一種基于瓊枝麒麟菜的細(xì)胞雜交栽培方法
【專利摘要】本發(fā)明屬海洋植物栽培領(lǐng)域，涉及一種基于瓊枝麒麟菜的細(xì)胞雜交栽培方法，是以野生型和人工養(yǎng)殖瓊枝麒麟菜為材料，用果膠酶和鮑魚消化道粗提酶混合液酶解獲得原生質(zhì)體，經(jīng)誘導(dǎo)原生質(zhì)體融合獲得雜合細(xì)胞，最后通過植物激素誘導(dǎo)培養(yǎng)雜合細(xì)胞獲得的新植株。本發(fā)明工藝簡單，可操作性強(qiáng)，利用野生和人工養(yǎng)殖的兩類瓊枝麒麟菜的原生質(zhì)體進(jìn)行融合，獲得雜合細(xì)胞，再誘導(dǎo)分化出完整植株的細(xì)胞雜交技術(shù)，獲得的新植株具有養(yǎng)殖周期短和抗逆性強(qiáng)的特點(diǎn)，可為瓊枝麒麟菜的產(chǎn)業(yè)化發(fā)展提供技術(shù)支持，可有效提高瓊枝麒麟菜養(yǎng)殖的經(jīng)濟(jì)和生態(tài)價(jià)值，具有現(xiàn)實(shí)意義。
【專利說明】一種基于瓊枝麒麟菜的細(xì)胞雜交栽培方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬海洋植物栽培領(lǐng)域，涉及一種細(xì)胞雜交栽培方法，具體是一種基于野生 型瓊枝麒麟菜和人工養(yǎng)殖瓊枝麒麟菜間的細(xì)胞雜交栽培方法。

【背景技術(shù)】
[0002]瓊枝麒麟菜（Betaphycus gelatinum)隸屬于紅藻門（Rhodophyta)、真紅藻 綱（F lorideae)、杉藻目（G igartina-les)、紅翔菜科（Solieriaceae)、瓊枝藻屬 (Betaphycus)，是海南一種特有的海洋紅藻，具有低脂肪、低熱量、高纖維、富含礦物質(zhì)、微 量元素和卡拉膠等特點(diǎn)，廣泛用作天然綠色保健食品、大型經(jīng)濟(jì)海洋貝類的餌料和提取卡 拉膠的化工原料，同時(shí)由于其生長過程中需吸收海水中的大量營養(yǎng)物質(zhì)，對(duì)海洋生態(tài)環(huán)境 起到良好的保護(hù)和修復(fù)作用，因此具有重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和生態(tài)價(jià)值，在食品、醫(yī)藥、日化及 其它科研領(lǐng)域具有極為重要的應(yīng)用。
[0003]由于瓊枝麒麟菜具有很高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，國內(nèi)外市場(chǎng)的需求量大，目前，我國海南省 是瓊枝麒麟菜的主產(chǎn)地之一，且大部分產(chǎn)量為野生采撈。由于采撈過度，以及在采撈過程中 對(duì)珊瑚礁的不斷破壞，野生瓊枝麒麟菜的資源日益減少，人工養(yǎng)殖已成為提高瓊枝麒麟菜 供應(yīng)量的重要方式。但人工養(yǎng)殖的瓊枝麒麟菜常因生長周期較長（約3個(gè)月收獲1次）和 抗逆性差（鹽度低于20%。時(shí)藻體大量死亡）而使養(yǎng)殖效益受到顯著影響。如何縮短養(yǎng)殖周 期和增強(qiáng)抗逆性已成為瓊枝麒麟菜養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)亟待解決的問題。
[0004] 細(xì)胞雜交是指用人工的方法把分離的不同品種或不同種的原生質(zhì)體誘導(dǎo)融合成 雜合細(xì)胞，再經(jīng)離體培養(yǎng)，誘導(dǎo)分化出完整植株的整個(gè)過程。大量研究表明原生質(zhì)體融合可 使海藻細(xì)胞進(jìn)行雜交，為有效地培育和改良具有各種優(yōu)良性狀的經(jīng)濟(jì)海藻開辟新的途徑， 因而廣泛應(yīng)用于各種經(jīng)濟(jì)海藻的性狀改良。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足而提供一種基于瓊枝麒麟菜的細(xì)胞雜交栽 培方法，利用野生和人工養(yǎng)殖的兩類瓊枝麒麟菜的原生質(zhì)體進(jìn)行融合，獲得雜合細(xì)胞，再誘 導(dǎo)分化出完整植株的細(xì)胞雜交技術(shù)，獲得的新植株具有的養(yǎng)殖周期短和抗逆性強(qiáng)的特點(diǎn)。
[0006] 本發(fā)明所采用的技術(shù)方案：
[0007] -種基于瓊枝麒麟菜的細(xì)胞雜交栽培方法，其步驟如下：
[0008] 1、原生質(zhì)體的分離
[0009] 選取野生種和人工養(yǎng)殖種瓊枝麒麟菜的新鮮藻體，經(jīng)消毒滅菌處理后加入混合酶 液，在光照< 5001ux和溫度20-25°C的條件下，酶解1. 5?2h，獲得兩種瓊枝麒麟菜的原生 質(zhì)體。所述混合酶液是指在酶液中含有2%的果膠酶、3. 5%的鮑魚消化道粗提酶和5mmol/ L葡萄糖酸鈉，pH為6. 5。
[0010] 所述鮑魚消化道粗提酶是取新鮮鮑魚消化道組織，重蒸水清洗干凈，冷凍干燥，研 缽中研磨成細(xì)粉，過60目篩，然后按5mL/g的加入量加入事先冷凍的0. 05mol/L磷酸緩沖 液（pH 7. 8)，超聲波（功率20kHz)輔助提取20min，最后，低溫離心（10000r/min)10min取 上清液，即為鮑魚消化道粗提酶液。
[0011] 2、原生質(zhì)體的融合
[0012] 將分離得到的原生質(zhì)體，洗滌液洗滌干凈，用f/2培養(yǎng)液分別制成原生質(zhì)體濃度 為10 4?105個(gè)/mL的原生質(zhì)體懸液，再加入CaCl2. H202、Mg Cl2. H202，使其濃度分別為5mmol/ L;然后將兩種原生質(zhì)體懸浮液按1:1比例混合，加入PEG (聚乙二醇）誘導(dǎo)兩種原生質(zhì)體融 合。
[0013] 所述的誘導(dǎo)原生質(zhì)體融合是在混合原生質(zhì)體懸浮液中加入PEG5000(分子量為 5000的聚乙二醇），使其濃度達(dá)到30%，處理時(shí)間為15min，處理溫度25?28°C，光照條件 為彡 5001ux。
[0014] 3、雜種細(xì)胞的選擇
[0015] 將含融合細(xì)胞的原生質(zhì)體懸液加到培養(yǎng)皿中，40°C保溫，加入含0. 8%瓊脂糖的 f/2培養(yǎng)液充分混勻，然后室溫冷卻凝固。顯微鏡下識(shí)別融合細(xì)胞，并做好標(biāo)記。
[0016] 4、雜合細(xì)胞的培養(yǎng)
[0017] 挑取單個(gè)已融合的細(xì)胞，用雜合培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)，直至融合細(xì)胞開始分裂并形成 2. 5?3cm細(xì)胞團(tuán)。所述雜合培養(yǎng)液是以f/2培養(yǎng)液為基礎(chǔ)培養(yǎng)液，并添加2, 4-D 0. 5 y g/ L、6-BA 0.25iig/L、瓊膠 0.5%。
[0018] 5、雜合細(xì)胞誘導(dǎo)再生植株
[0019] 將形成的細(xì)胞團(tuán)移入誘導(dǎo)培養(yǎng)液中通氣培養(yǎng)，誘導(dǎo)細(xì)胞團(tuán)生成新的植株。所述誘 導(dǎo)培養(yǎng)液是以f/2培養(yǎng)液為基礎(chǔ)培養(yǎng)液，并添加6-BA 0. 25 y g/L、IBA 0. 1 y g/L。
[0020] 本發(fā)明工藝簡單，利用野生和人工養(yǎng)殖的兩類瓊枝麒麟菜的原生質(zhì)體進(jìn)行融合， 獲得雜種細(xì)胞，再誘導(dǎo)分化出完整植株的細(xì)胞雜交技術(shù)，獲得的新植株具有養(yǎng)殖周期短和 抗逆性強(qiáng)的特點(diǎn)，可為瓊枝麒麟菜的產(chǎn)業(yè)化發(fā)展提供技術(shù)支持，具有現(xiàn)實(shí)意義。

【具體實(shí)施方式】
[0021] 下面結(jié)合實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明的【具體實(shí)施方式】作進(jìn)一步詳細(xì)描述。以下實(shí)施例用于 說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通 常按照常規(guī)條件，或按照制造廠商所建議的條件。
[0022] 實(shí)施例一
[0023] 1、原生質(zhì)體的分離：取采自海南三沙海域的野生種和文昌海域的人工養(yǎng)殖種瓊枝 麒麟菜的新鮮藻段，消毒海水洗去表面污物，在含〇. 5% KI的消毒海水中浸泡5min，再用消 毒海水沖洗3次，分別用消毒刀片細(xì)切成大小為1_2左右的碎段，然后加入混合酶液（2% 的果膠酶、3. 5%的鮑魚消化道粗提酶和5mmol/L葡萄糖酸鈉，pH為6. 5)充分混勻，在暗黑 (光照< 5001UX)和溫度20°C的條件下，酶解2h。酶解完畢，用孔徑30 y m的篩絹過濾，去 除未解壁的細(xì)胞團(tuán)，濾液2000r/min離心分離5min，獲得兩種瓊枝麒麟菜的原生質(zhì)體。
[0024] 2、原生質(zhì)體的融合：原生質(zhì)體用含有0. 5mol/L甘露醇的海水洗滌3次，用f/2培 養(yǎng)液（含 5mmol/LCaCl2. H202 和 5mmol/LMg Cl2. H202, pH 為 6. 0)制成濃度約為 104-105 個(gè) / mL的原生質(zhì)體懸液；其中野生型瓊枝麒麟菜原生質(zhì)體用0. 01 %中性紅染色5min。將兩種 原生質(zhì)體懸浮液按1:1比例混合，加入（分子量為5000的聚乙二醇）PEG5000,使其濃度達(dá) 到30%，在溫度25°C和弱光條件下，處理15min，誘導(dǎo)原生質(zhì)體融合。然后用含有0. 5mol/L 甘露醇的海水洗滌3次并低速離心（1000r/min)以去除PEG5000。
[0025] 3、雜合細(xì)胞的選擇：將0. 5mL含融合細(xì)胞的原生質(zhì)體懸液稀釋10倍分別加到10 個(gè)直徑為12cm的培養(yǎng)皿中，40°C保溫，加入含0. 8%瓊脂糖的f/2培養(yǎng)液10mL充分混勻，然 后室溫冷卻凝固。顯微鏡下識(shí)別融合細(xì)胞，并做好標(biāo)記。記錄試驗(yàn)數(shù)據(jù)，結(jié)果見表1。
[0026] 表1原生質(zhì)體的融合效果
[0027]

【權(quán)利要求】
1. 一種基于瓊枝麒麟菜的細(xì)胞雜交栽培方法，其特征在于，其步驟如下： 1) 、原生質(zhì)體的分離 選取野生種和人工養(yǎng)殖種瓊枝麒麟菜的新鮮藻體，經(jīng)消毒滅菌處理后加入混合酶液， 在光照< 5001ux和溫度20-25°C的條件下，酶解1. 5?2h，獲得兩種瓊枝麒麟菜的原生質(zhì) 體；所述混合酶液是指在酶液中含有2%的果膠酶、3. 5%的鮑魚消化道粗提酶和5mmol/L 葡萄糖酸鈉，pH為6.5 ; 2) 、原生質(zhì)體的融合 將分離得到的原生質(zhì)體，洗滌液洗滌干凈，用f/2培養(yǎng)液分別制成原生質(zhì)體濃度為 104?105個(gè)/mL的原生質(zhì)體懸液，再加入CaCl2. H202、Mg Cl2. H202，使其濃度分別為5mmol/ L ;然后將兩種原生質(zhì)體懸浮液按1:1比例混合，加入PEG誘導(dǎo)兩種原生質(zhì)體融合； 3) 、雜種細(xì)胞的選擇 將含融合細(xì)胞的原生質(zhì)體懸液加到培養(yǎng)皿中，40°C保溫，加入含0. 8%瓊脂糖的f/2培 養(yǎng)液充分混勻，然后室溫冷卻凝固；顯微鏡下識(shí)別融合細(xì)胞，并做好標(biāo)記； 4) 、雜合細(xì)胞的培養(yǎng) 挑取單個(gè)已融合的細(xì)胞，用雜合培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)，直至融合細(xì)胞開始分裂并形成 2. 5?3cm細(xì)胞團(tuán)；所述雜合培養(yǎng)液是以f/2培養(yǎng)液為基礎(chǔ)培養(yǎng)液，并添加2, 4-D 0. 5 y g/ L、6-BA 0? 25 ii g/L、瓊膠 0? 5% ; 5) 、雜合細(xì)胞誘導(dǎo)再生植株 將形成的細(xì)胞團(tuán)移入誘導(dǎo)培養(yǎng)液中通氣培養(yǎng)，誘導(dǎo)細(xì)胞團(tuán)生成新的植株；所述誘導(dǎo)培 養(yǎng)液是以f/2培養(yǎng)液為基礎(chǔ)培養(yǎng)液，并添加6-BA 0. 25 y g/L、IBA0. 1 y g/L。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于瓊枝麒麟菜的細(xì)胞雜交栽培方法，其特征在于：所述鮑 魚消化道粗提酶是取新鮮鮑魚消化道組織，重蒸水清洗干凈，冷凍干燥，研缽中研磨成細(xì) 粉，過60目篩，然后按5mL/g的加入量加入事先冷凍的0. 05mol/L磷酸緩沖液，超聲波輔助 提取20min，最后，低溫離心lOmin取上清液，即為鮑魚消化道粗提酶液。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于瓊枝麒麟菜的細(xì)胞雜交栽培方法，其特征在于：所述的 誘導(dǎo)原生質(zhì)體融合是在混合原生質(zhì)體懸浮液中加入PEG5000,使其濃度達(dá)到30 %，處理時(shí) 間為15min，處理溫度25?28°C，光照條件為彡5001ux。
【文檔編號(hào)】A01H4/00GK104450672SQ201410727000
【公開日】2015年3月25日 申請(qǐng)日期:2014年12月4日 優(yōu)先權(quán)日:2014年12月4日
【發(fā)明者】黃勃, 王小兵, 段澤林 申請(qǐng)人:海南大學(xué)