一種通城虎莖段的繁殖方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種通城虎莖段的繁殖方法，包括：步驟(1)制作通城虎外植體；步驟(2)利用誘導(dǎo)培養(yǎng)基培養(yǎng)外植體，待外植體萌發(fā)后獲得試管苗，誘導(dǎo)培養(yǎng)基中含0.5-2.0mg/L的6-芐氨基腺嘌呤；步驟(3)利用增殖培養(yǎng)基培養(yǎng)試管苗，增殖培養(yǎng)基中含0.5-1.0mg/L的激動素、0-0.2mg/L的6-芐氨基腺嘌呤、0-0.2mg/L的吲哚丁酸；步驟(4)利用壯苗培養(yǎng)基培養(yǎng)試管苗叢生芽，壯苗培養(yǎng)基中含0.2mg/L的6-芐氨基腺嘌呤、0.3-0.5mg/L的吲哚丁酸；步驟(5)利用生根培養(yǎng)基培養(yǎng)健壯試管苗，試管苗根長2-4cm，生根培養(yǎng)基中含0.5mg/L的吲哚丁酸和0-1.0mg/L的萘乙酸；步驟(6)煉苗，移栽至基質(zhì)中培養(yǎng)。本發(fā)明中通過通城虎莖段的快速繁殖方法，能夠快速繁殖出大量適合移栽的優(yōu)良通城虎種苗、滿足生產(chǎn)需要。
【專利說明】
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種通城虎莖段的繁殖方法。 一種通城虎莖段的繁殖方法

【背景技術(shù)】
[0002] 通城虎為馬兜鈴科植物，又名五虎通城、定心草、天然草、學(xué)萎、血藤暗消，草質(zhì)藤 本，根圓柱形，細長，莖無毛，干后常有縱棱；味苦、辛，性溫，有小毒，有解毒消腫、祛風(fēng)鎮(zhèn)痛、 行氣止咳之效，主治風(fēng)濕骨痛、胃脘痛、腹痛、咽喉炎、跌打損傷、小兒驚風(fēng)、毒蛇咬傷。產(chǎn)于 廣西（陸川、蒼梧、昭平）、廣東（博羅、德慶、陽春等）、江西（德興）、浙江和福建等地，野生 的通城虎常生于山谷林下灌叢中和山地石隙中，對生長環(huán)境要求較為嚴格，因此地域分布 范圍相當(dāng)有限，近年來隨著市場需求量的不斷增加，對野生資源的采集量逐漸增大，野生通 城虎資源瀕臨枯竭。利用組織培養(yǎng)快繁技術(shù)，可以有效快速的增加其繁殖系數(shù)，不僅能滿足 市場對通城虎藥材的需求，又有利于通城虎資源的保護。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本發(fā)明設(shè)計開發(fā)了一種通城虎莖段的繁殖方法。本發(fā)明中通過通城虎莖段的快速 繁殖方法，能夠快速繁殖出大量適合移栽的優(yōu)良通城虎種苗、滿足生產(chǎn)需要。
[0004] 本發(fā)明提供的技術(shù)方案為：
[0005] -種通城虎莖段的繁殖方法，包括：
[0006] 步驟⑴、制作通城虎外植體；
[0007] 步驟（2)、利用誘導(dǎo)培養(yǎng)基培養(yǎng)外植體，待外植體萌發(fā)后獲得試管苗，誘導(dǎo)培養(yǎng)基 中含0. 5-2. Omg/L的6-芐氨基腺嘌呤；
[0008] 步驟（3)、利用增殖培養(yǎng)基培養(yǎng)試管苗，得到試管苗叢生芽，增殖培養(yǎng)基中含 0· 5-1. Omg/L的激動素、0-0· 2mg/L的6-芐氨基腺嘌呤、0-0· 2mg/L的吲哚丁酸；
[0009] 步驟（4)、利用壯苗培養(yǎng)基培養(yǎng)試管苗叢生芽，得到健壯試管苗，壯苗培養(yǎng)基中含 0· 2mg/L的6-芐氨基腺嘌呤、0· 3-0. 5mg/L的吲哚丁酸；
[0010] 步驟（5)、利用生根培養(yǎng)基培養(yǎng)健壯試管苗，得到帶根的試管苗，試管苗根長 2-4cm，生根培養(yǎng)基中含0. 5mg/L的卩引哚丁酸和0-1. Omg/L的萘乙酸；
[0011] 步驟（6)、煉苗，移栽至基質(zhì)中培養(yǎng)。
[0012] 優(yōu)選的是，所述的通城虎莖段的繁殖方法中，所述步驟（2)中，誘導(dǎo)培養(yǎng)基中含 1. 5mg/L的6-芐氨基腺嘌呤；所述步驟⑶中，增殖培養(yǎng)基中含0. 5mg/L的激動素、0. 2mg/ L的6-芐氨基腺嘌呤、0.2mg/L的吲哚丁酸；所述步驟（4)中，壯苗培養(yǎng)基中含0.2mg/L的 6_芐氨基腺嘌呤、0. 5mg/L的吲哚丁酸；所述步驟（5)中，生根培養(yǎng)基中含0. 5mg/L的吲哚 丁酸和0. 6mg/L的萘乙酸。
[0013] 優(yōu)選的是，所述的通城虎莖段的繁殖方法中，所述步驟（6)中，基質(zhì)由腐殖土、蛭 石和椰糠按照體積比3:1:1混合組成。
[0014] 優(yōu)選的是，所述的通城虎莖段的繁殖方法中，所述誘導(dǎo)培養(yǎng)基、增殖培養(yǎng)基和壯苗 培養(yǎng)基均采用MS培養(yǎng)基，生根培養(yǎng)基采用1/2MS培養(yǎng)基，誘導(dǎo)培養(yǎng)基、增殖培養(yǎng)基、壯苗培 養(yǎng)基和生根培養(yǎng)基均含有4. 5g/L的瓊脂和25g/L蔗糖，pH值均為5. 8。
[0015] 優(yōu)選的是，所述的通城虎莖段的繁殖方法中，所述步驟（1)中，選取通城虎植株上 帶頂芽的嫩莖段或帶一個腋芽的嫩莖段作為外植體。
[0016] 優(yōu)選的是，所述的通城虎莖段的繁殖方法中，所述步驟（1)中，對外植體進行 消毒，具體消毒的過程為：用體積濃度為1%的洗潔精水溶液浸泡5-10min，自來水沖洗 15-30min，無菌水潤洗一次，然后用體積濃度為75%的酒精浸泡30-50s，再用添加了 2-3滴 吐溫-20的質(zhì)量濃度為0. 1 %的升汞溶液消毒6-8min，最后用無菌水沖洗3-5次。
[0017] 優(yōu)選的是，所述的通城虎莖段的繁殖方法中，所述步驟⑵中，培養(yǎng)溫度為 24-26°C，光照強度為15001ux，光照時間為10-12小時/天，培養(yǎng)30天；所述步驟（3)中， 培養(yǎng)溫度為24-26°C，光照強度為20001u X，光照時間為10-12小時/天，培養(yǎng)30天；所述步 驟⑷中，培養(yǎng)溫度為24-26°C，光照強度為20001ux，光照時間為10-12小時/天，培養(yǎng)21 天；所述步驟（5)中，培養(yǎng)溫度為24-26°C，光照強度為20001UX，光照時間為10-12小時/ 天，培養(yǎng)21天。
[0018] 優(yōu)選的是，所述的通城虎莖段的繁殖方法中，所述步驟（6)中煉苗的具體過程為： 將帶根的試管苗連同培養(yǎng)瓶移出培養(yǎng)室，轉(zhuǎn)入大棚，在溫度為25-27°C的條件下放置7天， 然后打開瓶蓋，在瓶中加入自來水，煉苗3-4天。
[0019] 優(yōu)選的是，所述的通城虎莖段的繁殖方法中，所述步驟（6)中，移栽后的培養(yǎng)過 程具體為：移栽后7-10天使用塑料薄膜保濕，塑料薄膜上面再覆蓋一層報紙，遮光率為 60% -70%，空氣濕度為85% -90%，每天噴霧1次。
[0020] 本發(fā)明通過生物技術(shù)對通城虎進行組織培養(yǎng)快速繁殖，不受季節(jié)、時間的限制，在 短時間內(nèi)培育出大量可供移栽的通城虎幼苗，顯著提高了通城虎種苗的繁殖系數(shù)和種苗質(zhì) 量，實現(xiàn)了通城虎種源的延續(xù)。同時，本發(fā)明采用以芽生芽的莖段培養(yǎng)方式，誘導(dǎo)時間短，發(fā) 生過程簡單，能較好的保持母本的生物學(xué)性狀，能夠確保通城虎的藥用價值。

【具體實施方式】
[0021] 下面對本發(fā)明做進一步的詳細說明，以令本領(lǐng)域技術(shù)人員參照說明書文字能夠據(jù) 以實施。
[0022] -種通城虎莖段的繁殖方法，包括以下步驟：
[0023] (1)外植體的選擇：取通城虎帶頂芽的嫩莖段或靠近頂芽的帶節(jié)嫩莖段，摘除多 余葉片，用毛細刷在流水下輕輕刷洗外植體表面，然后剪成2_4cm的帶頂芽的嫩莖段以及 帶一個腋芽的嫩莖段，最佳為3cm。
[0024] (2)外植體的消毒：將步驟（1)的嫩莖段依次用質(zhì)量濃度為1 %洗潔精水溶液浸 泡5-10min，自來水沖洗15-30min，無菌水潤洗一次，然后用體積濃度為75%的酒精浸泡 30-50s，再用添加了 2-3滴吐溫-20的150毫升質(zhì)量濃度為0. 1 %升汞消毒7min，無菌水沖 洗3-5次，最后攤開在消毒濾紙上以除去表面水分，得到無菌外植體。
[0025] (3)無菌芽誘導(dǎo)：將步驟⑵得到的帶頂芽或帶節(jié)的嫩莖段去頭去尾后切下 1. Ocm-2. 0cm接種到MS培養(yǎng)基中，培養(yǎng)溫度為24-26°C，光照強度15001ux，光照時間為 10-12小時/天，培養(yǎng)30天，外植體萌發(fā)后獲得無菌試管苗，其中MS培養(yǎng)基中1. 5mg/L6-芐 氨基腺嘌呤（6-芐氨基腺嘌呤簡稱6-BA)、4. 5g/L的瓊脂和25g/L蔗糖，培養(yǎng)基的pH值為 5. 8〇
[0026] (4)試管苗叢生芽繼代增殖培養(yǎng)：將步驟（3)中得到的無菌試管苗置于MS增殖培 養(yǎng)基中，溫度24-26°C，光照強度20001UX，光照時間為10-12小時/天，培養(yǎng)30天得到試管 苗叢生芽，其中MS增殖培養(yǎng)基中添加了 0. 5mg/L激動素（激動素簡稱KT)、0. 2mg/L6-BA、 0. 2mg/L吲哚丁酸（吲哚丁酸簡稱IBA)、4. 5g/L的瓊脂和25g/L蔗糖，培養(yǎng)基的pH值為 5. 8, KT與6-BA促進分裂，IBA促進生長。
[0027] (5)壯苗培養(yǎng)：將步驟（4)中得到的試管苗叢生芽置于MS壯苗培養(yǎng)基中，在培養(yǎng) 溫度24-26°C，光照強度20001UX，光照時間為10-12小時/天的條件下培養(yǎng)21天得到健 壯試管苗，其中MS壯苗培養(yǎng)基中含0. 5g/L的粉狀活性炭、0. 2mg/L的6-BA、0. 4mg/L IBA、 4. 5g/L的瓊脂和25g/L蔗糖，培養(yǎng)基的pH值為5. 8。6-BA與IBA結(jié)合能有利促進通城虎試 管苗生長，隨著IBA濃度的增加，效果越好，但濃度過高則容易長愈傷組織，以0. 4mg/LIBA 為宜。
[0028] (6)生根培養(yǎng)：將步驟（5)中得到的健壯試管苗置于1/2MS生根培養(yǎng)基中（1/2MS 將MS的大量元素減半其他不變而配置的培養(yǎng)基），培養(yǎng)溫度24-26°C，光照強度20001UX，光 照時間為10-12小時/天，培養(yǎng)21天得到帶根的完整試管苗，其中1/2MS生根培養(yǎng)基中含 〇· 3g/L的粉狀活性炭、0· 5mg/L的IBA，0. 6mg/L萘乙酸（萘乙酸簡稱NAA)、4· 5g/L的瓊脂 和25g/L蔗糖，培養(yǎng)基的pH值為5. 8, IBA與NAA結(jié)合能有效誘導(dǎo)通城虎試管苗生根。
[0029] (7)煉苗與移栽：待步驟（6)獲得的帶2-4cm根長的完整植株后，將已生根的苗 連同培養(yǎng)瓶移出培養(yǎng)室，轉(zhuǎn)入大棚，溫度為25-27°C，放置7天，然后打開瓶蓋，在瓶中加 入自來水，煉苗3-4天，取出，洗凈根部培養(yǎng)基，移栽到由腐殖土和蛭石、椰糠（體積比為 3 : 1 : 1)混合組成的基質(zhì)中，移栽后7-10天用塑料薄膜保濕，上面再覆蓋一層報紙，遮光 率為60% -70%最為適宜，空氣濕度85% -90%，每天噴霧1次。
[0030] 本發(fā)明通過生物技術(shù)對通城虎進行組織培養(yǎng)快速繁殖，不受季節(jié)、時間的限制，在 短時間內(nèi)培育出大量可供移栽的通城虎幼苗，顯著提高了通城虎種苗的繁殖系數(shù)和種苗質(zhì) 量，實現(xiàn)了通城虎種源的延續(xù)。同時，本發(fā)明采用以芽生芽的莖段培養(yǎng)方式，誘導(dǎo)時間短，發(fā) 生過程簡單，能較好的保持母本的生物學(xué)性狀，能夠確保通城虎的藥用價值。
[0031] 盡管本發(fā)明的實施方案已公開如上，但其并不僅僅限于說明書和實施方式中所列 運用，它完全可以被適用于各種適合本發(fā)明的領(lǐng)域，對于熟悉本領(lǐng)域的人員而言，可容易地 實現(xiàn)另外的修改，因此在不背離權(quán)利要求及等同范圍所限定的一般概念下，本發(fā)明并不限 于特定的細節(jié)。
【權(quán)利要求】
1. 一種通城虎莖段的繁殖方法，其特征在于，包括： 步驟（1)、制作通城虎外植體； 步驟（2)、利用誘導(dǎo)培養(yǎng)基培養(yǎng)外植體，待外植體萌發(fā)后獲得試管苗，誘導(dǎo)培養(yǎng)基中含 0· 5-2. Omg/L的6-芐氨基腺嘌呤； 步驟（3)、利用增殖培養(yǎng)基培養(yǎng)試管苗，得到試管苗叢生芽，增殖培養(yǎng)基中含 0· 5-1. Omg/L的激動素、0-0· 2mg/L的6-芐氨基腺嘌呤、0-0· 2mg/L的吲哚丁酸； 步驟（4)、利用壯苗培養(yǎng)基培養(yǎng)試管苗叢生芽，得到健壯試管苗，壯苗培養(yǎng)基中含 0· 2mg/L的6-芐氨基腺嘌呤、0· 3-0. 5mg/L的吲哚丁酸； 步驟（5)、利用生根培養(yǎng)基培養(yǎng)健壯試管苗，得到帶根的試管苗，試管苗根長2-4cm，生 根培養(yǎng)基中含〇. 5mg/L的吲哚丁酸和0-1. Omg/L的萘乙酸； 步驟￠)、煉苗，移栽至基質(zhì)中培養(yǎng)。
2. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟⑵中，誘導(dǎo)培養(yǎng)基中含1. 5mg/L 的6-芐氨基腺嘌呤；所述步驟⑶中，增殖培養(yǎng)基中含0. 5mg/L的激動素、0. 2mg/L的6-芐 氨基腺嘌呤、〇. 2mg/L的吲哚丁酸；所述步驟（4)中，壯苗培養(yǎng)基中含0. 2mg/L的6-芐氨 基腺嘌呤、〇. 5mg/L的吲哚丁酸；所述步驟（5)中，生根培養(yǎng)基中含0. 5mg/L的吲哚丁酸和 0· 6mg/L的萘乙酸。
3. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟（6)中，基質(zhì)由腐殖土、蛭石和椰糠 按照體積比3:1:1混合組成。
4. 如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，誘導(dǎo)培養(yǎng)基、增殖培養(yǎng)基和壯苗培養(yǎng)基均采 用MS培養(yǎng)基，生根培養(yǎng)基采用1/2MS培養(yǎng)基，誘導(dǎo)培養(yǎng)基、增殖培養(yǎng)基、壯苗培養(yǎng)基和生根 培養(yǎng)基均含有4. 5g/L的瓊脂和25g/L蔗糖，pH值均為5. 8。
5. 如權(quán)利要求1至4中任一項所述的方法，其特征在于，所述步驟（1)中，選取通城虎 植株上帶頂芽的嫩莖段或帶一個腋芽的嫩莖段作為外植體。
6. 如權(quán)利要求1至4中任一項所述的方法，其特征在于，所述步驟⑴中，對外植體進 行消毒，具體消毒的過程為：用體積濃度為1%的洗潔精水溶液浸泡5-10min,自來水沖洗 15-30min，無菌水潤洗一次，然后用體積濃度為75%的酒精浸泡30-50s，再用添加了 2-3滴 吐溫-20的質(zhì)量濃度為0. 1 %的升汞溶液消毒6-8min，最后用無菌水沖洗3-5次。
7. 如權(quán)利要求1至4中任一項所述的方法，其特征在于，所述步驟（2)中，培養(yǎng)溫度為 24-26°C，光照強度為15001ux，光照時間為10-12小時/天，培養(yǎng)30天；所述步驟（3)中， 培養(yǎng)溫度為24-26°C，光照強度為20001u X，光照時間為10-12小時/天，培養(yǎng)30天；所述步 驟⑷中，培養(yǎng)溫度為24-26°C，光照強度為20001ux，光照時間為10-12小時/天，培養(yǎng)21 天；所述步驟（5)中，培養(yǎng)溫度為24-26°C，光照強度為20001UX，光照時間為10-12小時/ 天，培養(yǎng)21天。
8. 如權(quán)利要求1至4中任一項所述的方法，其特征在于，所述步驟（6)中煉苗的具體過 程為：將帶根的試管苗連同培養(yǎng)瓶移出培養(yǎng)室，轉(zhuǎn)入大棚，在溫度為25-27°C的條件下放置 7天，然后打開瓶蓋，在瓶中加入自來水，煉苗3-4天。
9. 如權(quán)利要求1至4中任一項所述的方法，其特征在于，所述步驟（6)中，移栽后的培 養(yǎng)過程具體為：移栽后7-10天使用塑料薄膜保濕，塑料薄膜上面再覆蓋一層報紙，遮光率 為60% -70%，空氣濕度為85% -90%，每天噴霧1次。
【文檔編號】A01H4/00GK104145813SQ201410322814
【公開日】2014年11月19日 申請日期:2014年7月8日 優(yōu)先權(quán)日:2014年7月8日
【發(fā)明者】潘麗梅, 陳乾平, 谷筱玉, 白隆華, 莫長明, 曾雯雯, 龍海榮, 黃芩芬 申請人:廣西壯族自治區(qū)藥用植物園