完整冷凍保存及解凍細(xì)胞內(nèi)核糖體新生肽鏈復(fù)合物的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種完整冷凍保存及解凍細(xì)胞內(nèi)核糖體新生肽鏈復(fù)合物的方法。該方法是在正常生長(zhǎng)的細(xì)胞培養(yǎng)液中加入翻譯延伸抑制劑，待翻譯延伸抑制劑有效作用于RNC，抑制翻譯延伸的進(jìn)行后，將細(xì)胞冷卻至0～4℃，再用預(yù)冷至0～4℃的PBS溶液清洗細(xì)胞以及加入細(xì)胞中，液氮中快速冷凍，超低溫保存，于冰上解凍，再抽提RNC。本發(fā)明通過(guò)采用翻譯延伸抑制劑有效固定核糖體，使之不易解離，將細(xì)胞內(nèi)的翻譯狀況固定下來(lái)；再通過(guò)液氮急凍方法有效地冷凍保存RNC長(zhǎng)期儲(chǔ)存和運(yùn)輸，并且解凍后所提取的RNC與新鮮細(xì)胞提取的RNC無(wú)異，因此本發(fā)明突破了時(shí)間和空間的限制，為研究RNC及開(kāi)展RNC商業(yè)服務(wù)提供了便利。
【專利說(shuō)明】完整冷凍保存及解凍細(xì)胞內(nèi)核糖體新生肽鏈復(fù)合物的方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生命科學(xué)【技術(shù)領(lǐng)域】，特別涉及一種完整冷凍保存及解凍細(xì)胞內(nèi)核糖體 新生膚鏈復(fù)合物（Ribosome Nascent-chain Complex，RNC)的方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 翻譯調(diào)控是生命體內(nèi)的重要調(diào)控層次。在細(xì)胞中有的基因翻譯多、有的基因翻 譯少，有的基因根本就不被翻譯。因此對(duì)細(xì)胞中的翻譯狀況進(jìn)行研究顯得極為必要。細(xì) 胞進(jìn)行翻譯時(shí)，核糖體結(jié)合在mRNA鏈上并移動(dòng)，依據(jù)mRNA上的三聯(lián)密碼子信息來(lái)逐步 合成蛋白質(zhì)多肽鏈（稱為新生肽鏈，nascent-chain)。這一復(fù)合物稱為核糖體新生肽 鏈復(fù)合物（Ribosome Nascent-chain Complex, RNC)。只有完整提取了 RNC，才能對(duì)正在 翻譯的mRNA進(jìn)行定性定量研究以及對(duì)新生肽鏈進(jìn)行研究。對(duì)正在翻譯的mRNA的定性 定量研究和對(duì)新生肽鏈的研究是翻譯研究的主要的兩大方面。因此，完整提取得到RNC 對(duì)研究和應(yīng)用都有重要的意義。對(duì)正在翻譯的mRNA進(jìn)行測(cè)定（翻譯組測(cè)序），可用正 在翻譯的mRNA的含量推算蛋白質(zhì)的含量（Wang et al.Translating mRNAs strongly correlate to proteins in a multivariate manner and their translation ratios are phenotype specific. Nucleic acids research 41，4743-4754, 2013)，可計(jì)算翻譯效 率從而表征細(xì)胞的各種表型（Wang et al. ,2013,文獻(xiàn)前面已提過(guò)，此處略，下文中，只要 是簡(jiǎn)寫(xiě)的，均為文獻(xiàn)名稱已在【背景技術(shù)】提及過(guò)），可以發(fā)現(xiàn)未知蛋白（Zhang et al. How to discover new proteins-translatome profiling. Science China Life sciences 57, 358-360, 2014b)，對(duì)蛋白質(zhì)組也有重要的指導(dǎo)意義（Chang et al· Systematic analyses of the transcriptome，translatome，and proteome provide a global view and potential strategy for the C-HPP. Journal of proteome research 13,38-49， 2014 ；Liu et al. Chromosome-8-coded proteome of Chinese Chromosome Proteome Data set (CCPD)2. Owith partial immunohistochemical verifications. Journal of proteome research 13, 126-136,2014 ;Wang et al. Omics evidence: single nucleotide variants transmissions on chromosome 20in liver cancer cell lines. Journal of proteome research 13, 200-211，2014 ;Zhang et al.Systematic analysis of missing proteins provides clues to help define all of the protein-coding genes on human chromosome 1. Journal of proteome research 13，114-125,2014a ;Zhong et al. Resolving chromosome-centric human proteome with translating mRNA analysis:a strategic demonstration. Journal of proteome research 13, 50-59, 2014)，被列為人 類蛋白質(zhì)組計(jì)劃的第四支柱（Zhong et al.，2014)。對(duì)新生肽鏈的研究，可以研究蛋白質(zhì) 合成過(guò)程中的折疊狀況（Zhang et al. Transient ribosomal attenuation coordinates protein synthesis and co-translational folding. Nature structural&molecular biology 16,274-280,2009 ;Zhang and Ignatova. Generic algorithm to predict the speed of translational elongation: implications for protein biogenesis. PloS one 4,e5036,2009 ;Zhang and Ignatova. Folding at the birth of the nascent chain: coordinating translation with c〇-translational folding. Current opinion in structural biology 21, 25-31,2011)，也可為生物工程中外源表達(dá)蛋白的可溶性優(yōu)化 提供重要依據(jù)（專利申請(qǐng)?zhí)枺?01310164451. 4, 201310164454. 8)。
[0003] 能高效完整提取RNC的方法是利用蔗糖密度梯度離心法，此方法能完整提出RNC， 定量保留核糖體上全長(zhǎng)的mRNA和新生肽鏈以供其后的各種生化與分子生物學(xué)研究（Wang et al.，2013;Zhang et al.，2009)。然而此法只適用于新鮮細(xì)胞提取RNC。由于RNC非常 脆弱，無(wú)法在不冷凍的情形下長(zhǎng)期保存和運(yùn)輸；而在冷凍與解凍后，核糖體會(huì)從mRNA上大 量脫落，無(wú)法做到有效保存（Zhang et al.，2009)。因此，RNC相關(guān)分析只能在少數(shù)具備全 部相關(guān)實(shí)驗(yàn)條件的實(shí)驗(yàn)室完成，無(wú)法保存和運(yùn)輸。這給許多實(shí)驗(yàn)應(yīng)用以及商業(yè)服務(wù)帶來(lái)了 很大的困難。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)與不足，提供一種完整冷凍保存及解凍細(xì) 胞內(nèi)核糖體新生肽鏈復(fù)合物的方法。
[0005] 本發(fā)明的目的通過(guò)下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：一種完整冷凍保存及解凍細(xì)胞內(nèi)核糖體新 生肽鏈復(fù)合物的方法，包括如下步驟：首先通過(guò)翻譯延伸抑制劑抑制細(xì)胞的翻譯活動(dòng)，然后 去除培養(yǎng)液，清洗細(xì)胞，再將清洗后的細(xì)胞用液氮進(jìn)行快速冷凍處理，接著將快速冷凍處理 好的細(xì)胞置于不高于_80°C的環(huán)境下保存；使用時(shí)將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至冰上解凍即可；
[0006] 所述的完整冷凍保存及解凍細(xì)胞內(nèi)核糖體新生肽鏈復(fù)合物的方法，優(yōu)選包括如下 步驟：
[0007] (1)抑制細(xì)胞的翻譯活動(dòng)：在正常生長(zhǎng)的細(xì)胞培養(yǎng)液中加入翻譯延伸抑制劑，搖 勻，翻譯延伸抑制劑的用量為能穩(wěn)定抑制細(xì)胞翻譯延伸即可；接著將細(xì)胞置于原培養(yǎng)環(huán)境 中培養(yǎng)，該培養(yǎng)的目的是為了使得翻譯延伸抑制劑能有效作用于RNC，抑制翻譯延伸的進(jìn) 行；然后將細(xì)胞立即冷卻至〇?4°C，以使其其余代謝過(guò)程基本停止，防止RNC被降解；
[0008] (2)去除培養(yǎng)液，對(duì)不同細(xì)胞的操作具體如下：
[0009] ①對(duì)懸浮培養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行離心，棄上清，取沉淀；
[0010] ②對(duì)貼壁生長(zhǎng)細(xì)胞而言，倒出培養(yǎng)液即可；
[0011] ⑶清洗：使用預(yù)冷至〇?4°C的PBS溶液清洗細(xì)胞，清洗完畢后棄去PBS溶液；對(duì) 不同細(xì)胞的操作具體如下：
[0012] ①將PBS溶液加入懸浮培養(yǎng)細(xì)胞中，將懸浮培養(yǎng)細(xì)胞懸于PBS溶液后離心，棄上 清，取沉淀；
[0013] ②將PBS溶液加入貼壁生長(zhǎng)細(xì)胞中，再倒出PBS溶液即可；
[0014] (4)快速冷凍處理：加入預(yù)冷至0?4°C的PBS溶液，待速凍完畢后的溫度穩(wěn)定在 液氮溫度后進(jìn)行下一步；對(duì)不同細(xì)胞的操作具體如下：
[0015] ①對(duì)懸浮培養(yǎng)細(xì)胞的操作為將細(xì)胞懸于PBS溶液后立即浸沒(méi)于液氮中；
[0016] ②對(duì)貼壁生長(zhǎng)細(xì)胞的操作為將PBS溶液浸沒(méi)過(guò)細(xì)胞后立即放入液氮中；
[0017] (5)超低溫保存：將速凍完畢的細(xì)胞轉(zhuǎn)移至超低溫保存環(huán)境，該超低溫保存環(huán)境 應(yīng)滿足溫度始終不高于-80°C ;在該條件下，能進(jìn)行儲(chǔ)存和運(yùn)輸；
[0018] (6)解凍：儲(chǔ)存和運(yùn)輸后需解凍以繼續(xù)提取RNC時(shí)，將細(xì)胞從超低溫保存環(huán)境迅速 轉(zhuǎn)移至冰上，等待解凍過(guò)程中避免震動(dòng)，直至完全解凍。
[0019] 本發(fā)明的操作和細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中的操作一樣，動(dòng)作要輕柔；
[0020] 本發(fā)明中所述的PBS溶液為能保持細(xì)胞滲透壓的PBS溶液，如pH7. 2?7. 4、 0· 01 ?0· lmol/L 的 PBS 溶液；
[0021] 所述的PBS溶液優(yōu)選通過(guò)如下步驟制備得到：稱取NaCl 8.0g、KC1 0. 2g、 ΚΗ2Ρ040· 24g、Na2HP04 · 12H20 3. 628g，再用水定容至 1000ml，除菌；
[0022] 當(dāng)所述的水為DEPC處理水時(shí)，所述的除菌為過(guò)濾除菌或高壓滅菌；高壓滅菌的條 件為115?121°C滅菌15?60min ;
[0023] 當(dāng)所述的水不是DEPC處理水時(shí)，只能高壓滅菌，條件為121 °C高壓蒸汽滅菌 60min ；
[0024] 本發(fā)明中所述的離心的條件和細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中的離心的條件相同，優(yōu)選為800? lOOOrpm 離心 10 ?20min ;
[0025] 步驟（1)中所述的翻譯延伸抑制劑在所述的細(xì)胞培養(yǎng)液中的終濃度優(yōu)選為應(yīng)為 能完全抑制翻譯延伸的最低濃度的2倍以上；
[0026] 所述的翻譯延伸抑制劑包括放線菌酮、氯霉素等；對(duì)于真核生物而言，適用放線菌 酮；對(duì)于原核生物而言，適用氯霉素；
[0027] 所述的放線菌酮在所述的細(xì)胞培養(yǎng)液中的終濃度優(yōu)選為0. lmg/ml以上；
[0028] 步驟（1)中所述的將細(xì)胞置于原培養(yǎng)環(huán)境中培養(yǎng)的時(shí)間優(yōu)選為10?20分鐘；更 優(yōu)選為15分鐘；
[0029] 步驟（1)中所述的將細(xì)胞立即冷卻至0?4°C中的溫度優(yōu)選為0°C，可通過(guò)如下操 作實(shí)現(xiàn)：將細(xì)胞立即轉(zhuǎn)移至冰上卻至〇°C ;
[0030] 步驟（5)中所述的超低溫是指-80°c以下，目前常用-196?-80°c，從成本考慮， 優(yōu)選為_(kāi)80°C。
[0031] 本發(fā)明相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)具有如下的優(yōu)點(diǎn)及效果：
[0032] (1)本發(fā)明提供的方法能有效地冷凍保存RNC長(zhǎng)期儲(chǔ)存和運(yùn)輸，并且解凍后所提 取的RNC與新鮮細(xì)胞提取的RNC無(wú)異。
[0033] (2)本發(fā)明提供的方法突破了時(shí)間和空間的限制，為進(jìn)一步研究RNC提供了便利。

【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0034] 圖1是冷凍A549細(xì)胞翻譯組測(cè)序的基因表達(dá)量與新鮮A549細(xì)胞翻譯組測(cè)序的基 因表達(dá)量比較后的結(jié)果圖。
[0035] 圖2是不同實(shí)施方式提取的RNC-RNA的瓊脂糖電泳凝膠結(jié)果圖；其中：泳道1和2 為對(duì)比例2中分別于室溫和-20°C條件放置兩天后抽提得到的RNC-RNA，泳道3為對(duì)比例1 中樣品使用非急凍條件后抽提得到的RNC-RNA，泳道4為按實(shí)施例1步驟處理樣品后抽提得 到的 RNC-RNA。

【具體實(shí)施方式】
[0036] 下面結(jié)合實(shí)施例及附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的描述，但本發(fā)明的實(shí)施方式不限 于此。
[0037] 本發(fā)明實(shí)施例涉及的主要材料如下：
[0038] -人肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549(購(gòu)自美國(guó)ATCC)。
[0039] -PBS 溶液：稱取 NaCl 8. 0g、KC1 0· 2g、ΚΗ2Ρ040· 24g、Na2HP04 · 12Η203· 628g，再用 雙蒸水水定容至1000ml，pH = 7. 4,121°C滅菌1小時(shí)。
[0040] -RB 溶液：20mM、ρΗ7· 4 的 HEPES-K0H 溶液、15mM MgCl2、200mM KC1、100 μ g/ml 放 線菌酮，2mM二硫蘇糖醇，pH = 7. 4。配制時(shí)使用無(wú)菌無(wú) RNase的水和無(wú)菌器具，配制完畢 后溶液需過(guò)濾除菌。
[0041] -蔗糖溶液：30% (w/v)蔗糖溶于上述RB溶液，預(yù)冷至0?4°C。
[0042] -放線菌酮（廣州捷倍斯公司）水溶液儲(chǔ)液：濃度為100mg/ml。
[0043] -細(xì)胞培養(yǎng)液：在Dulbecco's modified Eagle's medium細(xì)胞培養(yǎng)液（Invitrogen 公司）加入胎牛血清（PAA Australia公司）、氨芐青霉素、鏈霉素和環(huán)丙沙星，其中，胎牛血 清的終濃度為體積百分比10%、氨芐青霉素和鏈霉素的終濃度分別為質(zhì)量體積比1%，環(huán) 丙沙星的終濃度為10 μ g/ml (殺滅可能的支原體污染）。
[0044] -細(xì)胞裂解液：Triton X-100溶于上述RB溶液中，Triton X-100的終濃度為體積 百分比1%。
[0045] 實(shí)施例1
[0046] (1)用細(xì)胞培養(yǎng)液于37°C、0. 5% C02環(huán)境中培養(yǎng)人肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549。
[0047] (2)接著加入放線菌酮水溶液儲(chǔ)液，搖勻，放線菌酮的終濃度為0. lmg/ml。
[0048] (3)在原培養(yǎng)環(huán)境（即37°C、0. 5% C02環(huán)境）繼續(xù)培養(yǎng)15分鐘。
[0049] (4)小心倒出培養(yǎng)液，再加入預(yù)冷至0°C的PBS溶液，PBS溶液的作用是清洗細(xì)胞。
[0050] (5)小心倒出PBS溶液，再加入預(yù)冷至0°C的PBS溶液，此時(shí)PBS溶液必須要浸沒(méi) 過(guò)A549細(xì)胞。
[0051] (6)由于A549細(xì)胞是貼壁生長(zhǎng)的，將細(xì)胞培養(yǎng)瓶的細(xì)胞貼壁面迅速放入液氮中， 直至溫度穩(wěn)定在液氮溫度（-196 °C )。
[0052] (7)將已速凍好的細(xì)胞培養(yǎng)瓶迅速轉(zhuǎn)移至_80°C超低溫冰箱，保存。
[0053] (8)需繼續(xù)提取RNC時(shí)，從超低溫冰箱中取出細(xì)胞培養(yǎng)瓶，埋入事先準(zhǔn)備好的冰盒 中，在〇°C下靜置解凍。
[0054] (9)解凍完畢，立刻繼續(xù)進(jìn)行提取RNC的步驟。該步驟見(jiàn)文獻(xiàn)"Wang et al. Translating mRNAs strongly correlate to proteins in a multivariate manner and their translation ratios are phenotype specific. Nucleic acids research 41，4743-4754, 2013"，具體如下：
[0055] ①加入1ml細(xì)胞裂解液，靜置于冰上30分鐘。
[0056] ②用細(xì)胞刮輕輕將細(xì)胞刮下，轉(zhuǎn)移至預(yù)冷至0°C的1. 5ml離心管中。
[0057] ③在微量冷凍臺(tái)式離心機(jī)中離心，條件為16200Xg、10分鐘，除去細(xì)胞碎片（沉 淀）。
[0058] ④上清液小心轉(zhuǎn)移至事先準(zhǔn)備好的在超速離心管中2ml蔗糖溶液表層。
[0059] ⑤4°C、50000 Xg超速離心3小時(shí)。
[0060] ⑥棄上清，將沉淀溶于RB溶液中，得到冷凍A549細(xì)胞的RNC。
[0061] (10)使用TRIzol? RNA提取試劑（Invitrogen公司），按其說(shuō)明手冊(cè)方法操作， 從RNC中提取RNA。
[0062] (11)使用NEBNext mRNA library construction kit for Illumina(New England Biolabs公司）對(duì)RNC-RNA中的mRNA進(jìn)行測(cè)序建庫(kù)，Illumina HiSeq-2000測(cè)序儀進(jìn)行二 代測(cè)序，獲得冷凍A549細(xì)胞的翻譯組測(cè)序信息（正在翻譯的mRNA的定量信息）。
[0063] 為檢驗(yàn)本發(fā)明方法對(duì)RNC的定量保存效果，將上述結(jié)果與未經(jīng)冷凍的A549細(xì)胞新 鮮提取的RNC-RNA測(cè)序結(jié)果（具體方法見(jiàn)Wang et al.，2013)進(jìn)行比較。
[0064] 圖1是比較冷凍2天后的A549細(xì)胞翻譯組測(cè)序的基因表達(dá)量（LN)與新鮮A549 細(xì)胞翻譯組測(cè)序的基因表達(dá)量（N)的結(jié)果圖?；虮磉_(dá)量采用rpkM法計(jì)算（Mortazavi et al. Mapping and quantifying mammalian transcriptomes by RNA-Seq. Nature methods 5, 621-628, 2008)。由圖中可知，冷凍提取RNC與新鮮提取RNC中，正在翻譯中的mRNA表 達(dá)量高度一致，Pearson相關(guān)系數(shù)高達(dá)R = 0· 99。進(jìn)一步使用edgeR軟件（Robinson et al· edgeR:a Bioconductor package for differential expression analysis of digital gene expression data. Bioinformatics 26, 139-140, 2010)分析兩種方法的差異基因， 在14226個(gè)定量檢測(cè)到的基因中，有統(tǒng)計(jì)顯著差別（p〈0. 01)的基因僅有11個(gè)（僅占 0.077% )，完全可認(rèn)為是實(shí)驗(yàn)誤差導(dǎo)致。這些結(jié)果說(shuō)明本發(fā)明方法從冷凍細(xì)胞中提取的 RNC與新鮮提取RNC無(wú)明顯的定量差別。
[0065] 對(duì)比例1
[0066] (1)同實(shí)施例1步驟（1)。
[0067] (2)同實(shí)施例1步驟（2)。
[0068] (3)同實(shí)施例1步驟（3)。
[0069] (4)同實(shí)施例1步驟（4)。
[0070] (5)同實(shí)施例1步驟（5)。
[0071] (6)接著置于_80°C冰箱緩慢冷凍細(xì)胞樣品。
[0072] (7)解凍及提取RNC，同實(shí)施例1步驟⑶?（10)。
[0073] (8)檢測(cè)：使用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，SYBR Green II染料染色，紫外凝膠成像 系統(tǒng)拍攝。使用Nanodrop 2000型微量分光光度計(jì)進(jìn)行RNA定量測(cè)定。
[0074] 按實(shí)施例1方法提出的RNC-RNA經(jīng)過(guò)濃度測(cè)定及計(jì)算，實(shí)施例1明顯多于對(duì)比例 1提供的方法：正常提取濃度（實(shí)施例1)為202ng/μ 1，對(duì)比例1提取樣品濃度為97. 7ng/ μ 1，比正常提取方法少2倍多。取等體積上樣跑膠，對(duì)比例1所得RNA條帶（圖2,泳道3) 亮度比實(shí)施例1中所得RNA條帶（圖2,泳道4)亮度明顯低?？梢?jiàn)，在液氮中速凍后RNC能 最大程度保存，而慢速冷凍會(huì)造成核糖體大量脫落，提取量低。
[0075] 對(duì)比例2
[0076] (1)同實(shí)施例1步驟（1)。
[0077] (2)同實(shí)施例1步驟（2)。
[0078] (3)同實(shí)施例1步驟（3)。
[0079] (4)同實(shí)施例1步驟（4)。
[0080] (5)同實(shí)施例1步驟（5)。
[0081] (6)不進(jìn)行冷凍，而是在室溫下或-20°C下放置2天。
[0082] (7)提取RNC，同實(shí)施例1步驟（9)和（10)。
[0083] (8)檢測(cè)：使用2 %瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，SYBR Green 11染料染色，紫外凝膠成像 系統(tǒng)拍攝。
[0084] 從電泳結(jié)果可看出，所提取得到的RNC-RNA均有嚴(yán)重的降解（圖2,泳道1為室溫， 泳道2為-20°C )，無(wú)法用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。這說(shuō)明如果不采用超低溫冷凍的方法，RNC是不穩(wěn) 定的，將無(wú)法長(zhǎng)期保存運(yùn)輸RNC。
[0085] 上述實(shí)施例為本發(fā)明較佳的實(shí)施方式，但本發(fā)明的實(shí)施方式并不受上述實(shí)施例的 限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實(shí)質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡(jiǎn)化， 均應(yīng)為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
【權(quán)利要求】
1. 一種完整冷凍保存及解凍細(xì)胞內(nèi)核糖體新生肽鏈復(fù)合物的方法，其特征在于包括如 下步驟：首先通過(guò)翻譯延伸抑制劑抑制細(xì)胞的翻譯活動(dòng)，然后去除培養(yǎng)液，清洗細(xì)胞，再將 清洗后的細(xì)胞用液氮進(jìn)行快速冷凍處理，接著將快速冷凍處理好的細(xì)胞置于不高于-80°c 的環(huán)境下保存；使用時(shí)將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至冰上解凍即可。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述完整冷凍保存及解凍細(xì)胞內(nèi)核糖體新生肽鏈復(fù)合物的方法，其 特征在于： (1) 抑制細(xì)胞的翻譯活動(dòng)：在正常生長(zhǎng)的細(xì)胞培養(yǎng)液中加入翻譯延伸抑制劑，搖勻，翻 譯延伸抑制劑的用量為能穩(wěn)定抑制細(xì)胞翻譯延伸；接著將細(xì)胞置于原培養(yǎng)環(huán)境中培養(yǎng)，該 培養(yǎng)的目的是為了使得翻譯延伸抑制劑能有效作用于RNC，抑制翻譯延伸的進(jìn)行；然后將 細(xì)胞立即冷卻至0?4°C，以使其其余代謝過(guò)程基本停止，防止RNC被降解； (2) 去除培養(yǎng)液，對(duì)不同細(xì)胞的操作具體如下： ① 對(duì)懸浮培養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行離心，棄上清，取沉淀； ② 對(duì)貼壁生長(zhǎng)細(xì)胞而言，倒出培養(yǎng)液即可； (3) 清洗：使用預(yù)冷至0?4°C的PBS溶液清洗細(xì)胞，清洗完畢后棄去PBS溶液；對(duì)不同 細(xì)胞的操作具體如下： ① 將PBS溶液加入懸浮培養(yǎng)細(xì)胞中，將懸浮培養(yǎng)細(xì)胞懸于PBS溶液后離心，棄上清，取 沉淀； ② 將PBS溶液加入貼壁生長(zhǎng)細(xì)胞中，再倒出PBS溶液即可； (4) 快速冷凍處理：加入預(yù)冷至0?4°C的PBS溶液，待速凍完畢溫度穩(wěn)定在液氮溫度 后進(jìn)行下一步；對(duì)不同細(xì)胞的操作具體如下： ① 對(duì)懸浮培養(yǎng)細(xì)胞的操作為將細(xì)胞懸于PBS溶液后立即浸沒(méi)于液氮中； ② 對(duì)貼壁生長(zhǎng)細(xì)胞的操作為將PBS溶液浸沒(méi)過(guò)細(xì)胞后立即放入液氮中； (5) 超低溫保存：將速凍完畢的細(xì)胞轉(zhuǎn)移至超低溫保存環(huán)境，該超低溫保存環(huán)境應(yīng)滿 足溫度始終不高于-80°C ;在該條件下，能進(jìn)行儲(chǔ)存和運(yùn)輸； (6) 解凍：儲(chǔ)存和運(yùn)輸后需解凍以繼續(xù)提取RNC時(shí)，將細(xì)胞從超低溫保存環(huán)境迅速轉(zhuǎn)移 至冰上，等待解凍過(guò)程中避免震動(dòng)，直至完全解凍。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述完整冷凍保存及解凍細(xì)胞內(nèi)核糖體新生肽鏈復(fù)合物的方法，其 特征在于：所述的PBS溶液為pH7. 2?7. 4、0. 01?0. lmol/L的PBS溶液。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述完整冷凍保存及解凍細(xì)胞內(nèi)核糖體新生肽鏈復(fù)合物的方法，其 特征在于： 所述的PBS溶液通過(guò)如下步驟制備得到：稱取NaCl 8. 0g、KC1 0. 2g、KH2P040 . 24g、 Na2HP04 · 12H20 3. 628g，再用水定容至 1000ml，除菌； 當(dāng)所述的水為DEPC處理水時(shí)，所述的除菌為過(guò)濾除菌或高壓滅菌；高壓滅菌的條件為 115 ?121°C 滅菌 15 ?60min ; 當(dāng)所述的水不是DEPC處理水時(shí)，只能高壓滅菌，條件為121 °C高壓蒸汽滅菌60min。
5. 根據(jù)權(quán)利要求2所述完整冷凍保存及解凍細(xì)胞內(nèi)核糖體新生肽鏈復(fù)合物的方法，其 特征在于：步驟（1)中所述的翻譯延伸抑制劑在所述的細(xì)胞培養(yǎng)液中的終濃度為能完全抑 制翻譯延伸的最低濃度的2倍以上。
6. 根據(jù)權(quán)利要求2所述完整冷凍保存及解凍細(xì)胞內(nèi)核糖體新生肽鏈復(fù)合物的方法，其 特征在于：步驟（1)中所述的將細(xì)胞置于原培養(yǎng)環(huán)境中培養(yǎng)的時(shí)間為10?20分鐘。
7. 根據(jù)權(quán)利要求2所述完整冷凍保存及解凍細(xì)胞內(nèi)核糖體新生肽鏈復(fù)合物的方法，其 特征在于：所述的翻譯延伸抑制劑為放線菌酮或氯霉素。
8. 根據(jù)權(quán)利要求2所述完整冷凍保存及解凍細(xì)胞內(nèi)核糖體新生肽鏈復(fù)合物的方法，其 特征在于：步驟⑴中所述的冷卻的溫度為〇°C。
9. 根據(jù)權(quán)利要求2所述完整冷凍保存及解凍細(xì)胞內(nèi)核糖體新生肽鏈復(fù)合物的方法，其 特征在于：步驟⑵和（3)中所述的離心的條件為800?lOOOrpm離心10?20min。
10. 根據(jù)權(quán)利要求2所述完整冷凍保存及解凍細(xì)胞內(nèi)核糖體新生肽鏈復(fù)合物的方法， 其特征在于：步驟（5)中所述的超低溫為-196?-80°C。
【文檔編號(hào)】A01N1/02GK104186460SQ201410387213
【公開(kāi)日】2014年12月10日 申請(qǐng)日期:2014年8月7日 優(yōu)先權(quán)日:2014年8月7日
【發(fā)明者】孫黎, 張弓, 王通, 金靜潔 申請(qǐng)人:暨南大學(xué)