用于體外刺激全血的便攜設(shè)備的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及用于體外刺激全血的便攜設(shè)備，還涉及一種利用負(fù)壓力收集血液的非玻璃血液收集管。本發(fā)明公開了一種利用負(fù)壓力收集血液的非玻璃血液收集管，包括：非玻璃管；一種或多種抗凝血?jiǎng)?；一種或多種白細(xì)胞刺激劑；由負(fù)壓力活化的可視標(biāo)記物；以及密封所述收集管的可穿刺的自密封蓋；其中收集管內(nèi)的壓力與收集管外的壓力相比為負(fù)。
【專利說明】用于體外刺激全血的便攜設(shè)備
[0001]本發(fā)明是申請?zhí)枮?011800527669(國際申請?zhí)枮镻CT/US2011/058624)、申請日為2011年10月31日、發(fā)明名稱為“用于體外刺激全血的便攜設(shè)備”的發(fā)明申請的分案申請。
[0002]相關(guān)申請
[0003]本發(fā)明要求分別于2010年11月4日和2011年2月17日申請的美國分案申請編號61/410，223和61/443，907的權(quán)益。每個(gè)這些申請的內(nèi)容以引用的方式整體并入本文中。

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0004]本發(fā)明的實(shí)施方式一般地涉及能夠產(chǎn)生和維持設(shè)備內(nèi)的可控環(huán)境條件的便攜設(shè)備。一些實(shí)施方式一般地涉及設(shè)備在體外處理和刺激全血的用途。

【背景技術(shù)】
[0005]分子生物學(xué)領(lǐng)域中的研究顯示通過研究細(xì)胞的核糖核酸(RNA)可以推導(dǎo)出細(xì)胞的遺傳來源和功能活性。該信息可能應(yīng)用至臨床實(shí)踐，用于診斷感染，用于檢測是否存在表達(dá)致癌基因的細(xì)胞，用于檢測家族性疾病，用于監(jiān)控宿主防御機(jī)制的狀態(tài)以及用于確定HLA類型或其他識別標(biāo)記物。RNA以三種功能上不同的形式存在:核糖體RNA(rRNA)，轉(zhuǎn)運(yùn)RNA(tRNA)和信使RNA(mRNA)。穩(wěn)定的rRNA和tRNA參與翻譯中的催化過程，mRNA分子攜帶遺傳信息?？俁NA中僅有約1-5%由mRNA組成，約15%由tRNA組成，約80%由rRNA組成。
[0006]mRNA是重要的診斷工具，特別是當(dāng)用于定量觀察基因的上調(diào)或下調(diào)時(shí)。人類外周血液是mRNA分析的優(yōu)秀臨床來源。對血液中特定嵌合mRNA的檢測例如表明異常細(xì)胞的存在，且用于慢性髓細(xì)胞性白血病(CML)的分子診斷(Kawasaki E.S.，ClarkS.S., Coyne Μ.Y., Smith S.D., Champ 1 in R., Witte 0.N.,和 McCormick F.P.1988.Diagnosis of chronic myeloid and acute lymphocytic leukemias by detect1nof leukemia-specific mRNA sequences amplified in vitr0.Proc.Natl.Acad.Sc1.USA 85:5698-5702，Pachmann K., Zhao S., Schenk T.,Kantarjian H.，El-NaggarA.K., Siciliano M.J., Guo J.Q., Arlinghaus R.B.,和 Andreeff M.2001.Express1nof bcr—abl mRNA individual chronic myelogenous leukaemia cells as determinedby in situ amplificat1n.Br.J.Haematol.112:749-59)。微轉(zhuǎn)移癌細(xì)胞也可通過在血液中測定癌特異性mRNA來檢測，例如結(jié)腸癌的癌胚抗原(CEA)、前列腺癌的前列腺特異性抗原(PSA)、甲狀腺癌的甲狀腺球蛋白(Wingo S.T.，Ringel M.D.，Anderson J.S., PatelA.D., Lukes Y.D., Djuh Y.Y., Solomon B., Nicholson D.，Balducc1-Silano P.L., LevineM.A.，F(xiàn)rancis G.L，和 Tuttle R.M.1999.Quantitative reverse transcript1n-PCRmeasurement of thyroglobulin mRNA in peripheral blood of healthy subjects.Clin.Chem.45:785-89)、黑素瘤的絡(luò)氨酸酶(Pelkey T.J., Frierson H.F.Jr.，和 BrunsD.E.1996.Molecular and immunological detect1n of circulating tumor cells andmicrometastasis from solid tumors.Clin.Chem.42:1369-81)。另外,由于這些癌特異性mRNA的水平隨著處理而變化，因此對特定mRNA的定量在后續(xù)處理中提供有用的指標(biāo)。
[0007]由于血液中包含與白細(xì)胞(接近5000白細(xì)胞/yL)相比大量的無核紅細(xì)胞(接近5，000, 000細(xì)胞/ μ L)，因此在mRNA分析中第一步通常是將粒細(xì)胞或淋巴細(xì)胞從全血中分離。然而，由于在不同樣品中特定亞群的白細(xì)胞的回收率不一致，因此對于每個(gè)樣品確定分離的白細(xì)胞數(shù)量，結(jié)果常常表示為相對于白細(xì)胞的mRNA量,而不是mRNA/μ L血液。另外，mRNA量可能在漫長的分離過程中變化。
[0008]由于缺乏標(biāo)準(zhǔn)，科學(xué)界面臨著基因表達(dá)分析在不同研究所之間、不同實(shí)驗(yàn)之間存在差異的巨大問題。雖然最近的基因擴(kuò)增技術(shù)提供了模板DNA的絕對定量，但這些值不能轉(zhuǎn)化為原始材料中基因的量，因?yàn)槿鄙倜總€(gè)樣品中RNA回收產(chǎn)量和cNDA合成效率的信息?？俁NA經(jīng)常地用作mRNA定量的標(biāo)準(zhǔn)標(biāo)記物，且結(jié)果典型地表示為每μ g總RNA的基因量。然而，必須強(qiáng)調(diào)的是，總RNA并不代表mRNA，因?yàn)閙RNA片段僅為總RNA的1_5%，而且即使在總RNA量相同時(shí)，mRNA體積也會(huì)不同。總RNA或mRNA的產(chǎn)量也隨著采用何種方法而發(fā)生較大變化。一旦提取出RNA，接下來的步驟就是合成cDNA，而合成cDNA本身能夠產(chǎn)生不確定性，因?yàn)楝F(xiàn)有的方法并不能表明每次實(shí)驗(yàn)中每個(gè)RNA模板是否產(chǎn)生cDNA的單拷貝。為了避免上述問題，通過將靶基因的數(shù)據(jù)與持家基因或rRNA的數(shù)據(jù)相比較廣泛地使用相對定量。然而，對照基因的量通常不一致且可能在實(shí)驗(yàn)期間發(fā)生變化。并且，該變化顯示了臨床診斷的嚴(yán)重問題，因?yàn)槊總€(gè)臨床樣本都典型地在不同的時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行分析。
[0009]通常，從全血中分離純mRNA是非常困難的，因?yàn)槿邪ù罅康腞NA酶(來自粒細(xì)胞)和無核紅細(xì)胞。雖然各種RNA提取方法能夠用于全血(de Vries T.J., FourkourA., Punt C.J., Ruiter D.J.,和 van Muijen G.N.2000.Analysis of melanoma cellsin peripheral blood by reverse transcript1n-polymerase chain react1n fortyrosinase and MART-lafter mononuclear cell collect1n with cell preparat1ntubes: a comparison with the whole blood guanidinium isoth1cyanate RNAisolat1n method.Melanoma Research 10:119—26，Johansson M., Pisa E.K., TormanenV., Arstrand K.,和 Kagedal Bl.2000.Quantitative analysis of tyrosinasetranscripts in blood.Clin.Chem.46:921-27, Wingo S.T.,Ringel M.D., AndersonJ.S., Patel A.D., Lukes Y.D., Djuh Y.Y., Solomon B., Nicholson D., Balducc1-SilanoP.L., Levine M.A.，F(xiàn)rancis G.L.,和 Tuttle R.M.1999.Quantitative reversetranscript1n-PCR measurement of thyroglobulin mRNA in peripheral blood ofhealthy subjects.Clin.Chem.45:785-89),但是分析過程是勞動(dòng)密集型，需要幾輪離心，并且需要對消除核糖核酸酶的活性必要的小心操作。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0010]在一些實(shí)施方式中，本文中提供了一種用于在運(yùn)輸血液期間體外刺激血液的系統(tǒng)，所述系統(tǒng)包括便攜設(shè)備，所述便攜設(shè)備能夠產(chǎn)生和維持設(shè)備內(nèi)的至少兩個(gè)溫度范圍，所述設(shè)備包括具有內(nèi)部腔體的隔熱設(shè)備殼、加熱源以及冷卻源。在一些實(shí)施方式中，內(nèi)部腔體的尺寸設(shè)為容納一個(gè)或多個(gè)血液收集管。在一些實(shí)施方式中，在啟動(dòng)加熱源后，加熱源能夠?qū)⑺鲈O(shè)備內(nèi)的溫度維持在第一溫度至少1小時(shí)，所述第一溫度在約25°C至40°C之間的范圍內(nèi)，并且將所述溫度維持在圍繞所述維持溫度±2.5°C的范圍內(nèi)。在一些實(shí)施方式中，冷卻源能夠?qū)⑺鲈O(shè)備內(nèi)的溫度維持在低于室溫的第二溫度至少4小時(shí)，并且圍繞所述維持溫度的溫度波動(dòng)在± 5 °C以內(nèi)。
[0011]在一個(gè)實(shí)施方式中，第一溫度階段包括37°C ±2.5°C的維持溫度。在一個(gè)實(shí)施方式中，第二溫度階段包括4°C ±5°C的維持溫度。
[0012]在一些實(shí)施方式中，所述系統(tǒng)進(jìn)一步包括多個(gè)血液收集管，所述血液收集管包含抗凝血?jiǎng)┖痛碳Ｔ谝恍┻@樣的實(shí)施方式中，刺激劑包括化學(xué)治療藥物、免疫調(diào)節(jié)劑、疫苗、佐劑、重組蛋白、單克隆抗體、凝血素、致病因子衍生物、過敏原以及它們的組合物中的一種或多種。在一些實(shí)施方式中，所述系統(tǒng)進(jìn)一步包括含有抗凝血?jiǎng)┖痛碳┑南鄳?yīng)控制溶劑的多個(gè)第二血液收集管。
[0013]在一些實(shí)施方式中，所述血液收集管包括具有與收集管外的壓力相比為負(fù)的收集管內(nèi)的壓力的非玻璃管，一種或多種抗凝血?jiǎng)?，一種或多種白細(xì)胞刺激劑以及密封所述收集管的可穿刺的自密封蓋。在某些實(shí)施方式中，血液收集管進(jìn)一步包括由負(fù)壓力活化的可視標(biāo)記物。
[0014]在一些實(shí)施方式中，所述系統(tǒng)進(jìn)一步包括溫度記錄設(shè)備，其中所述設(shè)備連續(xù)記錄腔體內(nèi)的溫度用于后續(xù)讀取。
[0015]在一些實(shí)施方式中，所述設(shè)備進(jìn)一步包括至少一個(gè)額外的隔熱容器，所述隔熱容器配置為放置于所述便攜設(shè)備中以容納加熱設(shè)備和血液收集管。
[0016]在某些實(shí)施方式中，加熱源為電池供電。在某些實(shí)施方式中，加熱源由一個(gè)或多個(gè)原(一次性)電池供電。在某些實(shí)施方式中，加熱源由一個(gè)或多個(gè)二次(可充電)電池供電。在其他實(shí)施方式中，加熱源通過化學(xué)反應(yīng)產(chǎn)生熱。
[0017]在一些實(shí)施方式中，溫度記錄設(shè)備為電池供電。在某些實(shí)施方式中，溫度記錄設(shè)備由一個(gè)或多個(gè)原(一次用)電池供電。在某些實(shí)施方式中，溫度記錄設(shè)備由一個(gè)或多個(gè)二次(可充電)電池供電。在某些實(shí)施方式中，冷卻源包含可重復(fù)使用的冷卻劑。
[0018]在一些實(shí)施方式中，提供一種用于利用負(fù)壓力收集血液的非玻璃血液收集管，其包括:非玻璃管，一種或多種抗凝血?jiǎng)?，一種或多種白細(xì)胞刺激劑，利用負(fù)壓力活化的可視標(biāo)記物，密封所述收集管的可穿刺的自密封蓋。在一些實(shí)施方式中，收集管內(nèi)的壓力與收集管外的壓力相比為負(fù)，從而允許基于管內(nèi)的負(fù)壓力收集精準(zhǔn)體積的血液。
[0019]在一些實(shí)施方式中，所述一種或多種白細(xì)胞刺激劑選自由下列所組成的組:化學(xué)治療藥物、免疫調(diào)節(jié)劑、疫苗、佐劑、重組蛋白、單克隆抗體、凝血素、致病因子衍生物、過敏原以及它們的組合。
[0020]在一些實(shí)施方式中，所述一種或多種抗凝血?jiǎng)┌ǜ嗡?。在其他的?shí)施方式中，在肝素之外使用其他抗凝血?jiǎng)?，或使用其他抗凝血?jiǎng)┐娓嗡亍?br> [0021]在一些實(shí)施方式中，所述管適于在約25°C至40°C之間的溫度孵育至少約1小時(shí)。另外，在一些實(shí)施方式中，所述管適于在低至足以冷凍血液樣品的溫度下存儲(chǔ)，并且其中所述收集管在所述溫度下在結(jié)構(gòu)上穩(wěn)定(例如在冷凍或溶化時(shí)不會(huì)破裂或破碎)。
[0022]在一些實(shí)施方式中，還提供了一種獲得血液樣品的方法，其包括:檢查非玻璃血液收集管是否存在負(fù)壓力活化的可視標(biāo)記物，所述非玻璃血液收集管包括一種或多種抗凝血齊IJ、一種或多種白細(xì)胞刺激劑、負(fù)壓力活化的可視標(biāo)記物以及密封收集管的可穿刺的自密封蓋；若存在活化的標(biāo)記物，則穿刺患者的靜脈系統(tǒng)的靜脈；穿刺自密封蓋；允許血液填充收集管直至負(fù)壓力被補(bǔ)償或直至收集到所需的體積。
[0023]在一些實(shí)施方式中，提供了一種用于體外刺激血液樣品的方法，其包括:如上所述從患者獲得血液樣品；將包含血液樣品的血液收集管放置于便攜設(shè)備中，并且啟動(dòng)電池供電的加熱源；該便攜設(shè)備能夠產(chǎn)生和維持設(shè)備內(nèi)的可控環(huán)境，其中所述便攜設(shè)備包括具有尺寸設(shè)為容納血液收集管的內(nèi)部腔體的隔熱設(shè)備殼、電池供電的加熱源、冷卻源。
[0024]在一些實(shí)施方式中，在啟動(dòng)加熱源后加熱源能夠?qū)?nèi)部腔體內(nèi)的溫度維持在約25°C至40°C之間的范圍至少1小時(shí)。在一些實(shí)施方式中，冷卻源包括可重復(fù)使用的冷卻劑，并且能夠?qū)⒃O(shè)備內(nèi)的溫度維持在低于室溫的溫度至少4小時(shí)。
[0025]在一些實(shí)施方式中，所述方法進(jìn)一步包括:檢查第二非玻璃血液收集管是否存在負(fù)壓力活化的可視標(biāo)記物，其中所述第二非玻璃血液收集管包括一種或多種抗凝血?jiǎng)┖鸵环N或多種白細(xì)胞刺激劑的控制溶劑；若存在活化的標(biāo)記物，則穿刺非玻璃血液收集管的自密封蓋，并從患者的穿刺的血管收集第二血液樣品；并且將含有第二血液樣品的第二血液收集管放置于便攜設(shè)備中。
[0026]在一些實(shí)施方式中，所述方法還包括血液樣品的體外分析，其中包括從便攜設(shè)備移除第一和第二血液樣品，并測定來自第一和第二血液樣品的一種或多種祀mRNA或一種或多種靶蛋白。
[0027]另外，提供了一種體外刺激血液樣品的方法，其包括:從患者收集第一血液樣品至血液收集管中，所述血液收集管包括非玻璃管、一種或多種抗凝血?jiǎng)┖鸵环N或多種白細(xì)胞刺激劑；將血液收集管放置于上述用于體外刺激血液的系統(tǒng)中，并啟動(dòng)電池供電的加熱源，從而體外刺激血液樣品。
[0028]還提供了一種用于體外刺激血液樣品的試劑盒，其包括:利用負(fù)壓力收集血液的非玻璃血液收集管，能夠產(chǎn)生和維持設(shè)備內(nèi)的至少兩個(gè)溫度階段的便攜設(shè)備；所述非玻璃血液收集管包括非玻璃管(其中收集管內(nèi)的壓力與收集管外的壓力相比為負(fù))、一種或多種抗凝血?jiǎng)?、一種或多種白細(xì)胞刺激劑以及密封收集管的可穿刺的自密封蓋；所述便攜設(shè)備能夠產(chǎn)生和維持設(shè)備內(nèi)的至少兩個(gè)溫度階段，包括隔熱設(shè)備殼、加熱源以及冷卻源；所述隔熱設(shè)備殼具有尺寸設(shè)為容納多個(gè)血液收集管的內(nèi)部腔體；在啟動(dòng)加熱源后所述加熱源能夠?qū)⒃O(shè)備內(nèi)的溫度維持在約25°C至40°C之間的范圍至少1小時(shí)，其中圍繞所述維持溫度的波動(dòng)在±2.5°C以內(nèi)，并且
[0029]所述冷卻源能夠?qū)⒃O(shè)備內(nèi)的溫度維持在低于室溫的第二溫度至少4小時(shí)，并且圍繞第二溫度的溫度波動(dòng)在± 5 °C以內(nèi)。
[0030]在一些實(shí)施方式中，試劑盒中的設(shè)備在約37°C ±2.5°C的維持溫度下維持第一溫度階段。在一些實(shí)施方式中，試劑盒中的設(shè)備在約4°C ±5°C的維持溫度下維持第二溫度階段。
[0031]在一些實(shí)施方式中，試劑盒包括選自由下列所組成的組的一種或多種白細(xì)胞刺激齊U:化學(xué)治療藥物、免疫調(diào)節(jié)劑、疫苗、佐劑、重組蛋白、單克隆抗體、凝血素、致病因子衍生物、過敏原以及它們的組合。
[0032]在一些實(shí)施方式中，試劑盒包括一種或多種抗凝血?jiǎng)鲆环N或多種抗凝血?jiǎng)﹥H包括肝素或包括肝素與其他的抗凝血?jiǎng)┑慕M合。
[0033]在一些實(shí)施方式中，試劑盒的血液收集管適于在約25°C至40°C之間的溫度孵育至少約1小時(shí)。在一些實(shí)施方式中，血液收集管適于在低至足以冷凍血液樣品的溫度下存儲(chǔ)，并且其中收集管在所述溫度下在結(jié)構(gòu)上穩(wěn)定。
[0034]在一些實(shí)施方式中，提供了一種用于在血液運(yùn)輸期間體外刺激血液的系統(tǒng)，所述系統(tǒng)包括:能夠產(chǎn)生和維持設(shè)備內(nèi)的可控環(huán)境的便攜設(shè)備。所述設(shè)備包括隔熱設(shè)備殼、多個(gè)血液收集管、電池供電的加熱源以及冷卻源；其中所述隔熱設(shè)備殼具有尺寸設(shè)為容納多個(gè)血液收集管的內(nèi)部腔體，所述多個(gè)血液收集管包含抗凝血?jiǎng)┖痛碳?。在某些?shí)施方式中，在啟動(dòng)加熱源后加熱源能夠?qū)⒃O(shè)備內(nèi)的溫度維持在約25°C至40°C之間的范圍內(nèi)至少1小時(shí)。在一些實(shí)施方式中，冷卻源包含可重復(fù)使用的冷卻劑。在某些實(shí)施方式中，冷卻源能夠?qū)⒃O(shè)備內(nèi)的溫度維持在低于室溫的溫度至少4小時(shí)。在某些實(shí)施方式中，冷卻源能夠?qū)⒃O(shè)備內(nèi)的溫度維持在低于室溫的溫度約4至24小時(shí)。在某些實(shí)施方式中，系統(tǒng)還包括多個(gè)第二血液收集管，其包含抗凝血?jiǎng)┖痛碳┑南鄳?yīng)控制溶劑。在一些實(shí)施方式中，系統(tǒng)進(jìn)一步包括溫度記錄設(shè)備，其中所述設(shè)備連續(xù)記錄腔體內(nèi)的溫度用于后續(xù)讀取。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0035]圖1表示根據(jù)某些實(shí)施方式的填充有血液樣品的一組真空血液收集管；
[0036]圖2表不根據(jù)某些實(shí)施方式在存儲(chǔ)容器或孵育器中體外刺激血液；
[0037]圖3表示根據(jù)某些實(shí)施方式從全血樣品分離白細(xì)胞的示意性過程；
[0038]圖4表示根據(jù)某些實(shí)施方式從全血樣品分離的白細(xì)胞的存儲(chǔ)和配送；
[0039]圖5為示出根據(jù)某些實(shí)施方式的mRNA分析的準(zhǔn)備步驟的示意性流程圖；
[0040]圖6為根據(jù)本發(fā)明所述實(shí)施方式從設(shè)備內(nèi)部記錄的溫度隨著時(shí)間的圖表；
[0041]圖7通過示出抽到管中的水重量在各個(gè)管之間沒有顯著不同從而描述了制造負(fù)壓力管的可再現(xiàn)性；
[0042]圖8通過示出抽到管中的水重量在制造后存儲(chǔ)14天后沒有顯著不同從而描述了制造的負(fù)壓力管在存儲(chǔ)后的穩(wěn)定性；
[0043]圖9A-9D表示在制造的負(fù)壓力管中進(jìn)行的刺激實(shí)驗(yàn)與現(xiàn)有的多孔板(mult1-wellstrip)方法相比的比較結(jié)果；
[0044]圖10A-10C表示在制造的負(fù)壓力管中進(jìn)行的基因誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)與現(xiàn)有的多孔板方法的額外的比較結(jié)果；
[0045]圖11A-11B描述關(guān)于血液樣品隨時(shí)間和刺激后的穩(wěn)定性的數(shù)據(jù)；
[0046]圖12A-12F描述關(guān)于在不同溫度下刺激和孵育導(dǎo)致的基因誘導(dǎo)水平的數(shù)據(jù)；
[0047]圖13A-13B描述關(guān)于在本文所述的便攜設(shè)備中孵育導(dǎo)致的基因誘導(dǎo)水平與在溫度控制孵育器中相比的數(shù)據(jù)；
[0048]圖14描述在本文所述的便攜設(shè)備中孵育的6個(gè)單獨(dú)的管中記錄的溫度曲線。

【具體實(shí)施方式】
[0049]需要體外血液刺激的改進(jìn)方法和完成這種方法的設(shè)備。一些現(xiàn)有的體外刺激的方法依賴于抽血后的條件。然而，長時(shí)間存儲(chǔ)血液不符合生理要求，會(huì)給血液樣品和試驗(yàn)帶來負(fù)面影響。另外，mRNA誘導(dǎo)可能會(huì)在存儲(chǔ)中變化。理想地，應(yīng)在抽血后立即刺激血液。處理血液，在37°C下孵育，分離白細(xì)胞或在_80°C的溫度下存儲(chǔ)刺激后的血液，這些操作在很多情況或地點(diǎn)都是不現(xiàn)實(shí)的。例如，若在精密實(shí)驗(yàn)室或醫(yī)院外的位置抽血，則在生理?xiàng)l件下孵育或在_80°C的溫度下存儲(chǔ)刺激后的血液都是不現(xiàn)實(shí)的。
[0050]另外，需要一種能夠用于一致地且可重復(fù)地體外刺激全血的便攜設(shè)備。還需要一種能夠?qū)Υ碳さ难杭?xì)胞進(jìn)行孵育的便攜設(shè)備以及使用其的方法。還需要一種能夠從刺激后的血液細(xì)胞分離并存儲(chǔ)白細(xì)胞的便攜設(shè)備以及使用其的方法。
[0051]在某些實(shí)施方式中，公開了用于體外刺激全血的方法和設(shè)備。在一些實(shí)施方式中，本文中公開的設(shè)備是便攜式的。在某些實(shí)施方式中，設(shè)備可用于一些地點(diǎn)，例如醫(yī)院或?qū)嶒?yàn)室外面的地方。在某些實(shí)施方式中，設(shè)備配置為自調(diào)節(jié)，例如維持設(shè)備內(nèi)的某個(gè)所需溫度一定的時(shí)間。在某些實(shí)施方式中，隨著時(shí)間維持一個(gè)以上的溫度(例如，實(shí)現(xiàn)順序所需的溫度)。在一些實(shí)施方式中，設(shè)備適于在全血樣品的刺激、孵育和存儲(chǔ)以及運(yùn)輸中順序使用，如下更詳細(xì)的描述。
[0052]在某些實(shí)施方式中，從患者收集全血至血液真空收集管中。具有基因特異性引物和探針的相對直接地鑒定和生產(chǎn)，基因擴(kuò)增技術(shù)能夠鑒別和定量特異mRNA水平，甚至是來自不同基因的庫的mRNA，這使得全血成為mRNA分析的理想材料。在一些實(shí)施方式中，一個(gè)或多個(gè)收集管包含血液刺激劑。在一些實(shí)施方式中，收集的全血在收集中肝素化。在一些實(shí)施方式中，全血被收集至兩個(gè)或更多個(gè)收集管中。刺激劑可以是液體或固體?？刹捎米阋詳噭?dòng)全血并加速與肝素和/或刺激劑混合的方式振蕩或移動(dòng)所述管。
[0053]在某些實(shí)施方式中，刺激劑包括化學(xué)治療藥物、免疫調(diào)節(jié)劑、疫苗、佐劑、重組蛋白、單克隆抗體、凝血素或致病因子衍生物。在某些實(shí)施方式中，化學(xué)治療藥物包括阿糖胞苷、紅比霉素、阿霉素、腎上腺素、依托泊苷、阿柔比星或米托蒽醌。在某些實(shí)施方式中，重組蛋白包括白介素(例如，白介素_2或白介素10和干擾素(例如、干擾素)。在某些實(shí)施方式中，致病因子的衍生物包括純化的蛋白衍生物(例如，pro比如結(jié)核菌素ppd)。使用其他刺激劑例如植物凝集素(PHA)、酵母聚糖、腫瘤壞死因子等。
[0054]在某些實(shí)施方式中，將血液收集至管中以后，在促進(jìn)刺激全血的條件下孵育血液。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，在生理?xiàng)l件下孵育血液。在某些實(shí)施方式中，使用約37°C的溫度以模仿生理?xiàng)l件。在某些實(shí)施方式中，使用約30°C至約33°C之間、約33°C至約35°C之間、約35°C至37°C之間或約37°C至39°C之間的溫度。在某些實(shí)施方式中，將樣品在生理溫度下維持并孵育約30分鐘至約4小時(shí)，包括約30分鐘至約1小時(shí)，約1小時(shí)至約2小時(shí)，約2小時(shí)至約3小時(shí)，約3小時(shí)至約4小時(shí)以及它們的重疊范圍。在某些實(shí)施方式中，孵育時(shí)間可比4小時(shí)更長(例如，4至6小時(shí)，6至8小時(shí)，8至10小時(shí)，10至12小時(shí)，12至24小時(shí)以及它們的重疊范圍)。
[0055]在某些實(shí)施方式中，樣品置于具有能夠加熱一個(gè)或多個(gè)管的加熱源的存儲(chǔ)容器或孵育器中。優(yōu)選地，存儲(chǔ)容器或孵育器中的加熱源能夠在血液樣品中維持生理?xiàng)l件(例如，接近生理溫度)。在某些實(shí)施方式中，加熱源能夠在血液管內(nèi)維持生理?xiàng)l件約30分鐘至約4小時(shí)，包括約30分鐘至1小時(shí)，約1小時(shí)至約2小時(shí)，約2小時(shí)至約3小時(shí)，約3小時(shí)至約4小時(shí)以及它們的重疊范圍。在一些實(shí)施方式中，孵育時(shí)間大于4小時(shí)(例如約6至8小時(shí)或8小時(shí)至過夜)。在某些實(shí)施方式中，加熱源包括加熱板。在某些實(shí)施方式中，加熱板(或其他加熱設(shè)備)可用電池供電以提供熱。在某些實(shí)施方式中，計(jì)時(shí)器調(diào)節(jié)加熱器的操作時(shí)間，從而在所需的孵育時(shí)間段后，將加熱器關(guān)閉。在某些實(shí)施方式中，使用珀?duì)栙N加熱源。在某些實(shí)施方式中，使用獨(dú)立可燃燃料設(shè)備用于產(chǎn)生熱。在某些實(shí)施方式中，加熱設(shè)備可通過放熱化學(xué)反應(yīng)或過程提供熱(例如，“封口包(smack-pack)”)。在一些實(shí)施方式中，使用冷卻管，其中使所需溫度的水通過孵育器的壁循環(huán)從而將孵育器的內(nèi)部加熱(或冷卻)至所需的孵育或存儲(chǔ)溫度。在一些實(shí)施方式中，使用隔離體(在設(shè)備內(nèi)部作為一個(gè)整體)將管置于與加熱源非常接近的位置從而改善孵育溫度隨時(shí)間的穩(wěn)定性。與加熱源類似地，在某些實(shí)施方式中，冷卻源可以是通過電池或基于化學(xué)反應(yīng)物(例如尿素、硫酸銨和水)供電。冷卻系統(tǒng)可選地包括發(fā)動(dòng)機(jī)類似設(shè)備例如斯特林冷卻器(Stirling Cooler) (FPSC),或電氣設(shè)備例如珀?duì)栙N冷卻器(Peltier cooler)。在某些實(shí)施方式中，使用獨(dú)立的可重復(fù)使用的冰包。在一些實(shí)施方式中，冷卻系統(tǒng)維持設(shè)備內(nèi)的溫度至少24小時(shí)(例如，在運(yùn)輸便攜設(shè)備的整個(gè)過程中)。在一些實(shí)施方式中，冷卻系統(tǒng)能夠維持設(shè)備內(nèi)的溫度約24小時(shí)至約72小時(shí)。在某些實(shí)施方式中，當(dāng)加熱源啟動(dòng)時(shí)，該時(shí)間段包括孵育時(shí)期。同樣，在一些實(shí)施方式中，貫穿整個(gè)運(yùn)輸過程，當(dāng)加熱源啟動(dòng)時(shí)在生理溫度下孵育收集管，然后，當(dāng)加熱源關(guān)閉時(shí)在較低溫度下存儲(chǔ)收集管(例如，以穩(wěn)定mRNA)。
[0056]在某些實(shí)施方式中，存儲(chǔ)容器或孵育器配置為被運(yùn)輸或配送到醫(yī)院或?qū)嶒?yàn)室同時(shí)在血液樣品管中維持生理?xiàng)l件(例如，在配送設(shè)備的同時(shí)刺激，隨后冷卻血液樣品)。在某些實(shí)施方式中，將血液樣品從存儲(chǔ)容器或孵育器移除，冷卻至約_80°C的溫度并存儲(chǔ)直至后續(xù)處理和測試。在一些實(shí)施方式中，孵育器同時(shí)作為存儲(chǔ)容器，使用者改變孵育器的配置(例如移除加熱板并安裝冰包)從而將孵育器轉(zhuǎn)變?yōu)榇鎯?chǔ)容器。然而在一些實(shí)施方式中，使用分離的孵育器和存儲(chǔ)容器。
[0057]在其他的實(shí)施方式中，單個(gè)設(shè)備發(fā)揮孵育器、存儲(chǔ)容器和配送容器的作用。例如，在某些實(shí)施方式中，提供單個(gè)隔離的設(shè)備(例如容器)，其包括加熱源和冷卻源。在某些實(shí)施方式中，設(shè)備進(jìn)一步包括溫度記錄設(shè)備，其允許對設(shè)備內(nèi)的溫度歷史進(jìn)行分析。在某些實(shí)施方式中，設(shè)備可選地配置有用于收集血液的管。在這樣的實(shí)施方式中，所述管可選地包含所需的刺激劑，例如本文中所述的那些。因此，提供單個(gè)的設(shè)備，其允許使用刺激劑在所需的時(shí)間段內(nèi)在生理溫度下刺激(例如孵育)血液樣品，然后將刺激后的血液樣品在較低的溫度(例如在室溫或低于室溫)下孵育一段時(shí)間，上述每一步都發(fā)生在將設(shè)備配送至對基因表達(dá)進(jìn)行分析的地點(diǎn)過程中。已經(jīng)確定在這樣的溫度下進(jìn)行刺激后mRNA的穩(wěn)定性。不管mRNA的穩(wěn)定性如何，溫度記錄設(shè)備提供一定程度的樣品的質(zhì)量控制，可對沒有暴露于適宜刺激條件(例如溫度過高或過低，孵育時(shí)間縮短或延長)的樣品進(jìn)行鑒別和丟棄。
[0058]這樣的設(shè)備特別有利于抽血實(shí)驗(yàn)室使用。為了避免不同實(shí)驗(yàn)室在進(jìn)行體外刺激中的差異，如本文中所述的設(shè)備設(shè)置為能夠在多個(gè)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行可控的且可重復(fù)的體外刺激。實(shí)驗(yàn)室首先從患者獲得血液樣品。在某些實(shí)施方式中，血液抽入標(biāo)準(zhǔn)的血液收集管中，但在優(yōu)選的實(shí)施方式中，血液直接抽入提供給實(shí)驗(yàn)室的管中，管中包含所需的刺激劑(或控制溶劑)。在某些實(shí)施方式中，可選地利用管的真空壓進(jìn)行抽血，從而降低由于收集的體積而產(chǎn)生的差異。收集至含有刺激劑的管中后，將管置于設(shè)備中，并啟動(dòng)加熱源和冷卻源。在某些實(shí)施方式中，加熱源和冷卻源整合在設(shè)備中，而在某些實(shí)施方式中，使用者將啟動(dòng)的源置于設(shè)備中。在某些實(shí)施方式中，溫度記錄設(shè)備可選地啟動(dòng)并置于設(shè)備中，而在另外的實(shí)施方式中，溫度記錄設(shè)備整合在設(shè)備中。最后，實(shí)驗(yàn)室將設(shè)備密封并配送到后續(xù)的基因表達(dá)分析的中央位置。在這樣的實(shí)施方式中，使用標(biāo)準(zhǔn)的橡膠管蓋。在于實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行刺激和分離的其他實(shí)施方式中，如下面更詳細(xì)描述的，使用具有隔離基質(zhì)的專用蓋板。
[0059]如本文中所述的那樣，設(shè)備由對設(shè)備內(nèi)的環(huán)境帶來隔離效果的材料(例如，聚苯乙烯泡沫，玻璃纖維等)構(gòu)成。因此，設(shè)備與加熱源和冷卻源組合，起到將設(shè)備內(nèi)(例如，放置了含有血液的管的地方)的溫度維持在所需溫度所需的時(shí)間長度的作用。在某些實(shí)施方式中，所維持的溫度曲線從接近生理溫度的起始時(shí)間段(例如用于刺激血液樣品)開始，接著是較低溫度的第二時(shí)間段(例如用于穩(wěn)定刺激后的mRNA)。例如參見圖6?？梢岳斫?，在對mRNA進(jìn)行刺激或任何相關(guān)誘導(dǎo)后，降低的溫度(與加熱源產(chǎn)生的生理溫度相比)足以將誘導(dǎo)的mRNA維持較長的時(shí)間段(足以將設(shè)備配送到能長期保存樣品的中央實(shí)驗(yàn)室)。
[0060]在替代的實(shí)施方式中，可在原位刺激血液樣品后原位分離白細(xì)胞。孵育后，將含有血液樣品的管從孵育器移除。可將蓋從血液管移除并用具有白細(xì)胞捕獲膜的蓋代替。可將若干白細(xì)胞濾膜層疊在一起以提高捕獲的白細(xì)胞的產(chǎn)量。在一些實(shí)施方式中，白細(xì)胞捕獲膜位于蓋上，使得當(dāng)蓋與樣品管卡合時(shí)，白細(xì)胞膜朝向血液樣品(例如，與血液樣品并置)。在某些實(shí)施方式中，含有白細(xì)胞捕獲膜的蓋還包括吸濕材料以及能夠打開以移除吸收材料的蓋。在某些實(shí)施方式中，白細(xì)胞膜位于蓋的近端，吸水材料位于蓋的遠(yuǎn)端。在某些實(shí)施方式中，白細(xì)胞捕獲膜包括白細(xì)胞吸附介質(zhì)或適用捕獲白細(xì)胞的其他類似纖維或玻璃基質(zhì)。
[0061]在某些實(shí)施方式中，可通過倒轉(zhuǎn)樣品管并允許重力拉動(dòng)樣品材料穿過膜，從而捕獲白細(xì)胞。在其他實(shí)施方式中，使用離心、真空壓、正大氣壓或其他類似有效手段用來使樣品材料移動(dòng)穿過膜。吸水材料會(huì)從血液樣品吸收水和其他材料，例如紅細(xì)胞,而白細(xì)胞被捕獲并保留在蓋中的濾膜上。
[0062]在某些實(shí)施方式中，存儲(chǔ)容器或孵育器可用來在分離白細(xì)胞以后存儲(chǔ)、運(yùn)輸和/或配送樣品。如前面討論的那樣，在某些實(shí)施方式中，存儲(chǔ)容器或孵育器可冷卻或加熱樣品以在配送和存儲(chǔ)期間維持所需的條件。在某些實(shí)施方式中，存儲(chǔ)容器中使用環(huán)境條件。在一些實(shí)施方式中，使用第二“封口包”或其他冷卻或加熱產(chǎn)生機(jī)制來建立所需的存儲(chǔ)溫度(例如多溫度方案)。
[0063]在某些實(shí)施方式中，在從血液樣品分離白細(xì)胞之后，準(zhǔn)備mRNA分析。mRNA分析的準(zhǔn)備可通過以下來進(jìn)行:對白細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞裂解以產(chǎn)生含有mRNA的裂解產(chǎn)物，將裂解產(chǎn)物轉(zhuǎn)移至GENEPLATE以捕獲mNRA，并對mRNA進(jìn)行定量。在一些實(shí)施方式中，在現(xiàn)場進(jìn)行分離，然后冷凍以備分析。在某些實(shí)施方式中，在現(xiàn)場(例如在實(shí)驗(yàn)室外)將mRNA轉(zhuǎn)化成cDNA，然后冷凍以備后續(xù)的擴(kuò)增分析(或其他種類的基因表達(dá)分析)。
[0064]在使用具有白細(xì)胞捕獲蓋的管的一些實(shí)施方式中，將具有白細(xì)胞捕獲膜的蓋從血液收集管移除。在某些實(shí)施方式中，接著打開蓋上的蓋板以移除吸濕材料，吸濕材料可丟棄(或回收和/或用于其他分析)。然后將新的管連接至含有白細(xì)胞捕獲膜和白細(xì)胞的蓋?？纱┻^用于移除吸濕材料的蓋板向管中添加裂解緩沖液。使用裂解緩沖液將捕獲于濾膜上的白細(xì)胞裂解以從白細(xì)胞釋放mRNA。可通過離心、抽真空、正壓力或乙醇洗滌后抽真空來完成裂解產(chǎn)物向基因板或其他收集管的轉(zhuǎn)移。通過產(chǎn)生cDNA和PCR擴(kuò)增cDNA來對mRNA進(jìn)行定量。特別優(yōu)選的實(shí)施方式使用TaqMan PCR(熒光定量PCR)來定量mRNA。
[0065]關(guān)于可用于一些實(shí)施方式的裂解緩沖液的組成的更多細(xì)節(jié)可在2006年3月15日申請的美國專利申請第11/376，018號中找到，目前該申請為懸而未決狀態(tài)，其以引用方式整體并入本文中。在一些實(shí)施方式中，從mRNA來合成cDNA。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，接著使用實(shí)時(shí)PCR且使用專門設(shè)計(jì)用于擴(kuò)增某些所需基因的引物(例如已建立的或推定的疾病標(biāo)記物)進(jìn)行cDNA擴(kuò)增。關(guān)于某些實(shí)施方式中使用的PCR反應(yīng)的更多細(xì)節(jié)可在美國專利申請第11/376,018中找到。關(guān)于對來自全血細(xì)胞的mRNA定量的更多細(xì)節(jié)可在2004年3月9日申請的美國申請編號10/796，298中找到，目前其以美國專利第7，745，180被公布，且其以引用的方式整體并入本文中。
[0066]完成PCR反應(yīng)后，對一個(gè)或多個(gè)基因(例如疾病標(biāo)記物)的mRNA(以檢測得到的PCR擴(kuò)增的cDNA量表示)進(jìn)行定量。在某些實(shí)施方式中，通過將編碼一個(gè)或多個(gè)標(biāo)記物的mRNA的量與參考值比較來計(jì)算定量。在其他的實(shí)施方式中，參考值是不被刺激劑誘導(dǎo)的基因，例如持家基因的表達(dá)水平。也可使用本領(lǐng)域周知的持家基因作為參考值。在其他的實(shí)施方式中，持家基因用作校正因子，例如最終的比較是一個(gè)或多個(gè)標(biāo)記物的誘導(dǎo)表達(dá)水平與來自非誘導(dǎo)(對照)樣品的相同標(biāo)記物比較。在另外的其他實(shí)施方式中，參考值為零，從而一個(gè)或多個(gè)標(biāo)記物的定量由絕對數(shù)值表示。在一些實(shí)施方式中，計(jì)算一個(gè)或多個(gè)攻擊性免疫標(biāo)記物的表達(dá)與一個(gè)或多個(gè)防御性免疫標(biāo)記物的表達(dá)相比較的比值。在另外的其他實(shí)施方式中，不進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。
[0067]在某些實(shí)施方式中，提供一種試劑盒，其包括本文中公開的任何設(shè)備的組合。在某些實(shí)施方式中，試劑盒包括含有肝素的血液收集真空管，含有肝素和刺激劑的血液收集真空管，能夠?qū)⒀菏占婵展茉谏頊囟认戮S持至少30分鐘的加熱板(或其他加熱源)。在某些實(shí)施方式中，試劑盒包括能夠存儲(chǔ)和配送一個(gè)或多個(gè)血液收集真空管的存儲(chǔ)容器。在某些實(shí)施方式中，試劑盒包括包含白細(xì)胞膜和吸濕材料的蓋。
[0068]實(shí)施例
[0069]參照下列實(shí)施例描述具體的實(shí)施方式，下列實(shí)施例應(yīng)僅認(rèn)為是示例性的而不是限制性的。
[0070]實(shí)施例1-體外血液刺激
[0071]圖1-5表示根據(jù)某些實(shí)施方式用于收集血液、處理樣品以及在處理的血液樣品上進(jìn)行mRNA分析的方法和設(shè)備。如圖1所示，在填充全血細(xì)胞之前管A和B都含有肝素。在其他的實(shí)施方式中，肝素(或其他抗凝血?jiǎng)?可手動(dòng)加入到管中。管A用作對照，因?yàn)槠洳缓腥魏未碳?。管B含有干燥的刺激劑。如上所述，在某些實(shí)施方式中，手動(dòng)加入刺激劑，包括其他的刺激劑。將血液收集到樣品管中，然后振動(dòng)或搖動(dòng)管以確保肝素和/或刺激劑與收集的血液混合。
[0072]然后，如圖2所示，使用一次性孵育器孵育圖1的血液樣品。在一些實(shí)施方式中，在生理?xiàng)l件下進(jìn)行孵育。在某些實(shí)施方式中，使用約37°C的溫度。一次性孵育器具有能夠加熱樣品2-4小時(shí)的加熱板。在其他的實(shí)施方式中，可根據(jù)需要增加或降低孵育的時(shí)間和
/或溫度。
[0073]接下來，如圖3所示，將刺激的血液樣品從孵育器移除。將管的蓋移除并用具有白細(xì)胞膜和吸收材料的蓋替代。當(dāng)蓋與管卡合時(shí)，白細(xì)胞膜更接近管中的血液。接下來，在孵育之后，將管倒轉(zhuǎn)過來從而使得血液與白細(xì)胞膜接觸。在重力(或其他的力，取決于不同的實(shí)施方式，例如真空壓)的輔助下過濾血液樣品。白細(xì)胞被捕獲到膜上，且吸濕材料捕獲穿過白細(xì)胞膜的材料(例如血漿、紅血細(xì)胞等)。接下來，將兩個(gè)樣品管放回所需條件(例如用于存儲(chǔ)的-80度)下的孵育器中。如圖4所示，接著使用孵育器存儲(chǔ)或配送樣品。
[0074]如圖5所示，樣品管經(jīng)過更多步驟以準(zhǔn)備mRNA分析。將具有白細(xì)胞濾膜和吸濕材料的蓋從管移除。然后將吸濕材料從蓋上的蓋板移除。然后將含有濾得的白細(xì)胞的白細(xì)胞過濾器與干凈的樣品管卡合。接下來，穿過蓋中的蓋板添加裂解緩沖液以處理白細(xì)胞。然后將管旋轉(zhuǎn)或離心以收集管底部的裂解產(chǎn)物并轉(zhuǎn)移至GENEPLATE (基因板)或其他收集器皿。然后,可通過PCR或其他本領(lǐng)域已知方法確定裂解產(chǎn)物中靶RNA的量。
[0075]實(shí)施例2-血液收集管的制造和試驗(yàn)
[0076]通常，血液收集管由玻璃制成，由于生產(chǎn)中的缺陷、暴露于不穩(wěn)定的溫度或處理不當(dāng)，血液收集管可能會(huì)破裂。假設(shè)血液樣品常被收集用于評價(jià)患者的健康狀況，則血液樣品可能含有對收集和/或分析血液樣品的個(gè)人造成危險(xiǎn)的病原體、化學(xué)物質(zhì)或其他物質(zhì)。從而，在一些實(shí)施方式中，提供了一種非玻璃血液收集管，其降低了管體破裂和有關(guān)人員意外地暴露于患者血液樣品中的風(fēng)險(xiǎn)。非玻璃血液收集管，例如本文中公開的非玻璃血液收集管與傳統(tǒng)玻璃管相比是有利的，因?yàn)槟軌驅(qū)⑹占难簶悠防鋬龃鎯?chǔ)于-70°C以下(例如在刺激的方案以后)，且在最終分析之前的解凍過程中破裂的風(fēng)險(xiǎn)降低。在一些實(shí)施方式中，非玻璃管包括聚丙烯。在其他的實(shí)施方式中，使用聚苯乙烯管。在另外的其他實(shí)施方式中，可以使用對于承受管內(nèi)的負(fù)壓的產(chǎn)生(和保持)和一個(gè)或多個(gè)冷凍-解凍循環(huán)足夠的耐用的其他聚合物或塑料管。
[0077]許多抽血管通過使得血液從患者(或分離的血液收集設(shè)備)流入收集管中負(fù)的內(nèi)部壓力(相對于外部環(huán)境而言)來操作。這不僅使得以較低的患者不適感進(jìn)行抽血，還避免血液回流入患者的靜脈系統(tǒng)。
[0078]為了確定制造具有負(fù)的內(nèi)部壓力的非玻璃(例如塑料)管的可重復(fù)性，手動(dòng)制作具有自密封的可穿刺的蓋的塑料管以使其具有負(fù)的內(nèi)部壓力。在4個(gè)實(shí)驗(yàn)的每個(gè)實(shí)驗(yàn)中制造3個(gè)管(總計(jì)12個(gè)管)。使用一端浸入水中的劑量注射針21穿刺所述蓋，從而允許負(fù)壓力將水抽入管中。然后稱量每組管的重量。如圖7所示，不同實(shí)驗(yàn)中管的均重沒有顯著差異，從而說明制造這樣的收集管是可重復(fù)的。
[0079]管除了在樣品收集中具有可重復(fù)性之外，重要的是還相對于維持管內(nèi)的負(fù)壓力具有足夠的使用期限以及管本身的耐用性。同樣，如上所述的制備其他的管。然后將它們在室溫下存儲(chǔ)0至14天。如上所述，使用劑量注射針21收集水，并對管進(jìn)行稱重。圖8描述了重量，其顯示出將管存儲(chǔ)14天與存儲(chǔ)2天相比或與制造后立即使用相比，管內(nèi)的負(fù)壓力沒有差別。
[0080]實(shí)施例3-制造的血液收集管與多孔板的比較
[0081]確認(rèn)制造非玻璃血液收集管的可重復(fù)性以后，進(jìn)行以下實(shí)驗(yàn)來評定這樣的收集管是否與更傳統(tǒng)的體外血液刺激方法(例如，將小體積血液置于孔中并單獨(dú)添加刺激劑)具有一樣好的性能。
[0082]如上所述制造血液收集管。將三個(gè)管在4°C (圖9中的管PHA 4C#1,#2,#3)或室溫(圖9中的PHA RT)下存儲(chǔ)20天。然后將血液抽至6個(gè)管中:對照肝素管，空白肝素管，4個(gè)含PHA的管。將來自對照肝素管的血液在微孔板管胚(每個(gè)3孔，60yL血液/孔)中進(jìn)行刺激(使用PBS或PHA)。將其余5個(gè)管在37°C下孵育4小時(shí)。如前面所述的那樣使用SYBR綠色實(shí)時(shí)PCR對各種mRNA進(jìn)行定量(Mitsuhashi M et al.Clin.Chem.52:634-642, 2006) ?
[0083]簡單的說，將白細(xì)胞去除膜(Leukosorb ;Pall)安裝到96孔濾板上并置于固定有寡聚(dT)的收集板上方。使用150yL的5mmol/L Tris(pH 7.4)潤濕濾膜。在120g4°C下離心1分鐘以從膜去除Tris溶液，然后向每個(gè)孔加入50 μ L刺激后的全血樣品，并立即在120g 4°C下離心2分鐘。然后用300 μ L的磷酸鹽緩沖鹽溶液洗滌各孔一次。在2000g 4°C下離心5分鐘以去除鹽溶液后，向?yàn)V板的各孔添加60 μ L儲(chǔ)備裂解緩沖液(5g/LN-十二烷基肌氨酸，4X 標(biāo)準(zhǔn)檸檬酸鹽，10mmol/L Tris_HCl(pH 7.4), lmmol/L EDTA, 1ml/L IGEPAL CA-630 (NP-40 的替代物)，1.79mol/L 硫氰酸胍(均來自 Sigma))，并補(bǔ)充 10mL/L2-疏基乙醇(B1-Rad),0.5g/L 蛋白酶 K(Pierece) ,0.lg/L 娃魚精 DNA (5Prime Eppendorf/Brinkman), 0.lg/L 大腸桿菌(Escherichia col i) tRNA (Sigma),特異反向引物每個(gè) 5nmol/L以及1010分子/L的合成RNA34(作為外部對照)。然后將板在37°C孵育10分鐘，置于固定寡聚(dT)的收集微板(GenePlate ;RNAture)上方，并在2000g 4°C離心5分鐘。在4°C過夜存儲(chǔ)后，使用100 μ L普通裂解緩沖液洗滌微板3次，然后使用150 μ L 4°C的洗滌緩沖液(0.5mol/L NaCl, 10mmol/L Tris(pH 7.4)，lmmol/L EDTA)洗滌 3 次。
[0084]通過添加30yL含IX反轉(zhuǎn)錄緩沖液的緩沖液(50mM KCl,10mM Tris_HCl(pH8.3)，5.5mM MgC12，InL/ μ L吐溫20)、脫氧核苷三磷酸各1.25mM、4個(gè)單位的rRNasin以及80U MMLV反轉(zhuǎn)錄酶(Promega;不含引物)，并在37°C孵育2小時(shí)，從而在每個(gè)孔中直接合成cDNA。從每30 μ L反應(yīng)物中，將4 μ LcDNA直接轉(zhuǎn)移至384孔PCR板，并添加5 μ L TaqMan通用型主混合物(Applied B1systems)和每個(gè)mRNA或β _肌動(dòng)蛋白的5 μ Μ正向和反向引物各 lyL.。在 PRISM 7900HT (Applied B1systems)中進(jìn)行 PCR，95°C 10 分鐘進(jìn)行 1 個(gè)循環(huán)，接著95°C 30秒、55°C 30秒和60°C 1分鐘進(jìn)行45個(gè)循環(huán)。每個(gè)基因在單獨(dú)的孔中擴(kuò)增。利用分析軟件(SDS ；Applied B1systems)確定循環(huán)閾值(Ct)即產(chǎn)生一定量PCR產(chǎn)物(基于熒光)的循環(huán)。通過用每個(gè)PBS處理對照樣品的Ct減去每個(gè)PHA處理樣品的Ct來確定Λ Ct，并以2~_ ACt計(jì)算倍增量。
[0085]如圖9A-9D所示，血液收集管顯示出對于對照反應(yīng)的比較結(jié)果(例如比較PBS板與普通真空管(Plain Vacuum Tube))。并且，沒有檢測到含PHA的管在室溫下存儲(chǔ)與在4°C存儲(chǔ)之間存在差異。最后，對于所有被測基因(β_肌動(dòng)蛋白、Υ干擾素、白介素2和GM-CSF)，沒有檢測到在多孔板形式中進(jìn)行的和在含ΡΗΑ的血液收集管中進(jìn)行的ΡΗΑ刺激之間存在差異。這些結(jié)果表明在血液收集管中刺激血液與在多孔板形式中進(jìn)行刺激具有同等的可靠性和可重復(fù)性。
[0086]進(jìn)行其他實(shí)驗(yàn)來確定收集血液樣品和刺激樣品之間的延遲作用。將血液抽取至4個(gè)含肝素的如上所述制造的真空管中(3個(gè)普通管，1個(gè)含有干擾素a2b, IFNa2b的管)。抽血后立即將一個(gè)普通管和IFNa2b管置于37°C孵育器中2小時(shí)。立即將其他普通管等分至多孔板管中，并用PBS或IFNa2b (每個(gè)3孔，60 μ L血液/孔)在37°C刺激2小時(shí)。孵育后，將各管在_80°C下存儲(chǔ)。將最后的普通管在4°C下存儲(chǔ)6小時(shí)，然后等分至多孔板以使用IFNa2b刺激。如圖10A至10C所示，IFNa2b管(空心三角)的特性與在板孔中的傳統(tǒng)IFNa2b刺激(空心圓圈)相同。相比之下，對于GIP2和CXCL10 (實(shí)心方塊)，起初在體外刺激之前在4°C存儲(chǔ)6小時(shí)的血液表現(xiàn)出比IFNa2b少的誘導(dǎo)。實(shí)際上，在孵育期間可能有mRNA的降解，因?yàn)棣?-肌動(dòng)蛋白的水平下降(圖10Α)。
[0087]實(shí)施例4-刺激后血液樣品的穩(wěn)定性
[0088]為了評估刺激后血液樣品的穩(wěn)定性，在板條孔中使用DNR(終濃度10 μ M)、AraC(終濃度100 μ Μ)或PBS在37°C下刺激血液4小時(shí)，然后在4°C下存儲(chǔ)0_3天。在4°C孵育后，將樣品在_80°C冰箱中存儲(chǔ)直至分析。這些實(shí)驗(yàn)條件設(shè)計(jì)為代表樣品在本文所述便攜孵育設(shè)備在運(yùn)輸期間會(huì)暴露的可能條件。如上所述對3個(gè)mRNA (ACTB，p21和PUMA)進(jìn)行定量。
[0089]如圖11A-11B所示，β -肌動(dòng)蛋白不被任一種試劑(空心符號為PBS對照，實(shí)心符號為DNR或ArcC刺激)誘導(dǎo)，并且β -肌動(dòng)蛋白mRNA的水平在3天中相對穩(wěn)定。圖11A示出DNR引起p21的顯著誘導(dǎo)(空心和實(shí)心三角之間的箭頭)。AraC刺激也得到類似的結(jié)果(圖11B)。類似地，兩種試劑都誘導(dǎo)PUMA表達(dá)。刺激后存儲(chǔ)1天以后，p21和PUMA的表達(dá)水平與0天時(shí)類似。然而，刺激后存儲(chǔ)3天后，對于兩種刺激劑，p21和PUMA的水平都表現(xiàn)出降低(更高的Ct值)。刺激后1天還具有明顯的增加。同樣地，這些結(jié)果表明在某些實(shí)施方式中，刺激后存儲(chǔ)2天是可能的。然而在一些實(shí)施方式中，刺激后的血液可在4°C存儲(chǔ)1天。
[0090]還對兩種不同的孵育溫度評估了誘導(dǎo)的時(shí)間過程。這是為了評估樣品可暴露于孵育溫度且仍提供可靠且穩(wěn)定的基因表達(dá)數(shù)據(jù)的時(shí)間。用PHA、IFNa2b或PBS(重復(fù)三次)在板孔中在37°C或42°C下刺激血液0-9小時(shí)，然后在_80°C下冷凍存儲(chǔ)。這些溫度代表本文中公開的便攜孵育和存儲(chǔ)設(shè)備的用于某些實(shí)施方式的小型便攜加熱器的可操作范圍。對ACTB, IL2 和 CXCL9mRNA 進(jìn)行定量。
[0091]如圖12A和12D所示，無論什么刺激劑在40°C或37°C下孵育血液樣品不會(huì)改變?chǔ)?-肌動(dòng)蛋白的表達(dá)。圖12Β和12Ε表明通過與ΡΗΑ孵育來誘導(dǎo)IL_2mRNA無論在42°C下或37°C下進(jìn)行都是類似的。另外，當(dāng)在1小時(shí)至9小時(shí)之間的任一點(diǎn)進(jìn)行刺激時(shí)，表達(dá)水平都是類似的。類似地，圖12C和12F中，無論孵育溫度和孵育時(shí)間CXCL-9被干擾素誘導(dǎo)至類似的程度。因此，在一些實(shí)施方式中，根據(jù)所使用的刺激條件，存在較大的靈活性。這允許從更多位置配送樣品，因?yàn)楦蟮木嚯x會(huì)落在9小時(shí)孵育時(shí)間和1小時(shí)孵育的范圍內(nèi)。并且，在一些實(shí)施方式中，這種靈活性在選擇加熱元件中是有利的，因?yàn)槿舴跤龝r(shí)間范圍更寬，則所使用的加熱設(shè)備類型的選擇范圍更大。
[0092]圖13A和圖13B描述了由PHA或IFN α刺激然后在本文所公開的便攜設(shè)備或可控孵育器中(在各種溫度下)孵育時(shí)IL2或CXCL9的誘導(dǎo)水平的比較。如圖所示，使用便攜設(shè)備進(jìn)行孵育與可控孵育器相比，IL2和CXCL9誘導(dǎo)沒有顯著差異。這再次表明了可用于進(jìn)行體外刺激血液樣品的溫度和時(shí)間(如上所述)的靈活性水平。
[0093]圖14描述了由6個(gè)溫度記錄器記錄的溫度曲線，每個(gè)溫度記錄器加載在6個(gè)血液收集管之一中并置于與電池供電的加熱源相連的銅箱中。銅箱與兩個(gè)藍(lán)冰冰袋一起置于如上所述的便攜設(shè)備中。這些數(shù)據(jù)表明，即使存在藍(lán)冰，銅箱內(nèi)的溫度也能由于加熱源的存在而維持在40°C兩個(gè)小時(shí)。一旦加熱源關(guān)閉，溫度降至2°C并維持直至16小時(shí)。不同管之間沒有可識別的差異，這表明將樣品管置于銅箱中不會(huì)影響孵育溫度。
[0094]本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，在不背離本發(fā)明范圍的前提下可對上述設(shè)備和方法進(jìn)行各種省略、增加和變更，所有這些變更和改變都落在由隨附的權(quán)利要求限定的本發(fā)明的范圍內(nèi)。
【權(quán)利要求】
1.一種利用負(fù)壓力收集血液的非玻璃血液收集管，包括: 非玻璃管； 一種或多種抗凝血?jiǎng)? 一種或多種白細(xì)胞刺激劑； 由負(fù)壓力活化的可視標(biāo)記物；以及 密封所述收集管的可穿刺的自密封蓋； 其中收集管內(nèi)的壓力與收集管外的壓力相比為負(fù)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的非玻璃血液收集管，其中所述一種或多種白細(xì)胞刺激劑選自由下列所組成的組:化學(xué)治療藥物、免疫調(diào)節(jié)劑、疫苗、佐劑、重組蛋白、單克隆抗體、凝血素、致病因子衍生物、過敏原以及它們的組合。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的非玻璃血液收集管，其中所述一種或多種抗凝血?jiǎng)┌ǜ嗡亍?br> 4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的非玻璃血液收集管，其中所述管適于在約25°C至約40°C之間的溫度孵育至少約I小時(shí)。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的非玻璃血液收集管，其中所述管適于在低至足以冷凍血液樣品的溫度下存儲(chǔ)，并且其中所述收集管在所述溫度下在結(jié)構(gòu)上穩(wěn)定。
6.一種用于從患者獲得血液樣品的方法，包括: 檢查權(quán)利要求1所述的血液收集管是否存在負(fù)壓力活化的可視標(biāo)記物； 若存在活化的標(biāo)記物，則穿刺所述患者的靜脈系統(tǒng)的靜脈； 穿刺自密封蓋；并且 使血液填充收集管直至負(fù)壓力被補(bǔ)償或直至收集到所需的體積。
【文檔編號】A01N1/02GK104306005SQ201410589949
【公開日】2015年1月28日 申請日期:2011年10月31日 優(yōu)先權(quán)日:2010年11月4日
【發(fā)明者】三橋?qū)⑷? 村上卓 申請人:日立化成株式會(huì)社, 日立化成研究中心公司