵溫度范圍30°C，攪拌速度為170轉(zhuǎn)/分鐘，發(fā)酵中后期形成芽孢，發(fā)酵時(shí) 間為48h，使發(fā)酵液中含菌或芽孢量> I X 101°個(gè)/ml ;其中所用PDA培養(yǎng)基配制方法為，以 配制IL培養(yǎng)基為例：200g 土豆削皮后切成小塊放到水里煮，沸騰后煮30min后過濾，濾液 中加20g普通鹿糖后定容至1000ml，pH值自然，121°C滅菌20min。
[0016] 本發(fā)明所述的功能型蔬菜育苗生物基質(zhì)的制備方法，包含以下步驟：
[0017] (1)制備枯草芽孢桿菌GlO發(fā)酵液，使發(fā)酵液中含菌或芽孢量彡IX IOltl個(gè)/ml ;
[0018] (2)將步驟（1)制備的枯草芽孢桿菌GlO發(fā)酵液加入普通育苗基質(zhì)中，發(fā)酵液的接 入量為3?5% (v/w)。
[0019] 所述的普通育苗基質(zhì)中含有機(jī)質(zhì)（基質(zhì)干重，下同）彡20 %，總養(yǎng)分 (N+P205+K20) 1. 5%?7%，7jc分彡 55%，pH 值 5. 5 ?7. 5, Ec 彡 2. 5ms/cm。
[0020] 所得產(chǎn)品中有益活菌數(shù)彡2. OX 107CFU/g(基質(zhì)干重，下同）。有機(jī)質(zhì)彡20%，總 養(yǎng)分（N+P20 5+K20) 1. 5%?7%，水分彡 55%，pH 值 5. 5 ?7. 5, Ec 彡 2. 5ms/cm。
[0021] 有益效果：
[0022] 本發(fā)明通過大量實(shí)驗(yàn)從南京市蔬菜花卉研究所辣椒大棚所種辣椒根際分離篩選 到一株優(yōu)異促生菌株--枯草芽孢桿菌G10,其能夠產(chǎn)生大量促生物質(zhì)IAA，同時(shí)能夠有效 在根際定殖。
[0023] 由于基質(zhì)的良好通透性和優(yōu)質(zhì)保水性，普通基質(zhì)與枯草芽孢桿菌GlO結(jié)合后，能 夠大幅度促進(jìn)GlO的存活能力，從而確保所育種苗根際帶有大量活性功能菌。
[0024] 使用該產(chǎn)品，對蔬果苗期的促生效果好，能夠得到優(yōu)質(zhì)的種苗，同時(shí)有益微生物能 夠在種苗根際大量定殖，能夠顯著增強(qiáng)所育種苗后期田間種植中的生長。本產(chǎn)品中包含的 活性微生物，具有高效的促生能力，技術(shù)優(yōu)勢和功能優(yōu)勢明顯。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0025] 圖IGlO在LB平板上的菌落形態(tài)
[0026] 圖2基于菌株GlO的16S rRNA基因序列采用鄰接法建立的系統(tǒng)發(fā)育樹
[0027] 圖3不同接菌量生物基質(zhì)育辣椒苗功能菌根際定殖情況
[0028] 圖4 5%功能菌接入量生物基質(zhì)育辣椒苗的促生效果圖
[0029] 其中，A為CKl :未接菌的空白培養(yǎng)基對照，B為GlO處理組；C為CK2為水對照。
[0030] 圖5生物基質(zhì)育苗的辣椒盆栽促生效果圖
[0031] 生物材料保藏信息
[0032] G10,分類命名為枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis，保藏于中國微生物菌種保藏 管理委員會普通微生物中心，保藏地址為北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，中國科學(xué)院微 生物研究所，保藏日期為2014年11月3日，保藏編號為CGMCC NO. 9921。 具體實(shí)施方案
[0033] 實(shí)施例1、菌株的分離及鑒定
[0034] 取辣椒根部，切成長約3cm小段，取IOg植物根于盛有90ml無菌水的三角瓶內(nèi)，在 30°C，170r/min條件下的搖床中振蕩20min，制成土壤懸浮液，80度水浴20min后，稀釋成 10' 10_2、10' 10_4、KT5等不同梯度稀釋液后涂平板，培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)Id?2d，后挑取單 菌落，經(jīng)平板純化后，共挑選150株，分別測定各菌株產(chǎn)植物生長素吲哚乙酸（IAA)(方法參 考文獻(xiàn)：Glickmann E, Dessaux Y. A critical examination of the specificity of the salkowski reagent for indolic compounds produced by phytopathogenic bacteria. [J].Applied and environmental microbiology, 1995, 612)及產(chǎn)ACC脫氨酶的能力（方法 參考文獻(xiàn)：Glick BR. Modulation of plant ethylene levels by the bacterial enzyme ACC deaminase [J]· FEMS Microbiology Letter, 2005, 251:1-7)。米用同樣的方法，結(jié)果初 篩和復(fù)篩，獲得一株同時(shí)產(chǎn)IAA和具ACC脫氨酶能力優(yōu)異的菌株G10,保存留待進(jìn)一步研究。
[0035] 菌株GlO在LB平板上的菌落呈乳白色，皺褶，邊緣不整齊，具有一定的黏性，易挑 起。在顯微鏡下所觀察到的營養(yǎng)體細(xì)胞，革蘭氏染色陽性，菌體著色均勻，呈桿狀，兩端鈍 平，多數(shù)菌體連接成串，呈不規(guī)則形狀（圖1)。生理生化測定結(jié)果表明：淀粉水解反應(yīng)，V. P 反應(yīng)，接觸酶反應(yīng)，利用檸檬酸鹽反應(yīng)，硝酸鹽還原，石蕊牛奶還原胨化，甲基紅反應(yīng)，明膠 液化反應(yīng)均呈陽性，D-果糖，麥芽糖，阿拉伯糖，木糖，乳糖利用均呈陽性，發(fā)酵葡萄糖產(chǎn)酸 不產(chǎn)氣，厭氧條件下不生長，7% NaCl生長。
[0036] 菌株16S rDNA序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹見附圖2。菌株GlO位于Bacillus subtilis 分支上，與枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis DSMlO相似性在99%以上，結(jié)合生理生化試 驗(yàn)將GlO鑒定為枯草芽孢桿菌。將GlO保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物 中心，保藏日期為2014年11月3日，保藏編號為CGMCC NO. 9921。
[0037] 實(shí)施例2功能菌菌液的生產(chǎn)
[0038] 將菌株GlO (CGMCC NO. 9921)接種至PDA培養(yǎng)液中液體發(fā)酵生產(chǎn)，發(fā)酵生產(chǎn)的條件 為：PH7.0,發(fā)酵溫度30°C，攪拌速度為170rpm/min，發(fā)酵中后期形成芽孢，發(fā)酵時(shí)間為48h， 使發(fā)酵液中含菌或芽孢量> IX 101°個(gè)/ml ;
[0039] 其中所用PDA培養(yǎng)基配制方法為，以配制IL培養(yǎng)基為例：200g 土豆削皮后切成小 塊放到水里煮，沸騰后煮30min后過濾，濾液中加20g普通鹿糖后定容至1000ml，pH值自 然，121°C滅菌 20min。
[0040] 實(shí)施例3、功能型生物基質(zhì)研發(fā)
[0041] 3. 1以菌株GlO為功能菌的生物基質(zhì)育苗效果
[0042] 基質(zhì)的研發(fā)：菌株GlO接至普通育苗基質(zhì)中，混合均勻?；|(zhì)中功能菌株GlO采用 選擇性培養(yǎng)基：蛋白胨10. 〇g，酵母粉5. 0g，NaCl 10. 0g，瓊脂2. 0%，去離子水lOOOmL，pH 7.2-7.4，1211：高壓滅菌2〇1^11;1%多粘菌素21^，1%放線菌酮41^(抗生素在培養(yǎng)基倒前 冷卻后加入）。功能菌GlO菌落數(shù)以每克基質(zhì)干重計(jì)算。經(jīng)計(jì)數(shù)，生物基質(zhì)中含功能菌數(shù)約 為 6. 73X 107CFU/g。
[0043] 育苗試驗(yàn)處理如下：1)普通育苗基質(zhì)（CK2) ;2)添加未接菌空白培養(yǎng)基的育苗基 質(zhì)（CKl) ;3)添加菌株GlO發(fā)酵液的育苗生物基質(zhì)（GlO)。將辣椒種子消毒浸種催芽，露白 后，埋入三個(gè)處理的基質(zhì)中，每個(gè)處理50個(gè)重復(fù)。40天左右分別測定相關(guān)生長指標(biāo)：株高、 莖粗、SPAD、葉面積、地上部鮮重、地上部干重、地下部鮮重、地下部干重（表1)。并稀釋涂 布計(jì)數(shù)各處理中功能菌GlO在根際的定殖數(shù)量。
[0044] 同樣的處理，重復(fù)做第二季（表2)。
[0045] 表1第一季生物基質(zhì)育苗40天對辣椒苗期生長的影響
[0046]

【權(quán)利要求】
1. 一株枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis)G10,保藏于中國微生物菌種保藏管理委員 會普通微生物中心，保藏日期為2014年11月3日，保藏編號為CGMCC NO. 9921。
2. 權(quán)利要求1所述的枯草芽孢桿菌G10在制備蔬菜育苗生物基質(zhì)中的應(yīng)用。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于權(quán)利要求1所述的枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis)G10在制備辣椒育苗生物基質(zhì)中的應(yīng)用。
4. 一種功能型蔬菜育苗生物基質(zhì)，其特征在于由普通育苗基質(zhì)中添加權(quán)利要求1所述 的枯草芽孢桿菌G10發(fā)酵液得到。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的功能型蔬菜育苗生物基質(zhì)，其特征在于所述的普通育苗基質(zhì) 中含有機(jī)質(zhì)（基質(zhì)干重，下同）彡20%，總養(yǎng)分（N+P205+K20)1. 5%?7%，水分彡55%，pH 值 5. 5 ?7. 5, Ec < 2. 5ms/cm〇
6. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的功能型蔬菜育苗生物基質(zhì)，其特征在于所述的功能型蔬菜育 苗生物基質(zhì)中枯草芽孢桿菌G10活菌數(shù)彡2. OX 107CFU/g基質(zhì)干重。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的功能型蔬菜育苗生物基質(zhì)，其特征在于所述的枯草芽孢桿菌 G10發(fā)酵液通過以下方法制備：將保藏號為CGMCC NO. 9921的枯草芽孢桿菌G10接種到PDA 培養(yǎng)液中，進(jìn)行液體發(fā)酵生產(chǎn)，發(fā)酵生產(chǎn)的條件為：pH6. 0?7. 0,發(fā)酵溫度范圍30?35°C， 攪拌速度為170?200轉(zhuǎn)/分鐘，發(fā)酵中后期形成芽孢，發(fā)酵時(shí)間為48h，使發(fā)酵液中含菌或 芽孢量彡IX 101°個(gè)/ml。
8. 權(quán)利要求4所述的功能型蔬菜育苗生物基質(zhì)的制備方法，其特征在于包含以下步 驟： (1) 制備枯草芽孢桿菌G10發(fā)酵液，使發(fā)酵液中含菌或芽孢量> IX 101°個(gè)/ml ; (2) 將步驟⑴制備的枯草芽孢桿菌G10發(fā)酵液加入普通育苗基質(zhì)中，發(fā)酵液的接入量 為 3 ?5% (v/w)。
9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的制備方法，其特征在于所述的普通育苗基質(zhì)中含有機(jī)質(zhì)（基 質(zhì)干重，下同）彡20%，總養(yǎng)分（奸?205+1(20) 1.5%?7%，水分彡55%，？11值5.5?7.5， Ec < 2. 5ms/cm〇
10. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的制備方法，其特征在于所述的功能型蔬菜育苗生物基質(zhì)中 枯草芽孢桿菌G10活菌數(shù)彡2. OX 107CFU/g基質(zhì)干重。
【文檔編號】C05F11/08GK104498413SQ201510007793
【公開日】2015年4月8日 申請日期:2015年1月7日 優(yōu)先權(quán)日:2015年1月7日
【發(fā)明者】沈其榮, 張楊, 李 榮, 文春燕, 高琦, 趙買瓊 申請人:南京農(nóng)業(yè)大學(xué)