一種過表達(dá)gma-miR156b培育高產(chǎn)株型植物的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種利用gma-miR156b及其前體基因培育高產(chǎn)植物的方法，首先構(gòu)建含有SEQ ID NO：2所示microRNA前體序列的重組表達(dá)載體，然后利用此重組表達(dá)載體構(gòu)建轉(zhuǎn)化體，再利用此轉(zhuǎn)化體侵染目的植物，篩選得到與正常植物相比具有多分枝、多莢、多籽粒的高產(chǎn)轉(zhuǎn)基因植物。通過在大豆植株中過表達(dá)上述microRNA，可以顯著增加大豆的分枝數(shù)，由平均的2個(gè)分枝增加到8個(gè)分枝，轉(zhuǎn)基因大豆的單株莢數(shù)也增加了59％，單株莢粒數(shù)也增加了2-3倍。通過在小麥植株中過表達(dá)上述microRNA，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因小麥的分蘗數(shù)由平均的3.3個(gè)分蘗增加到4.4個(gè)，小麥穗長(zhǎng)、穗粒數(shù)、單穗平均粒重均顯著增加。
【專利說明】-種過表達(dá)gma-miR156b培育高產(chǎn)株型植物的方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種植物中與株型和產(chǎn)量相關(guān)的microRNA，特別涉及來源于大豆的與 株型發(fā)育相關(guān)的gma-miR156b及其在培育高產(chǎn)大豆及小麥新品種方面的應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002] 大豆和小麥?zhǔn)欠浅Ｖ匾?、具有特殊?jīng)濟(jì)價(jià)值的作物。株型是大豆和小麥植株整 體特征的集中表現(xiàn)，在大豆和小麥高產(chǎn)育種中發(fā)揮著非常重要的作用。大豆和小麥株型包 括株高、節(jié)數(shù)、莖粗的動(dòng)態(tài)變化、分枝/分蘗數(shù)、分枝長(zhǎng)度和角度等植株形態(tài)特征。在生產(chǎn) 中大豆和小麥的抗倒伏能力是其廣適性栽培及其在不同環(huán)境條件下高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)的重要條件 (Mancuso and Caviness, 1991)。具有理想株型的大豆和小麥品種具有更好的抗倒伏能力。
[0003] miRNA是近年來在生物體中發(fā)現(xiàn)的一類長(zhǎng)度約為20-24nt非編碼的小分子RNA，通 過序列互補(bǔ)與特定靶基因的mRNA結(jié)合，因引起mRNA降解或抑制mRNA翻譯而調(diào)控一些重要 生理過程，被認(rèn)為是植物重要性狀分子調(diào)控的關(guān)鍵或主控調(diào)節(jié)元件（Master regulators), 已經(jīng)成為世界生物科學(xué)研究的熱點(diǎn)和前沿。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種利用gma-miR156b及其前體基因培育多分 枝、多莢、多籽粒高產(chǎn)植物的方法。
[0005] 為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明所采取的技術(shù)方案如下。
[0006] 序列表中SEQ ID N0 :1所示gma-miR156b的在培育多分枝和/或多莢和/或多籽 粒株型植物中的應(yīng)用。
[0007] 作為本發(fā)明的一種優(yōu)選技術(shù)方案，在植物中過表達(dá)SEQ ID N0 :1所示的 gma-miR156b，培育出具有多分枝和/或多莢和/或多籽粒株型的轉(zhuǎn)基因植物。
[0008] 作為本發(fā)明的一種優(yōu)選技術(shù)方案，首先構(gòu)建含有g(shù)ma_miR156b前體序列的重組表 達(dá)載體，然后利用此重組表達(dá)載體構(gòu)建轉(zhuǎn)化體，再利用此轉(zhuǎn)化體侵染目的植物，篩選得到與 正常植物相比具有多分枝、多莢、多籽粒的高產(chǎn)轉(zhuǎn)基因植物；所述gma-miR156b前體序列如 SEQ ID N0 :2 所示。
[0009] 作為本發(fā)明的一種優(yōu)選技術(shù)方案，構(gòu)建含有SEQ ID N0 :2所不多核苷酸序列的重 組表達(dá)載體的步驟為：
[0010] 1)、首先以植物葉片DNA為模板，擴(kuò)增獲得SEQ ID N0 :2所示多核苷酸序列并連接 至T載體上，然后用限制性內(nèi)切酶Age I和BamH I酶切所得T載體質(zhì)粒，回收酶切產(chǎn)物；
[0011] 2)、然后用限制性內(nèi)切酶Age I和BamH I酶切空載體pEGAD，回收載體骨架；
[0012] 3)、最后用T4連接酶將步驟1)的酶切產(chǎn)物和步驟2)的載體骨架連接；
[0013] 4)、將步驟3)的連接產(chǎn)物熱激轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)DH5 α菌株，37 °C過夜培養(yǎng)，挑 取陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證，得重組表達(dá)載體PEGAD-35S: :gma-miR156b。
[0014] 作為本發(fā)明的一種優(yōu)選技術(shù)方案，采用液氮凍溶法轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌EHA105得轉(zhuǎn)化體， 具體操作步驟包括：
[0015] a.取出凍存的200 μ 1感受態(tài)農(nóng)桿菌細(xì)胞，融化后加入5-10 μ 1重組表達(dá)載體的質(zhì) 粒DNA，輕彈管壁混勻，冰上放20-30min ;
[0016] b.放入液氮中5min后取出，將管轉(zhuǎn)入37°C、5min融化后，加入800μ 1YEP液體培 養(yǎng)基，28°C低速振蕩、150rpm，4-5h ;
[0017] d. 10000rpm，30sec，去上清，加100μ 1YEP液體培養(yǎng)基，懸浮菌體后涂板；
[0018] e.置于28°C培養(yǎng)至白色轉(zhuǎn)化子長(zhǎng)出，挑取陽(yáng)性單克隆搖菌，用于植株子葉節(jié)轉(zhuǎn) 化。
[0019] 作為本發(fā)明的一種優(yōu)選技術(shù)方案，所述目的植物為大豆或小麥。
[0020] 本發(fā)明還包括gma-miR156b的前體序列,其具有SEQ ID N0 :2所示的核苷酸序列， 在植物細(xì)胞內(nèi)被剪切并表達(dá)得到對(duì)應(yīng)的microRNA。
[0021] 本發(fā)明還包括含有g(shù)ma_miR156b前體序列的重組表達(dá)載體。
[0022] 本發(fā)明還包括含有g(shù)ma_miR156b前體序列的轉(zhuǎn)化體。
[0023] 本發(fā)明還包括擴(kuò)增gma_miR156b前體序列的引物對(duì)，其核苷酸序列如SEQ ID N0 : 3 和 SEQ ID NO :4 所示。
[0024] 采用上述技術(shù)方案所產(chǎn)生的有益效果在于： 申請(qǐng)人:的系列實(shí)驗(yàn)證明，通過在大豆 植株中過表達(dá)gma-miR156b，可以顯著增加大豆的分枝數(shù)，由平均的2個(gè)分枝增加到8個(gè)分 枝；此外，轉(zhuǎn)基因植株的單株莢數(shù)也增加了 59%，更重要的是，單株莢粒數(shù)也增加了 2-3倍； 最終大幅度的提1? 了大?的廣量。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0025] 圖1為實(shí)施例1的試驗(yàn)結(jié)果，顯示gma_miR156b在大豆不同組織中的表達(dá)模式，可 見其在大豆葉片中的表達(dá)水平較高。
[0026] 圖2為gma-miR156b過表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株的分子鑒定（實(shí)施例2步驟5)，對(duì)PCR鑒 定純合的株系（圖2A)進(jìn)行了草丁膦涂抹（圖2B)及Bar試紙條（圖2C)的分析；從圖中 可見，PCR陽(yáng)性的轉(zhuǎn)基因植株也呈現(xiàn)了對(duì)草丁膦的抗性，說明Bar基因正常表達(dá)，其蛋白具 有膦化麥黃酮乙酰轉(zhuǎn)移酶的活性。
[0027] 圖3為gma_miR156b在轉(zhuǎn)基因大豆植株當(dāng)中的分子鑒定及過表達(dá)植株的農(nóng)藝性 狀分析（實(shí)施例2步驟6);結(jié)果顯示，在純合轉(zhuǎn)基因株系中目的基因 gma-miR156b的表 達(dá)水平和野生型中的表達(dá)相比有明顯提高（圖3A);過表達(dá)gma-miR156b的轉(zhuǎn)基因植株同 對(duì)照野生型W82相比，株高沒有顯著變化（圖3C)，但株型發(fā)生顯著變化（圖3B);過表達(dá) gma-miR156b可以顯著增加大豆的分枝數(shù)，由平均的2個(gè)分枝增加到8個(gè)分枝（圖3D);此 夕卜，過表達(dá)gma-miR156b轉(zhuǎn)基因植株的單株莢數(shù)也增加了 59% (圖3E);更重要的是，單株 莢粒數(shù)也增加了 2-3倍（圖3F)。
[0028] 圖4為實(shí)施例3步驟5-1中Bar基因的檢測(cè)結(jié)果，通過PCR方法鑒定出156b-2_3 和156b-5-8兩個(gè)獨(dú)立來源的陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因小麥株系。
[0029] 圖5為gma_miR156b在轉(zhuǎn)基因小麥植株當(dāng)中的分子鑒定及過表達(dá)植株的農(nóng)藝性狀 分析；圖5-A、B顯示實(shí)施例3步驟5-2中轉(zhuǎn)基因小麥植株同對(duì)照野生型科農(nóng)199相比，穗 長(zhǎng)顯著升高；圖5-C顯示轉(zhuǎn)基因小麥植株同對(duì)照野生型相比，分蘗數(shù)由平均的3. 3個(gè)增加到 4. 4個(gè)；圖5-D顯示轉(zhuǎn)基因小麥植株同對(duì)照野生型相比，穗粒數(shù)顯著增加；圖5-E顯示轉(zhuǎn)基 因小麥植株同對(duì)照野生型相比，單穗平均粒重顯著增加。

【具體實(shí)施方式】
[0030] 以下的實(shí)施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn) 方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的試驗(yàn)材料，如無特殊說明，均為自 常規(guī)生化試劑公司購(gòu)買得到的。下述實(shí)施例中的％，如無特殊說明，均為質(zhì)量百分含量。以 下實(shí)施例中的定量試驗(yàn)，均設(shè)置三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果取平均值。
[0031] 實(shí)施例lgma_miR156b在大豆中的的表達(dá)模式分析
[0032] 通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)分析gma_miR156b在大豆葉、莖、根及根瘤中的表達(dá)特 性，同時(shí)檢測(cè)gma-miR156b在轉(zhuǎn)基因植株中的表達(dá)特性。
[0033] (1)材料獲取：實(shí)驗(yàn)所用材料為Wilimas82(威廉姆斯82,下文簡(jiǎn)稱W82)，材料按 照以下流程進(jìn)行處理：大豆種子用70 %的酒精滅菌30S，播種于低氮營(yíng)養(yǎng)液浸泡的蛭石珍 珠巖（3:1)混合基質(zhì)中，于培養(yǎng)室中培養(yǎng)，16h光/8h暗，光強(qiáng)7000LUX,溫度26°C，相對(duì)濕 度為70 %。播種后7天，每株接種慢生型根瘤菌USDA110菌液（0D_ :0.08) 30ml，在接菌后 28天時(shí)取大豆葉、莖、根及根瘤；
[0034] (2)大豆不同組織中RNA的分離：取上步所得的大豆不同組織，提取RNA，具體提取 方法如下：
[0035] ①用液氮在研缽中將材料充分研磨，將50mg-100mg研磨好的粉末放入1. 5ml離心 管中，加入lmL Redzol試劑（Vigorous公司），冰上放置lOmin ;
[0036] ②加入200 μ 1氯仿，200 μ 1 RNA-free NaAC，振蕩均勻后室溫靜置2-3min ;
[0037] ③ 4。(：，12, 000g 離心 lOmin ;
[0038] ④將上清移入另外一個(gè)離心管中，加入等體積的異丙醇，振蕩混勻，-20°C沉淀 30min ；
[0039] ⑤ 4。(：，12, 000g 離心 lOmin ;
[0040] ⑥棄上清，用75%的乙醇（DEPC處理過的無菌水配制）洗1-2次；
[0041] ⑦小心去上清（盡力吸干），室溫靜置使RNA干燥；
[0042] ⑧加適量DEPC處理水溶解RNA ;
[0043] ⑨電泳檢測(cè)RNA完整性。
[0044] (3)反轉(zhuǎn)錄 PCR :使用 TIANGEN 公司出品的 FastQuant RT Kit (With gDNase)試 劑盒（目錄號(hào)：KR106)對(duì)上步所得大豆組織的RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄克?。?br> [0045] ①首先將總RNA末端進(jìn)行g(shù)DNA去除處理，在10 μ 1體系中加入總RNA 5yl5XgDNA Buffer 2yl，RNase-Free ddH20 3 μ1，徹底混勻上述配制的反應(yīng)液，短暫離 心后，42°C反應(yīng)3min，放置于冰上；
[0046] ②然后配置反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系：10XFast RT Buffer 2 μ 1，RT Enzyme Mix lul,miR156b RT Primer(SEQ ID NO ：5) 1 μ 1, miR1515a RT Primer 1 μ 1, RNase-Free ddH205 μ 1 ；
[0047] ③將反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)中的mix加到gDNA去除步驟（步驟①）的反應(yīng)液中，充分混勻； 42°C，孵育15min ;95°C，孵育3min之后放于冰上，得到的cDNA可以直接進(jìn)行下游熒光定量 檢測(cè)，或-20°C低溫保存。
[0048] (4)實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析：使用TaKaRa公司出品的SYBR Premix Ex Tag?進(jìn)行 定量PCR分析；
[0049] ①在20 μ 1體系中加入上步所得cDNA模板2 μ 1、正反向引物各0.4 μ 1、SYBR Primix Ex taq?(2X) 10 μ 1, ROX Reference Dye II (50X)0. 4 μ 1, ddH206. 8 μ 1 ；
[0050] ②擴(kuò)增程序?yàn)椋?5 °C 30s ;95 °C 5s，60 °C 34s，45cycles ;95 °C 15s，60 °C lmin， 95 °C 15s ;其中，正向引物為：GGACCTGACAGAAGAGAGAG(SEQ ID NO :6);反向引物為： GTGCAGGGTCCGAGGT(SEQ ID NO ：7)；
[0051] (5)結(jié)果：gma_miR156b在大豆不同組織中的表達(dá)模式如圖1所示，結(jié)果顯示 gma-miR156b在大豆葉片中的表達(dá)水平較高。
[0052] 實(shí)施例2、理想高產(chǎn)株型大豆的培育
[0053] 1、Wi 1 imas82 大豆 DNA 的提取
[0054] a.大豆組織于研缽中用液氮研磨，將充分研磨的粉末移至1. 5mL離心管中；加入 500μLCTAB提取液（100mM，Tris-HCl(pH8·0)，4mol/LNaCl，20mmol/LEDTA(pH8·0)，2% CTAB，使用前加入2mL/100mL β -巰基乙醇），混勻；
[0055] b. 65°C水浴30min，中間輕微振蕩幾次；
[0056] c.置于冰上 5min ;
[0057] d.加等體積的氯仿：異戊醇（24:1)，輕輕混勻；
[0058] e.室溫，靜置lOmin，12000rpm冷凍離心15min，取上清；
[0059] f.加 2倍體積冰乙醇，混勻，_20°C靜置30min ;
[0060] g.離心，排出上清液；
[0061] h. 70 %乙醇lmL漂洗2次，晾干；
[0062] I.無菌水100 μ 1溶解，_20°C冰箱長(zhǎng)期保存。
[0063] 2、構(gòu)建重組表達(dá)載體
[0064] (1) gma_miR156b 基因的克隆
[0065] gma-miR156b的前體序列共181bp(SEQ ID NO :2)，根據(jù)該序列設(shè)計(jì)引物對(duì)，根據(jù)載 體pEGAD多克隆位點(diǎn)，引物末端分別引入Age I和BamH I酶切識(shí)別位點(diǎn)，以大豆品種W82 的DNA為模板進(jìn)行PCR，擴(kuò)增gma-miR156b的前體序列；引物序列為：
[0066] gma-miR156b-F :5'-TGCACCGGTGGGTTCTATTGGTGGTTG-3'（SEQ ID NO :3)
[0067] gma-miR156b-R :5'-CGGGATCCCGTCTACTTTGGCTAGAAAG-3'（SEQ ID NO :4)
[0068] 擴(kuò)增程序?yàn)椋?5°C 5 分鐘；95°C 30 秒，57°C 30 秒，72°C 40 秒，26 個(gè)循環(huán)；72°C 30 秒；
[0069] PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1 %瓊脂糖凝膠電泳，采用上海生工膠回收試劑盒回收純化 181bp大小的條帶；
[0070] 回收的DNA片段與pMD19_T載體（Takara公司）連接，10 μ 1體系中加入T vector lyl，solution I 5μ1，回收片段4μ1，混勻混合液，16°C連接過夜，熱擊法轉(zhuǎn)入E.coli 大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，過夜培養(yǎng)，挑陽(yáng)性克隆，送交invitrogen公司測(cè)序。
[0071] (2)重組表達(dá)載體的構(gòu)建
[0072] 1)、提取含有正確測(cè)序的gma_miR156b前體基因序列的T載體質(zhì)粒，用限制性內(nèi)切 酶Age I和BamH I酶切，回收酶切產(chǎn)物；
[0073] 2)、用限制性內(nèi)切酶Age I和BamH I酶切空載體pEGAD，回收載體骨架；
[0074] 3)、用T4連接酶將步驟1的酶切產(chǎn)物和步驟2的載體骨架連接；
[0075] 4)、將步驟3的連接產(chǎn)物熱激轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)DH5 α菌株，37°C過夜培養(yǎng)，挑 取陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序；測(cè)序結(jié)果表明，得到了重組質(zhì)粒PEGAD-35S: :gma-miR156b。
[0076] 3.農(nóng)桿菌EHA105的轉(zhuǎn)化
[0077] 采用液氮凍溶法轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌，具體操作如下：
[0078] a.取出凍存的200 μ 1感受態(tài)細(xì)胞，融化后加入5-10 μ 1質(zhì)粒DNA，輕彈管壁混勻， 冰上放20-30min ;
[0079] b.放入液氮中5min后取出，將管轉(zhuǎn)入37°C (5min)融化后，加入800μ 1YEP (無抗 性）液體培養(yǎng)基，28°C低速振蕩（150rpm)4-5h;
[0080] cL 10000rpm，30sec，去上清，加 ΙΟΟμΙΥΕΡ液體培養(yǎng)基，懸浮菌體后涂板（含 50mg/ml卡那霉素）；
[0081] e.置28°C培養(yǎng)至白色轉(zhuǎn)化子長(zhǎng)出，挑取陽(yáng)性單克隆搖菌，用于大豆子葉節(jié)轉(zhuǎn)化；
[0082] 4.農(nóng)桿菌EHA105介導(dǎo)的大豆子葉節(jié)遺傳轉(zhuǎn)化
[0083] ①以大豆品種W82為材料，取種子材料用氯氣消毒10小時(shí)；
[0084] ②在B5培養(yǎng)基（培養(yǎng)基配方：2 %蔗糖，0· 8 %瓊脂粉（sigma)，1 XGAMB0RG B_5BASAL(Phyto Technology Laboratories，貨號(hào)：G398)，pH調(diào)至 5. 7 左右；）上萌發(fā) 5 天， 用手術(shù)刀先將大豆帶2cm胚軸切下，放入培養(yǎng)皿中，然后沿著子葉下軸垂直將其切開，留取 下胚軸2mm左右，除去仍然連接在子葉上的胚軸組織；在子葉和子葉下胚軸的連接處的軸 向上作5-7個(gè)切口，在活化的農(nóng)桿菌EHA105中侵染30min (0D6QQ :0. 8左右）；
[0085] ③將外植體轉(zhuǎn)至共培養(yǎng)培養(yǎng)基（培養(yǎng)基配方：2 %蔗糖，0. 8 %瓊脂粉 (sigma),1. 67mg/L 6-BA, 0. 25mg/L GA3, 0. 1XGAMB0RG B-5 BASAL(Phyto Technology Laboratories,貨號(hào)：G398, pH調(diào)至5. 4左右；）上共培生長(zhǎng)3天后，再轉(zhuǎn)至誘導(dǎo)培養(yǎng)基 上誘導(dǎo)叢生芽（培養(yǎng)基配方：2%蔗糖，0.8%瓊脂粉（以 81^)，1.671^/16-84，1〇11^/1 glufosinate，lXGAMB0RG B_5BASAL(Phyto Technology Laboratories，貨號(hào)：G398)，pH調(diào) 至5· 7左右）；
[0086] ④在誘導(dǎo)叢生芽后2周，取已生成的分生組織，在生長(zhǎng)點(diǎn)的基部作新的切口（水 平方向的），并將培養(yǎng)組織移入伸長(zhǎng)培養(yǎng)基（培養(yǎng)基配方：2%蔗糖，0. 8%瓊脂粉（sigma)， 0. lmg/L IAA, lmg/L Zeatin, 0. 5mg/L GA3, l〇mg/L glufosinate, 1 XMURA SHIGE&SK00G BASAL MEDI0M w/VITAMINS (Phyto Technology Laboratories,貨號(hào)：M404)，pH 調(diào)至 5. 7 左右）；
[0087] ⑤每?jī)芍軐⑴囵B(yǎng)物向新的培養(yǎng)基上轉(zhuǎn)移一次；每次轉(zhuǎn)移時(shí)在外植體的基部作一個(gè) 新的水平切口；
[0088] ⑥在6-8周培養(yǎng)以后，將伸長(zhǎng)的芽（一般剪取芽長(zhǎng)> 4cm)在lmg/ml IBA中蘸 根后移入生根培養(yǎng)基上生根（培養(yǎng)基配方：2%蔗糖，0.8%瓊脂粉（sigma)，0.5XMURA SHIGE&SK00G BASAL MEDI0M w/VITAMINS(Phyto Technology Laboratories，貨號(hào)：M404)， pH調(diào)至5. 7左右））；培養(yǎng)大約2-4周，長(zhǎng)出足量的根系時(shí)，進(jìn)行移栽；
[0089] ⑦將生根的小苗小心移入小花盆中，花盆里放入（進(jìn)口土：營(yíng)養(yǎng)土 = 1 :1)培養(yǎng) 土；移栽后需套保鮮袋一周，使苗習(xí)慣于土壤的新環(huán)境并保持濕度，培養(yǎng)間的溫度于26°C， 一周后取下保鮮袋；
[0090] ⑧待轉(zhuǎn)基因苗恢復(fù)生長(zhǎng)后用Bar基因檢測(cè)、草丁膦glufosinate(SIGMA，45520)涂 抹葉片以及Bar試紙條（ENVIR0L0GIX，042043)三種方法進(jìn)行轉(zhuǎn)化鑒定，收獲Bar基因陽(yáng)性 轉(zhuǎn)基因株系，在T1、T2代的陽(yáng)性植株及T3代的純合轉(zhuǎn)基因株系進(jìn)行目的基因的表達(dá)分析以 及表型的鑒定。
[0091] 5.轉(zhuǎn)基因植株的分子鑒定
[0092] 對(duì)Τ1和Τ2代陽(yáng)性的植株后代進(jìn)行了較為系統(tǒng)的選擇Bar基因表達(dá)及基因產(chǎn)物功 能的鑒定。其中包括純合株系PCR鑒定Bar基因、葉片涂抹草丁膦及Bar試紙條的分析。
[0093] 1)PCR檢測(cè)反應(yīng)法：提取大豆基因組DNA用于PCR檢測(cè)。檢測(cè)Bar基因是 否轉(zhuǎn)入大豆基因組中。Bar 基因引物：F:CTACATCGAGACAAGCACGGTCAA(SEQ ID N0:8)， R:AGAAACCCACGTCATGCCAGTTC(SEQ ID N0:9)。大豆葉片 DNA 提取方法如下：
[0094] a.大豆組織于研缽中用液氮研磨，將充分研磨的粉末移至1. 5mL離心管中；加入 650mLCTAB提取液（100mM，Tris-HCl(pH8·0)，4mol/LNaCl，20mmol/LEDTA(pH8·0)，2% CTAB，使用前加入2mL/100mL β -巰基乙醇），混勻；
[0095] b. 65°C水浴30min，中間輕微振蕩幾次；
[0096] c.置于冰上 5min ;
[0097] d.加等體積的氯仿：異戊醇（24:1)，輕輕混勻；
[0098] e.室溫，靜置lOmin，12000rpm冷凍離心15min，取上清；
[0099] f.加 2倍體積冰乙醇，混勻，-20°C靜置30min ;
[0100] g.離心，排出上清液；
[0101] h. 70%乙醇lmL漂洗2次，晾干；
[0102] 無菌水100 μ 1溶解，_20°C冰箱長(zhǎng)期保存。
[0103] 2)除草劑涂抹法：將Basta原液稀釋為濃度130mg/L，在大豆第一對(duì)三出復(fù)葉完 全展開時(shí)，以主葉脈為分界線，用記號(hào)筆標(biāo)記半片葉子，然后用棉簽蘸取草丁膦液體擦拭已 標(biāo)記的半片葉子，5天后觀察葉片對(duì)除草劑的反應(yīng)。如為陽(yáng)性植株則除草劑涂抹過的葉片 與未涂抹的葉片相比沒有太大變化，如為陰性植株則涂抹過除草劑的葉片明顯變黃甚至枯 萎。
[0104] 3) Bar試紙條快速鑒定法：取少許葉片放入1. 5mL離心管中，用研磨棒研碎葉片， 加入300μ L提取液，攪拌均勻，將試紙條按規(guī)定的方向插入混合液中，5min后觀察結(jié)果。試 紙條出現(xiàn)2條帶就表明該植株是陽(yáng)性植株，出現(xiàn)1條說明是陰性植株。
[0105] 6.結(jié)果觀察
[0106] l)Bar基因檢測(cè)結(jié)果：對(duì)T1和T2代陽(yáng)性的植株后代進(jìn)行了較為系統(tǒng)的選擇Bar 基因表達(dá)及基因產(chǎn)物功能的鑒定。其中對(duì)PCR鑒定純合的株系（圖2A)進(jìn)行了草丁膦涂抹 (圖2B)及Bar試紙條（圖2C)的分析。從圖中可見，PCR陽(yáng)性的轉(zhuǎn)基因植株也呈現(xiàn)了對(duì)草 丁膦的抗性，說明Bar基因正常表達(dá)，其蛋白具有膦化麥黃酮乙酰轉(zhuǎn)移酶的活性。
[0107] 2) gma_miR156b在轉(zhuǎn)基因植株當(dāng)中的分子鑒定及農(nóng)藝性狀分析：由于 gma-miR156b是和Bar基因共轉(zhuǎn)化的，因此，對(duì)上述Bar基因純合株系隨后進(jìn)行了 gma_miR156b的表達(dá)分析。如圖3所不，在純合轉(zhuǎn)基因株系中目的基因 gma_miR156b的表 達(dá)水平和野生型中的表達(dá)相比有明顯提高（圖3A)。并對(duì)這些轉(zhuǎn)基因植株的生長(zhǎng)習(xí)性、株 型特點(diǎn)等農(nóng)藝性狀進(jìn)行了跟蹤觀察。發(fā)現(xiàn)過表達(dá)gma-miR156b的轉(zhuǎn)基因植株同對(duì)照野生型 W82相比，株高沒有顯著變化（圖3C)但株型發(fā)生顯著變化（圖3B)。過表達(dá)gma-miR156b 可以顯著增加大豆的分枝數(shù)，由平均的2個(gè)分枝增加到8個(gè)分枝（圖3D);此外，過表達(dá) gma-miR156b轉(zhuǎn)基因植株的單株莢數(shù)也增加了 59% (圖3E);更重要的是，單株莢粒數(shù)也增 加了 2-3倍（圖3F)，從而大幅度的提高了大豆的產(chǎn)量。因此，gma-miR156b是決定大豆理 想株型和高產(chǎn)的重要的基因。
[0108] 實(shí)施例3、理想高產(chǎn)株型小麥的培育
[0109] 1、大豆DNA的提取
[0110] a.大豆組織于研缽中用液氮研磨，將充分研磨的粉末移至1. 5mL離心管中；加入 500yL CTAB 提取液（100mM，Tris-HCl(pH8.0)，4mol/L NaCl，20mmol/L EDTA(pH8.0)，3% CTAB，使用前加入2mL/100mL β -巰基乙醇），混勻；
[0111] b. 65°C水浴30min，中間輕微振蕩幾次；
[0112] c.置于冰上 5min;
[0113] d.加等體積的氯仿：異戊醇（24:1)，輕輕混勻；
[0114] e.室溫，靜置lOmin，12000rpm冷凍離心15min，取上清；
[0115] f.加2倍體積冰乙醇，混勻，-20°C靜置30min ;
[0116] g.離心，排出上清液；
[0117] h. 70 %乙醇lmL漂洗2次，晾干；
[0118] I.無菌水100 μ 1溶解，-20°C冰箱長(zhǎng)期保存。
[0119] 2、構(gòu)建重組表達(dá)載體
[0120] (1) gma_miR156b 基因的克隆
[0121] gma-miR156b的前體序列共181bp(SEQ ID N0:2)，根據(jù)該序列設(shè)計(jì)引物對(duì)，根據(jù)載 體pEGAD多克隆位點(diǎn)，引物末端分別引入Age I和BamH I酶切識(shí)別位點(diǎn)，以大豆品種W82 的DNA為模板進(jìn)行PCR，擴(kuò)增gma-miR156b前體的編碼基因；引物序列為：
[0122] gma-miR156b-F :5'-TGCACCGGTGGGTTCTATTGGTGGTTG-3'（SEQ ID NO :3)
[0123] gma-miR156b-R :5'-CGGGATCCCGTCTACTTTGGCTAGAAAG-3'（SEQ ID NO :4)
[0124] 擴(kuò)增程序?yàn)椋?5°C 5 分鐘；95°C 30 秒，57°C 30 秒，72°C 40 秒，26 個(gè)循環(huán)；72°C 30 秒；
[0125] PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1 %瓊脂糖凝膠電泳，采用上海生工膠回收試劑盒回收純化 181bp大小的條帶；
[0126] 回收的DNA片段與pMD19_T載體（Takara公司）連接，10 μ 1體系中加入T vector lyl，solution I 5μ1，回收片段4μ1，混勻混合液，16°C連接過夜，熱擊法轉(zhuǎn)入E.coli 大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，過夜培養(yǎng)，挑陽(yáng)性克隆，送交invitrogen公司測(cè)序。
[0127] (2)重組表達(dá)載體的構(gòu)建
[0128] 1)、提取含有正確測(cè)序的gma_miR156b前體基因序列的T載體質(zhì)粒，用限制性內(nèi)切 酶Age I和BamH I酶切，回收酶切產(chǎn)物；
[0129] 2)、用限制性內(nèi)切酶Age I和BamH I酶切空載體pEGAD，回收載體骨架；
[0130] 3)、用T4連接酶將步驟1的酶切產(chǎn)物和步驟2的載體骨架連接；
[0131] 4)、將步驟3的連接產(chǎn)物熱激轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)DH5a菌株，37°C過夜培養(yǎng)，挑 取陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序；測(cè)序結(jié)果表明，得到了重組質(zhì)粒PEGAD-35S: :gma-miR156b。
[0132] 3.小麥成熟胚基因槍遺傳轉(zhuǎn)化
[0133] 1)成熟胚愈傷組織的誘導(dǎo)：
[0134] 小麥品種科農(nóng)199種子用70%的酒精消毒5min,然后用0. 1 %的升萊浸泡種子 13min，無菌水沖洗5次；然后將小麥種子置于10mg/L的噻二唑苯基脲（TDZ)溶液中在25°C 室溫條件下處理15h ;剝?nèi)〕墒炫?，接種于成熟胚愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上誘導(dǎo)愈傷組織；小 麥成熟胚愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基以通用MS培養(yǎng)基（Phyto Technology Laboratories,貨號(hào)： G398)為基準(zhǔn)，添加如下物質(zhì)：2,4-二氯苯氧乙酸（2,4-D) :2. 0mg/L，鹽酸硫胺素（VB1): 8. 0mg/L，水解酪蛋白：500mg/L，L-天門冬酰胺：250mg/L，L-谷氨酰胺：200mg/L ;鹿糖： 15g/L，麥芽糖：15g/L，瓊脂：5g/L ;pH = 5. 7 ;小麥成熟胚組織誘導(dǎo)培養(yǎng)6天后陸續(xù)產(chǎn)生成 熟胚愈傷組織，挑選誘導(dǎo)兩周質(zhì)地致密的成熟胚愈傷組織轉(zhuǎn)移到高滲培養(yǎng)基中，于20°C黑 暗條件培養(yǎng)6h ;高滲培養(yǎng)基配方為上述小麥成熟胚愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基中再附加0. 2mol/ L的甘露醇和0· 2mol/L的山梨醇；
[0135] 2)基因槍轟擊轉(zhuǎn)化：
[0136] 經(jīng)高滲處理后的成熟胚愈傷組織用常規(guī)的基因槍轉(zhuǎn)化方法進(jìn)行轟擊轉(zhuǎn)化，基因 槍轟擊參數(shù)為：金粉直徑1. 〇 μ m，阻擋網(wǎng)與轟擊材料之間的距離為9. 0cm，可裂膜壓力為 llOOPa，每槍金粉 /pEGAD-35S: :gma-miR156b 用量為 0. 5μ g/30y g，每皿材料轟擊 1 次；
[0137] 3)恢復(fù)培養(yǎng)：
[0138] 基因槍轟擊后的成熟胚愈傷組織在高滲培養(yǎng)基上繼續(xù)暗培養(yǎng)18h后，將愈傷組織 從高滲培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移至恢復(fù)培養(yǎng)基中，于26°C暗培養(yǎng)兩周；小麥成熟胚愈傷組織恢復(fù)培養(yǎng)基 以通用MS培養(yǎng)基為基準(zhǔn)，添加以下物質(zhì)：2,4_二氯苯氧乙酸（2,4-D) :1.5mg/L，6-呋喃 基氨基嘌呤（KT) :0. 5mg/L，水解酪蛋白：500mg/L，L-天門冬酰胺：250mg/L，L-谷氨酰胺： 200mg/L，鹽酸硫胺素（VB1) :8. 0mg/L，蔗糖：15g/L，麥芽糖：15g/L，瓊脂：5g/L ;pH = 5. 7 ;
[0139] 4)分化培養(yǎng)：
[0140] 恢復(fù)及篩選培養(yǎng)后的成熟胚愈傷組織轉(zhuǎn)至分化培養(yǎng)基上進(jìn)行分化培養(yǎng)；培養(yǎng)溫 度為25?28°C，分化培養(yǎng)基以通用培養(yǎng)基MS為基準(zhǔn)，添加以下物質(zhì)：6_呋喃基氨基嘌呤 (KT) :2.0mg/L，α-萘乙酸（NAA) :0.01mg/L，酪蛋白：500mg/L，生物素：0.5mg/L，鹽酸硫胺 素（VB1) :8. 0mg/L，蔗糖：15g/L，麥芽糖：15g/L，瓊脂：5g/L ;pH = 5. 7 ;
[0141] 5)生根培養(yǎng)：
[0142] 待成熟胚愈傷組織分化的芽苗長(zhǎng)至2?3片葉時(shí)轉(zhuǎn)移到生根培養(yǎng)基上，于25°C、 3000Lux光照條件下進(jìn)行生根培養(yǎng)；生根培養(yǎng)基以通用培養(yǎng)基MS為基準(zhǔn)，且將MS通用培養(yǎng) 的無機(jī)鹽濃度降低一半，其中添加 ct 一奈乙酸（NAA)0. 5mg/L，鹿糖：30g/L，瓊脂：5g/L ;pH =5.7 ;待轉(zhuǎn)基因苗恢復(fù)生長(zhǎng)后用Bar基因檢測(cè)，收獲Bar基因陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因株系，在ΤΙ、T2 代的陽(yáng)性植株及Τ3代的純合轉(zhuǎn)基因株系進(jìn)行目的基因的表達(dá)分析以及表型的鑒定。
[0143] 4.轉(zhuǎn)基因植株的分子鑒定
[0144] 對(duì)Τ1和Τ2代陽(yáng)性的植株后代采用PCR方法進(jìn)行了 Bar基因的鑒定。
[0145] PCR檢測(cè)反應(yīng)法：提取小麥基因組DNA用于PCR檢測(cè)。檢測(cè)Bar基因是否 轉(zhuǎn)入小麥基因組中。Bar 基因引物：F:CTACATCGAGACAAGCACGGTCAA(SEQ ID NO :8)， R:AGAAACCCACGTCATGCCAGTTC(SEQ ID NO ：9)〇
[0146] 5.結(jié)果觀察
[0147] l)Bar基因檢測(cè)結(jié)果：對(duì)T2代陽(yáng)性的植株進(jìn)行了 Bar基因鑒定。如（圖4)顯示， 通過PCR方法鑒定出156b-2-3和156b-5-8兩個(gè)獨(dú)立來源的陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因小麥株系。
[0148] 2)gma_miR156b在轉(zhuǎn)基因小麥中的農(nóng)藝性狀分析：對(duì)這些轉(zhuǎn)基因植株的生長(zhǎng)習(xí) 性、穗型特點(diǎn)等農(nóng)藝性狀進(jìn)行了跟蹤觀察。發(fā)現(xiàn)過表達(dá)gma-miR156b的轉(zhuǎn)基因植株同對(duì)照 品種科農(nóng)199相比，穗長(zhǎng)顯著增加（圖5A, 5B)。過表達(dá)gma-miR156b可以顯著增加轉(zhuǎn)基因 小麥的分蘗數(shù)，由平均的3. 3個(gè)分蘗增加到4. 4個(gè)分蘗（圖5C);此外，過表達(dá)gma-miR156b 轉(zhuǎn)基因植株的穗粒數(shù)也顯著增加（圖;更重要的是，單穗平均粒重也顯著增加（圖5E)， 從而大幅度的提高了小麥的產(chǎn)量。因此，gma-miR156b是決定小麥分蘗和高產(chǎn)的重要的基 因。
[0149] 上述描述僅作為本發(fā)明可實(shí)施的技術(shù)方案提出，不作為對(duì)其技術(shù)方案本身的單一 限制條件，例如：含有本發(fā)明miRNA的前體序列，成熟miRNA序列的表達(dá)載體及序列本身，擴(kuò) 增所需引物，轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系及宿主菌等均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
【權(quán)利要求】
1. 序列表中SEQ ID NO :1所示microRNA的在培育多分枝和/或多莢和/或多籽粒株 型植物中的應(yīng)用。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于：在植物中過表達(dá)SEQ ID NO :1所示的 microRNA，培育出具有多分枝和/或多莢和/或多籽粒株型的轉(zhuǎn)基因植物。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于：首先構(gòu)建含有所述microRNA前體序列的 重組表達(dá)載體，然后利用此重組表達(dá)載體構(gòu)建轉(zhuǎn)化體，再利用此轉(zhuǎn)化體侵染目的植物，篩選 得到與正常植物相比具有多分枝、多莢、多籽粒的高產(chǎn)轉(zhuǎn)基因植物；所述microRNA的前體 序列如SEQ ID NO :2所示。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于：構(gòu)建含有SEQ ID NO :2所示多核苷酸序 列的重組表達(dá)載體的步驟為： 1) 、首先以植物葉片DNA為模板，擴(kuò)增獲得SEQ ID NO :2所示多核苷酸序列并連接至T 載體上，然后用限制性內(nèi)切酶Age I和BamH I酶切所得T載體質(zhì)粒，回收酶切產(chǎn)物； 2) 、然后用限制性內(nèi)切酶Age I和BamH I酶切空載體pEGAD，回收載體骨架； 3) 、最后用T4連接酶將步驟1)的酶切產(chǎn)物和步驟2)的載體骨架連接； 4) 、將步驟3)的連接產(chǎn)物熱激轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)DH5 α菌株，37 °C過夜培養(yǎng)，挑取陽(yáng) 性克隆進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證，得重組表達(dá)載體pEGAD-35S: : gma-miR156b。
5. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于：采用液氮凍溶法轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌EHA105得轉(zhuǎn) 化體，具體操作步驟包括： a. 取出凍存的200 μ 1感受態(tài)農(nóng)桿菌細(xì)胞，融化后加入5-10 μ 1重組表達(dá)載體的質(zhì)粒 DNA，輕彈管壁混勻，冰上放20-30min ; b. 放入液氮中5min后取出，將管轉(zhuǎn)入37°C、5min融化后，加入800 μ 1YEP液體培養(yǎng)基， 28°C 低速振蕩、150rpm，4-5h ; d. 10000rpm，30sec，去上清，加100μ 1YEP液體培養(yǎng)基，懸浮菌體后涂板； e. 置于28°C培養(yǎng)至白色轉(zhuǎn)化子長(zhǎng)出，挑取陽(yáng)性單克隆搖菌，用于植株子葉節(jié)轉(zhuǎn)化。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1-5任一項(xiàng)所述的應(yīng)用，其特征在于：所述目的植物為大豆或小麥。
7. 權(quán)利要求1所述microRNA的前體序列，其具有SEQ ID NO :2所示的核苷酸序列，在 植物細(xì)胞內(nèi)被剪切并表達(dá)得到對(duì)應(yīng)的microRNA。
8. 含有權(quán)利要求7所述microRNA前體序列的重組表達(dá)載體。
9. 含有權(quán)利要求7所述microRNA前體序列的轉(zhuǎn)化體
10. 擴(kuò)增權(quán)利要求7所述microRNA前體序列的引物對(duì)，其核苷酸序列如SEQ ID NO :3 和 SEQ ID NO :4 所示。
【文檔編號(hào)】A01H5/00GK104232682SQ201410478207
【公開日】2014年12月24日 申請(qǐng)日期:2014年9月18日 優(yōu)先權(quán)日:2014年9月18日
【發(fā)明者】李霞, 王幼寧, 紀(jì)洪濤, 姜瓊, 趙芳, 石磊, 杜琳倩 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所