一種水稻稻瘟病抗性基因RMg38及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于基因工程【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種水稻稻瘟病抗性基因RMg38及其應(yīng)用。本發(fā)明公開了水稻稻瘟病新抗性基因RMg38的核苷酸序列及其編碼的氨基酸多肽序列。此基因?qū)儆贜BS-LRR類型抗病基因家族的成員。本發(fā)明中的抗稻瘟病基因克隆自對稻瘟病菌表現(xiàn)出高抗的水稻品系，并將其轉(zhuǎn)化至對稻瘟病菌感病的品種中，利用稻瘟病菌侵染的方法對其抗病能力進行評估，從而最終確定該基因?qū)λ镜疚敛【哂锌剐浴?br> 【專利說明】-種水稻稻瘟病抗性基因 RMg38及其應(yīng)用
[0001]

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0002] 本發(fā)明屬于基因工程【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種水稻稻瘟病抗性基因 RMg38及其應(yīng) 用。
[0003]

【背景技術(shù)】
[0004] 植物抗病基因是植物與病原菌長期相互作用的結(jié)果，在植物的進化過程中扮演著 十分重要的角色。因此，植物抗病基因結(jié)構(gòu)的分析與研究，是了解植物抗病機理的基礎(chǔ)，對 于植物病害的預防和控制也具有重要的指導意義。自從第一個植物抗病基因 Hml在1992 年被Johal和Briggs從玉米中分離以來（Tanksley et al. 2007;董玉琢,2001)，到目 前為止，已經(jīng)有80多個植物抗病基因從不同的植物中得以克隆和分離，其中主要類型的 抗病基因為 NBS-LRR 結(jié)構(gòu)類型（Nucleotide-binding site and leucine-rich-repeat， 即核苷酸結(jié)合位點和富亮氨酸重復蛋白）的抗病基因；另外還有少部分抗病基因主要為 eLRR-TM-pkinase、eLRR-TM、STK等6種類型。這些抗病基因分別編碼對病毒、細菌、真菌、 卵菌、甚至線蟲和昆蟲等的抗性蛋白。
[0005] 植物病害每年給農(nóng)、林生產(chǎn)帶來巨大的損失，合理有效地防治植物病害是保障農(nóng)、 林可持續(xù)發(fā)展所必須解決的關(guān)鍵問題之一。大量實踐證明，開發(fā)和利用已有的植物抗病種 質(zhì)資源是防治植物病害的最為有效的方法之一（Tanksley et al. 2007;董玉琢，2001)。 傳統(tǒng)抗病品種培育的方法，通常是將優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)的品種與抗病性強的材料雜交，然后通過不 斷的回交選育，最后得到抗病且優(yōu)質(zhì)的新品種。盡管這一方法十分有效，但極其耗時，當新 品種培育出來之后，可能對病原菌新進化產(chǎn)生的株系或小種表現(xiàn)為感?。═anksley et al. 2007);經(jīng)典的圖位克隆方法利用抗病和感病的品種雜交，然后對大量的分離后代接種病 菌、鑒定抗性、遺傳作圖等，最后在精確遺傳定位的基礎(chǔ)上進行克隆。這種方法取得了很好 的效果，在植物抗病基因的克隆中起到了非常重要的作用（如抗白葉枯病基因 Xa21的分 離和利用，Song et al. 1995)，但因周期長、費時費力、分離和等位性檢測較難等原因，不 適于大量克隆抗病基因。同時，因為抗病基因獨特的遺傳方式，也使該方法的應(yīng)用受到了很 大的限制。以水稻抗稻瘟病基因為例，該類基因在基因組中通常成簇（gene cluster)分布 (Wang et al. 1999; Liu et al. 2002; Lin et al. 2007)，在不同品種的同源染色體間的 位置和結(jié)構(gòu)也多呈不對稱分布，等位關(guān)系不明確，拷貝數(shù)變異大（Yang et al. 2007; Ding et al. 2007a; Sun et al. 2008; Li et al. 2010)。這些遺傳現(xiàn)象，大大增加了圖位克 隆的難度，嚴重影響了抗病基因的克隆效率。
[0006] 近年來，隨著植物抗病及抗病相關(guān)基因分子水平研究的突破性的進展，使我們對 植物抗病及抗病相關(guān)基因的結(jié)構(gòu)、功能、起源、變異及保存的認識有了根本性的變化。植物 抗病基因，主要是一類含有LRR結(jié)構(gòu)域的基因，其中又以NBS-LRR (核酸結(jié)合-富含亮氨酸） 類型抗病基因為主。由于這些基因在結(jié)構(gòu)與功能上都具有高度的相似性，結(jié)合其獨特的遺 傳與進化特征，為快速的克隆與鑒定這些基因提供了便利，也為高效地利用抗病種質(zhì)資源 提供了新的機遇。
[0007] 水稻是世界上最重要的糧食作物之一，約有一半以上的人口 一稻米為食，同時水稻也是我國最主要的栽培作物之一，但其每年都遭受到嚴重的病蟲害 的侵擾，給農(nóng)業(yè)生產(chǎn)帶來了巨大的損失。其中，稻瘟病是分布最廣、危害水稻最嚴重的病害 之一，嚴重影響到水稻的產(chǎn)量，全球每年由稻瘟病引起的水稻產(chǎn)量損失占11-30% (約合 1. 57億美元，http://www. fungalgenomics. ncsu. edu)，直接威脅到稻農(nóng)增收和國家的糧食 安全。無論在世界還是在我國，解決稻瘟病難題一直是保障水稻持續(xù)生產(chǎn)的一個優(yōu)先研究 的課題。
[0008] 稻瘟病防治的最大困難之一是病菌本身變異與分化速度快(凌忠專等，2004)。新 的稻癌病菌生理小種層出不窮，已有的抗病基因 （Plant disease resistance, R基因）很 快喪失抗性，而尋找新的抗病材料越來越難，水稻稻癌病對水稻生產(chǎn)的威脅也越來越大。為 應(yīng)對易變的病原菌，水稻必須擁有很多抗病基因。從已經(jīng)定位的80多個基因位點來看，水 稻抗稻瘟病基因數(shù)量眾多。但是，到目前為止已經(jīng)克隆的抗稻瘟病基因僅23個。雖然已經(jīng) 定位的基因可以通過分子標記輔助選擇的方法加以利用，這一選育過程繁瑣、耗時，當新品 種培育出來之后，可能對新產(chǎn)生的變異菌株表現(xiàn)為感病，克隆并直接轉(zhuǎn)化抗病基因可能是 最直接有效的培育抗病品種的途徑。因此，使用新的思路，開發(fā)能快速克隆抗稻瘟病基因的 新方法，就顯得尤為重要。
[0009] 本發(fā)明就是利用生物信息學手段和分子技術(shù)相結(jié)合，快速高效的從水稻中分離出 多個具有稻瘟病抗性的基因。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0010] 本發(fā)明的目的是，分離克隆水稻高抗品種中攜帶的稻瘟病抗性基因 RMg38及包含 調(diào)控這個基因的啟動子的DNA片段。
[0011] 本發(fā)明的另一個目的是提供上述稻瘟病抗性基因 RMg38所編碼的蛋白質(zhì)序列。
[0012] 本發(fā)明的另一個目的是提供含有上述抗性基因的載體。
[0013] 本發(fā)明的另一個目的是提供上述載體轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)基因植株。
[0014] 本發(fā)明的另一個目的是提供上述蛋白質(zhì)在制備抗稻瘟病菌藥物中的應(yīng)用。
[0015] 本發(fā)明涉及克隆和鑒定一種包含RMg38基因的DNA片段，該基因編碼的蛋白能使 水稻對稻瘟病菌所引起的病害產(chǎn)生特異性的抗病反應(yīng)。其中，所述片段分別如序列表SEQ ID NO: 1所示或者基本上相當于SEQ ID NO: 1所示的DNA序列，或者其功能相當于SEQ ID NO: 1示序列的亞片段。這些DNA序列都編碼一種NBS-LRR類蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO: 2所示。所分離、克隆的RMg38抗性基因編碼NBS-LRR蛋白。他們的蛋白都包含兩個主 要的結(jié)構(gòu)域：NBS和LRR區(qū)域，RMg38蛋白的C-末端為9個LRR重復。
[0016] 根據(jù)本發(fā)明提供的RMg38基因序列信息（SEQ ID N0:1，），本領(lǐng)域技術(shù)人員可以通 過以下方法獲得與RMg38等同的基因：（1)通過數(shù)據(jù)庫檢索獲得；（2)以RMg38基因片段為 探針篩選水稻或其它植物的基因組文庫或cDNA文庫獲得；（3)根據(jù)RMg38序列信息設(shè)計寡 核昔苷酸引物，用PCR擴增的方法從水稻或其它植物的基因組、mRNA和cDNA中獲取；（4) 在RMg38基因序列的基礎(chǔ)上用基因工程方法改造獲得；（5)用化學合成的方法獲得該基因。
[0017] 本發(fā)明提供的稻瘟病抗性基因 RMg38具有重要的應(yīng)用價值。將所述的RMg38基因 序列用任何一種轉(zhuǎn)化方法導入水稻或其他植物細胞，可獲得表達所述基因的轉(zhuǎn)基因抗病品 種，從而應(yīng)用于生產(chǎn)。本發(fā)明所述的基因構(gòu)建到植物轉(zhuǎn)化載體中，可以對所述基因或其調(diào)控 序列適當修飾，也可以用其它啟動子取代所述基因原有的啟動子，從而拓寬抗譜或增強抗 性。
[0018] 本發(fā)明具有如下有益效果：將克隆的抗稻瘟病基因轉(zhuǎn)入感病的植物中，有助于獲 得新的抗病植物?？寺〉目共』蚰茉诓煌奈锓N間轉(zhuǎn)移并利用，從而能夠克服傳統(tǒng)抗病 育種中遠緣雜交的困難。此外，可以用轉(zhuǎn)基因技術(shù)在植物中累加多個抗病基因，縮短育種周 期。本發(fā)明還能夠進一步提供或應(yīng)用上述DNA片段獲得的抗病轉(zhuǎn)基因植株和相應(yīng)的種子， 以及用本發(fā)明的基因或基于該基因的重組體轉(zhuǎn)化的植株或由這類植株獲得的種子?？梢杂?有性雜交的方式將本發(fā)明的基因轉(zhuǎn)入其他植株。
[0019]

【專利附圖】

【附圖說明】
[0020] 圖1為本發(fā)明流程不意圖。圖IA :抗稻癌病候選位點的確定；圖1B-E :抗稻癌病 基因的分離與克??；圖IF-G :抗稻瘟病基因的遺傳轉(zhuǎn)化；圖IH :轉(zhuǎn)化體的鑒定。
[0021] 圖2為稻瘟病抗性基因 RMg38的轉(zhuǎn)化體的潮霉素抗性基因和CaMV 35S啟動子的 PCR檢測電泳圖；圖2A為CaMV 35S啟動子的PCR擴增產(chǎn)物，泳道1-6為轉(zhuǎn)化體的PCR擴增 產(chǎn)物，泳道7為載體pCAMBIA1300-AscI質(zhì)粒的PCR擴增產(chǎn)物，泳道8為受體新2號的非轉(zhuǎn) 化體的PCR擴增產(chǎn)物；圖2B為潮霉素抗性基因的PCR產(chǎn)物，泳道1-6為轉(zhuǎn)化體的PCR擴增 產(chǎn)物，泳道7為載體pCAMBIA1300-AscI質(zhì)粒的PCR擴增產(chǎn)物，泳道8為受體新2號的非轉(zhuǎn) 化體的PCR擴增產(chǎn)物。
[0022] 圖3為轉(zhuǎn)化有RMg38基因植株抗性鑒定圖。圖3A :對照植株新2號的抗性鑒定圖； 圖3B :稻瘟病抗性基因 RMg38的轉(zhuǎn)化植株的抗性鑒定圖。
[0023]

【具體實施方式】
[0024] 水稻抗稻癌病候選基因的確定：以水稻全基因組測序品種93-11和日本晴為基 礎(chǔ)，首先鑒定基因組中所有的NBS-LRR類型的抗病基因，并構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。在此基礎(chǔ)上， 我們選取了 20個候選的抗稻瘟病基因位點，通過引物設(shè)計、在抗稻瘟病的水稻品種中進行 長片段PCR、載體構(gòu)建、轉(zhuǎn)基因、抗性鑒定等過程，最后通過10個來源于中國大陸分布所有 水稻主產(chǎn)區(qū)的稻瘟病菌系統(tǒng)鑒定，鑒定出1個具有特異性抗性的抗稻瘟病基因。
[0025] 下述實施例中所用方法如無特別說明，均為常規(guī)方法。
[0026] 實施例1稻瘟病抗性基因 RMg38的克隆、載體構(gòu)建、抗病植株鑒定 本實施例的試驗流程如圖1所示。
[0027] 1、抗稻瘟病候選位點RMg38的確定：（1)多以基因家族和基因簇的形式存在，在日 本晴和93-11中各有4個和2個相近的拷貝；（2)在其LRR區(qū)域，特別是LxxLxLxx區(qū)域具 有較高的Ka/Ks值； 2、稻瘟病抗性基因 RMg38 (12g36730-Q2436)的分離與克?。豪霉矓?shù)據(jù)庫測序品 種日本晴（Nipponbare)和93-11為參考序列，設(shè)計引物（引物兩端皆帶有酶切位點AscI)。 引物序列參見序列表，正向引物序列如SEQ ID N0:4所示；反向引物序列如SEQ ID N0:5所 /Jn 〇
[0028] 以抗病水稻品種Tet印，谷梅2號和Q2436為模板，利用長片段PCR技術(shù) (Long-PCR)擴增候選基因片段。PCR程序如下：95°C預變性5分鐘，95°C變性30秒，60°C 復性45秒，68 °C延伸7分鐘，共35個循環(huán)，隨后72 °C保溫10分鐘，最后KTC恒溫。隨后對 PCR產(chǎn)物進行割膠回收。
[0029] 3、雙功能基礎(chǔ)載體的準備：將稀有酶切位點AscI導入雙功能載體pCAMBIA1300的 多克隆位點BamHI和Sail之間，取代酶切位點XbaI，構(gòu)成基礎(chǔ)載體pCAMBIA1300-AscI。
[0030] 4、候選抗性基因與基礎(chǔ)載體的連接：用限制性內(nèi)切酶AscI，同時酶切PCR產(chǎn) 物與基礎(chǔ)載體質(zhì)粒，并純化。在T4連接酶的作用下，將候選基因片段連入基礎(chǔ)載體 pCAMBIA1300-AscI。
[0031] 5、候選抗性基因的遺傳轉(zhuǎn)化：將攜有候選基因的雙功能載體導入根癌農(nóng)桿菌 EHA105,采用農(nóng)桿菌介導法，將候選基因轉(zhuǎn)化到水稻普感品種新2號，TP309和C〇39中。最 后一共獲得20株獨立的轉(zhuǎn)化體。
[0032] 6、PCR分子檢測：以轉(zhuǎn)化體DNA為模板，用潮霉素抗性基因及其上游CaMV35S啟 動子的特異性引物對其進行PCR反應(yīng)。潮霉素抗性基因的引物序列參照序列表，正向引物 序列如SEQ ID N0:6;反向引物序列如SEQ ID NOJtjCaMVSSS啟動子的引物序列參照序列 表，正向引物序列如SEQ ID N0:8 ;反向引物序列如SEQ ID N0:9 (圖2和圖3)。
[0033] 7、轉(zhuǎn)化體的抗性鑒定：選擇10個來源地不同，區(qū)別力好的獨立稻瘟病菌生理小種 作為檢測的病原菌種。利用稻瘟病菌小種接種感染T2代轉(zhuǎn)基因植株和對照品種，篩選抗病 性改變的轉(zhuǎn)化體?？剐澡b定結(jié)果顯示候選基因 RMg38在普感品種新2號的遺傳背景下，對 4個病原菌株都顯示不同程度的抗性，表明候選基因 RMg38具有特異性抗性且被成功克隆。
[0034] 8、稻瘟病抗性基因 RMg38的基因結(jié)構(gòu)和蛋白結(jié)構(gòu)分析：采用步移法對RMg38的 DNA序列進行了測序。RMg38基因 DNA長度為3533bp，含有6個開放讀碼框，5個內(nèi)含子和6 個外顯子。RMg38編碼的蛋白序列如SEQ ID NO:2所示。RMg38基因編碼1個由748個氨 基酸殘基組成的蛋白多肽。RMg38蛋白屬于NBS-LRR蛋白，其蛋白的C-末端為8個LRR重 復。
【權(quán)利要求】
1. 一種水稻抗稻瘟病基因 RMg38,其核苷酸序列為如SEQ ID N0:1所示的DNA序列，或 者其核苷酸序列是與SEQ ID NO: 1所示的DNA序列在相似度上>95%相似的DNA序列，或 其核苷酸序列的功能相當于SEQ ID NO: 1所示DNA序列的亞片段，或者如SEQ ID NO: 1所 示的DNA序列經(jīng)過替換、缺失或增加一個或多個核苷酸且編碼相同氨基酸序列的核苷酸序 列。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述基因序列編碼的蛋白。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示，或SEQ ID NO:2 所示的序列經(jīng)過替換、缺失、或添加部分氨基酸而形成的具有相同功能的氨基酸序列。
4. 一種調(diào)控如權(quán)利要求1所述水稻抗稻瘟病基因 RMg38的啟動子，其核苷酸序列如SEQ ID NO:3 所示。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種水稻抗稻瘟病基因 RMg38,其特征是含有調(diào)控水稻抗稻 瘟病基因 RMg38的啟動子，所述啟動子的核苷酸序列如SEQ ID N0:3所示。
6. 含有權(quán)利要求1所述基因的轉(zhuǎn)化載體。
7. 含有權(quán)利要求6所述轉(zhuǎn)化載體的宿主細胞根癌農(nóng)桿菌EHA105。
8. 含有權(quán)利要求6所述轉(zhuǎn)化載體的轉(zhuǎn)基因植物。
9. 權(quán)利要求1所述的基因在抗稻瘟病水稻育種中的應(yīng)用。
10. 權(quán)利要求2所述蛋白在制備抗稻瘟病菌藥物中的應(yīng)用。
【文檔編號】A01H5/00GK104293799SQ201410460903
【公開日】2015年1月21日 申請日期:2014年9月11日 優(yōu)先權(quán)日:2014年9月11日
【發(fā)明者】張小輝, 謝正清, 田大成, 楊四海 申請人:南京大學