一種延長水稻生育期的育種方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種延長水稻生育期的育種方法，包含以下步驟：在水稻生育期決定基因Ehd3外顯子區(qū)選取靶標片段并構(gòu)建植物CRISPR/Cas9打靶重組載體，導入水稻細胞并再生成苗；利用載體中的表達框?qū)崿F(xiàn)對水稻細胞中Ehd3外顯子區(qū)DNA的剪切，從而引起水稻細胞的自我修復；通過對再生株系基因組目標片段的測序，獲取攜帶兩個等位Ehd3基因同時發(fā)生功能缺失突變的株系，經(jīng)過表型鑒定，確認再生植株生育期的延長。實驗表明，本方法可快速獲得生育期延長的水稻材料。
【專利說明】一種延長水稻生育期的育種方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于水稻生物技術(shù)育種領(lǐng)域，具體涉及一種延長水稻生育期的育種方法?！颈尘凹夹g(shù)】
[0002]水稻是我國的第一大糧食作物，目前水稻種植面積為3000萬hm2左右，其中雜交水稻種植面積占總水稻面積的57%，雜交稻制(繁)種面積18萬hm2左右。雜交稻種子質(zhì)量的優(yōu)劣是實現(xiàn)水稻優(yōu)質(zhì)、高產(chǎn)和高效生產(chǎn)的基礎(chǔ)，雜交稻種子生產(chǎn)水平高低直接關(guān)系到我國糧食安全。
[0003]雜交水稻種子生產(chǎn)為水稻的異交栽培，即利用雜交稻雄性不育系作母本，雄性不育恢復系作父本，按照一定的行比相間種植，使雙親能夠花期相遇，不育系接受恢復系的花粉而授精結(jié)實作為雜交種子應用于生產(chǎn)。同時為了保證下年的雜交種子生產(chǎn)，還要利用雜交稻雄性不育系作母本，雄性不育保持系作父本，按照一定的行比相間種植，使其花期相遇，不育系接受保持系的花粉而授精結(jié)實作為雄性不育系種子繁殖應用于下年制種。
[0004]目前我國的雜交水稻制種技術(shù)與研制初期并沒有根本的改進，雜交稻制種程序復雜而嚴格，仍然采用不育系和恢復系差期播種和移栽、人工趕粉、分別仔細收獲等，才能防止機械混雜,勞動強度大，因此,雜交稻制種效率不高。并且雜交稻制種產(chǎn)量受技術(shù)人員的經(jīng)驗豐富與否及氣候條件好壞影響極大，因此，制種效益也不穩(wěn)定。由于目前我國農(nóng)村勞動力結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化，青壯年外出務工，婦女與老年勞力在家務農(nóng)。因此，積極發(fā)展雜交稻機械化制種技術(shù)，實現(xiàn)雜交稻制種規(guī)?；?，是提高我國雜交稻制種效益的必由之路。
[0005]不育系和恢復系和生育期一致是實現(xiàn)機械化混播制種的關(guān)鍵。但目前目前絕大多數(shù)強優(yōu)雜交稻組合父母本生育期不一致，主要表現(xiàn)在不育系的生育期短于恢復系，嚴重的制約了雜交水稻制種的機械化進程。因此，發(fā)展可快速定向延長現(xiàn)有水稻不育系生育期的育種方法，對雜交水稻機械化混播制種的推進將有重要意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明提供了一種延長水稻生育期的育種方法，其特征在于，所述方法包括如下步驟:
[0007]步驟1，在水稻生育期決定基因Ehd3(L0C_0s08g01420)外顯子區(qū)選取靶標片段，所述祀標片段的雙鏈結(jié)構(gòu)中的一條鏈具有5 ’ - (N) X-NGG_3 ’結(jié)構(gòu)，(N)x代表數(shù)目為X的一段堿基序列(N1, N2……Nx}，X代表堿基的數(shù)量，N1, N2……Nx中的每一個表示A、G、C、T中的任意一個，NGG中的N也表不A、T、G、C中的一種；
[0008]步驟2，利用所述靶標片段，構(gòu)建用于水稻Ehd3基因打靶的CRISPR/Cas9重組載體，其中所述重組載體中包含具有所述靶標片段的向?qū)NA表達框和Cas9核酸酶表達框；
[0009]步驟3，將步驟2所獲 的所述重組載體導入水稻細胞，誘導所述向?qū)NA表達框和所述Cas9核酸酶表達框在水稻細胞中共同表達；
[0010]步驟4，剪切Ehd3基因的雙鏈靶標片段，再通過水稻細胞自身的DNA修復功能，在靶標位點隨機插入或缺失堿基，實現(xiàn)細胞內(nèi)Ehd3基因的功能缺失突變；
[0011]步驟5，用導入所述重組載體的水稻細胞再生水稻植株；
[0012]步驟6，對再生的水稻植株中Ehd3基因包含靶標片段的DNA區(qū)段測序；
[0013]步驟7，選擇兩個等位Ehd3基因都出現(xiàn)功能缺失突變的再生株系，進行表型鑒定，觀察再生株系子代的生育期，挑取生育期顯著推遲的株系，作為所創(chuàng)制的生育期推遲的水稻材料。
[0014]優(yōu)選地，X為19或20。
[0015]優(yōu)選地，所述向?qū)NA表達框和所述Cas9核酸酶表達框均能夠在水稻細胞中表達。
[0016]優(yōu)選地，所述向?qū)NA表達框的核苷酸序列如Seq ID N0.1所示；所述Cas9核酸酶表達框的核苷酸序列如Seq ID N0.2所示。
[0017]優(yōu)選地，所述向?qū)NA表達框包括:水稻U6啟動子，其核苷酸序列如Seq ID N0.1第I至246位所示；結(jié)構(gòu)特征為(N)X的靶標序列和人工合成的SgRNA骨架序列，其核苷酸序列如Seq IDN0.1第267至350位所示；以及Poly-T終止子，其核苷酸序列如Seq IDN0.1第351至358位所示。
[0018]優(yōu)選地，所述Cas9核酸酶表達框包括:玉米ZmUBI啟動子，其核苷酸序列如Seq IDN0.2第I至2031位所示；植物偏好密碼子改造后的Cas9編碼序列，其核苷酸序列如SeqID N0.2第2034至6305位所示；以及tNOS終止子，其核苷酸序列如Seq ID N0.2第6347至6599位所示。
[0019]在所述Ehd3基因外顯子上，具有所述(N)X-NGG_3’結(jié)構(gòu)的片段可選為靶標的共有75個。
[0020]構(gòu)建用于水稻Ehd3基因打靶的CRISPR/Cas9重組載體是按照靶標序列的核酸排列順序進行的，其中所述重組載體中包括CRISPR RNA(CrRNA)序列，其為所述靶標區(qū)段5，-(N)x-NGG-3，中的(N)x或與之互補的序列。
[0021]所述Cas9核酸酶表達框與向?qū)NA表達框位于同一載體中。
[0022]在所述步驟3中，將步驟2所獲重組載體導入水稻細胞，從而使細胞同時含有向?qū)NA表達框和Cas9核酸酶表達框；在向?qū)NA和Cas9核酸酶的共同作用下，能夠?qū)hd3基因的雙鏈的所述靶標片段進行剪切，再通過水稻細胞自身的DNA修復功能，最終實現(xiàn)細胞內(nèi)Ehd3基因靶標片段的隨機插入和/或隨機缺失。
[0023]所述方法中，將重組載體導入水稻細胞所采用的方法為PEG介導的水稻原生質(zhì)體瞬時轉(zhuǎn)化或農(nóng)桿菌介導的水稻愈傷組織穩(wěn)定轉(zhuǎn)化。這兩種方法最適合用于本發(fā)明的育種方法，尤其是如者。
[0024]在步驟4中，再生植物的方法為細胞或組織經(jīng)過組織培養(yǎng)，獲得植株。
[0025]在步驟5中，還可以通過基因組PCR方法克隆再生植株中Ehd3基因包含靶標片段的DNA區(qū)段，并對擴增產(chǎn)物測序。所述基因組PCR方法為，針對包含靶標片段的基因組區(qū)域，設(shè)計位點特異性引物，以再生植株的基因組DNA為模板，擴增所述包含靶標片段的基因組區(qū)域。擴增產(chǎn)物測序是指，對PCR產(chǎn)物中的目的條帶測序。
[0026]在步驟6中，兩個等位Ehd3基因都出現(xiàn)功能缺失突變是指測序結(jié)果在Ehd3基因靶標位點出現(xiàn)兩種功能缺失突變序列，且沒有出現(xiàn)野生型序列；其中所述功能缺失突變序列指的是正常Ehd3編碼序列在靶標位點出現(xiàn)終止子或閱讀框移位。
[0027]在步驟7中，觀察再生株系及自交子代的生育期，挑取生育期推遲2周以上的株系，該材料即為所改良的生育期延長的水稻材料。
[0028]在一種實現(xiàn)方式中，所采用的向?qū)NA表達框具體為(Seq ID N0.1):ggatcatgaaccaacggcctggctgtatttggtggttgtgtagggagatggggagaagaaaagcccgattctcttcgctgtgatgggctggatgcatgcgggggagcgggaggcccaagtacgtgcacggtgagcggcccacagggcgagtgtgagcgcgagaggcgggaggaacagtttagtaccacattgcccagctaactcgaacgcgaccaacttataaacccgcgcgctgtcgcttgtgtgGCCCCCCACCACCGCGCAAGgttttagagctatgctgaaaagcatagcaagttaaaataaggctagtccgttatcaacttgaaaaagtggcaccgagtcggtgctttttttt
[0029]在一種實現(xiàn)方式中，所采用的Cas9核酸酶表達框具體為(Seq ID N0.2):ctgcagtgcagcgtgacccggtcgtgcccctctctagagataatgagcattgcatgtctaagttataaaaaattaccacatattttttttgtcacacttgtttgaagtgcagtttatctatctttatacatatatttaaactttactctacgaataatataatctatagtactacaataatatcagtgttttagagaatcatataaatgaacagttagacatggtctaaaggacaattgagtattttgacaacaggactctacagttttatctttttagtgtgcatgtgttctcctttttttttgcaaatagcttcacctatataatacttcatccattttattagtacatccatttagggtttagggttaatggtttttatagactaatttttttagtacatctattttattctattttagcctctaaattaagaaaactaaaactctattttagtttttttatttaataatttagatataaaatagaataaaataaagtgactaaaaattaaacaaataccctttaagaaattaaaaaaactaaggaaacatttttcttgtttcgagtagataatgccagcctgttaaacgccgtcgacgagtctaacggacaccaaccagcgaaccagcagcgtcgcgtcgggccaagcgaagcagacggcacggcatctctgtcgctgcctctggacccctctcgagagttccgctccaccgttggacttgetccgctgtcggcatccagaaatgcgtggcggagcggcagacgtgagccggcacggcaggcggcctcctcctcctctcacggcacggcagctacgggggattcctttcccaccgctccttcgctttcccttcctcgcccgccgtaataaatagacaccccctccacaccctctttccccaacctcgtgttgttcggagcgcacacacacacaaccagatctcccccaaatccacccgtcggcacctccgcttcaaggtacgccgctcgtcctccccccccccccctctctaccttctctagatcggcgttccggtccatggttagggcccggtagttctacttctgttcatgtttgtgttagatccgtgtttgtgttagatccgtgctgctagcgttcgtacacggatgcgacctgtacgtcagacacgttctgattgctaacttgccagtgtttctctttggggaatcctgggatggctctagccgttccgcagacgggatcgatttcatgattttttttgtttcgttgcatagggtttggtttgcccttttcctttatttcaatatatgccgtgcacttgtttgtcgggtcatcttttcatgcttttttttgtcttggttgtgatgatgtggtctggttgggcggtcgttctagatcggagtagaattctgtttcaaactacctggtggatttattaattttggatctgtatgtgtgtgccatacatattcatagttacgaattgaagatgatggatggaaatatcgatctaggataggtatacatgttgatgcgggttttactgatgcatatacagagatgctttttgttcgcttggttgtgatgatgtggtgtggttgggcggtcgttcattcgttctagatcggagtagaatactgtttcaaactacctggtgtatttattaattttggaactgtatgtgtgtgtcatacatcttcatagttacgagtttaagatggatggaaatatcgatctaggataggtatacatgttgatgtgggttttactgatgcatatacatgatggcatatgcagcatctattcatatgctctaaccttgagtacctatctattataataaacaagtatgttttataattattttgatcttgatatacttggatgatggcatatgcagcagctatatgtggatttttttagccctgccttcatacgctatttatttgcttggtactgtttcttttgtcgatgctcaccctgttgtttggtgttacttctgcagcccgggggatccccaatacttgtatggccgcggccgctctagatggattacaaggaccacgacggggattacaaggaccacgacattgattacaaggatgatgatgacaagatggctccgaagaagaagaggaaggttggcatccacggggtgccagctgctgacaagaagtactcgatcggcctcgatattgggactaactctgttggctgggccgtgatcaccgacgagtacaaggtgccctcaaag
【權(quán)利要求】
1.一種延長水稻生育期的育種方法，其特征在于，所述方法包括如下步驟: 步驟I，在水稻生育期決定基因Ehd3外顯子區(qū)選取靶標片段，所述靶標片段的雙鏈結(jié)構(gòu)的一條鏈具有5，- (N) x-NGG-3，結(jié)構(gòu)，(N) x代表數(shù)目為X的一段堿基序列(N1, N2……Nj,X代表堿基的數(shù)量，N1, N2……Nx中的每一個表示A、G、C、T中的任意一個，NGG中的N也表示A、T、G、C中的一種； 步驟2，利用所述靶標片段，構(gòu)建用于水稻Ehd3基因打靶的CRISPR/Cas9重組載體，其中所述重組載體中包含具有所述靶標片段的向?qū)NA表達框，以及Cas9核酸酶表達框； 步驟3，將所述重組載體導入水稻細胞，誘導所述向?qū)NA表達框和所述Cas9核酸酶表達框在水稻細胞中共同表達； 步驟4，剪切Ehd3基因的雙鏈靶標片段，誘發(fā)水稻細胞自身的DNA修復功能，在靶標位點隨機插入或缺失堿基，實現(xiàn)細胞內(nèi)Ehd3基因的功能缺失突變； 步驟5，用導入所述重組載體的水稻細胞再生水稻植株； 步驟6，對再生植株中Ehd3基因包含靶標片段的DNA區(qū)段測序。 步驟7，選擇兩個等位Ehd3基因都出現(xiàn)功能缺失突變的再生株系，進行表型鑒定，觀察再生株系子代的生育期，挑取生育期推遲超過預定時間段的株系，作為所創(chuàng)制的生育期推遲的水稻材料。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的育種方法，其特征在于，X為19或20。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的育種方法，其特征在于，所述向?qū)NA表達框和所述Cas9核酸酶表達框均能夠在水稻細胞中表達。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的育種方法，其特征在于，所述向?qū)NA表達框的核苷酸序列如Seq ID N0.1所示；所述Cas9核酸酶表達框的核苷酸序列如Seq ID N0.2所示。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的育種方法，其特征在于， 所述向?qū)NA表達框包括:水稻U6啟動子，其核苷酸序列如Seq ID N0.1第I至246位所示；結(jié)構(gòu)特征為(N)x的靶標序列和人工合成的SgRNA骨架序列，其核苷酸序列如Seq IDN0.1第267至350位所示；以及Poly-T終止子，其核苷酸序列如Seq ID N0.1第351至358位所示。
6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的育種方法，其特征在于， 所述Cas9核酸酶表達框包括:玉米ZmUBI啟動子，其核苷酸序列如Seq ID N0.2第I至2031位所示；植物偏好密碼子改造后的Cas9編碼序列，其核苷酸序列如Seq ID N0.2第2034至6305位所示；以及tNOS終止子，其核苷酸序列如Seq ID N0.2第6347至6599位所/Jn ο
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的育種方法，其特征在于，在所述步驟7中，挑取子代生育期推遲超過兩周的株系作為所創(chuàng)制的生育期推遲的水稻材料。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的育種方法，其特征在于，所述步驟7還包括對所得植株進行自交，觀察再生株系子代的生育期。
【文檔編號】A01H5/00GK104004782SQ201410209121
【公開日】2014年8月27日 申請日期:2014年5月16日 優(yōu)先權(quán)日:2014年5月16日
【發(fā)明者】秦瑞英, 楊劍波, 魏鵬程, 李莉, 馬卉, 李 浩, 楊亞春, 倪金龍, 倪大虎, 宋豐順, 陸徐忠 申請人:安徽省農(nóng)業(yè)科學院水稻研究所