一種南通小方柿組培快繁方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種南通小方柿組培快繁方法，屬于農(nóng)作物快繁【技術(shù)領(lǐng)域】。研究了休眠芽消毒方法，確定了適于小方柿早期和中期繼代增殖的培養(yǎng)基成分，分析了不同細(xì)胞分裂素、生長(zhǎng)素對(duì)組培苗生長(zhǎng)的影響。將取自南通小方柿一年生枝條上的休眠芽剝掉外層鱗片，用流水沖洗2小時(shí)后分別用75%酒精、10%雙氧水消毒，將消毒處理好的休眠芽接種于基本培養(yǎng)基中，待萌發(fā)后轉(zhuǎn)接到繼代增殖培養(yǎng)基上。本方法基本解決了南通小方柿初代褐化嚴(yán)重的問(wèn)題，初代成活率達(dá)到80%。通過(guò)添加適量赤霉素解決了南通小方柿繼代增殖問(wèn)題。促進(jìn)了矮生型柿品種南通小方柿的快速繁育和生產(chǎn)推廣工作。
【專利說(shuō)明】一種南通小方柿組培快繁方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于組織培養(yǎng)領(lǐng)域，涉及一種南通小方柿組培快繁方法。
【背景技術(shù)】
[0002]柿樹(Diospyroskaki L.f.)屬柿科(Ebenaceae)、柿屬(Diospyros)),柿果實(shí)含有大量脂肪、蛋白質(zhì)、糖類等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，以及鈣、磷、鐵等礦質(zhì)元素和多種維生素營(yíng)養(yǎng)豐富，既可鮮食，又可加工成柿餅、柿子醋、柿子果酒等；柿葉可做茶，柿漆可供油傘用。同時(shí)柿樹樹姿優(yōu)美，葉、果色澤艷麗，是一種良好的觀賞樹種。
[0003]柿樹為高大落葉喬木，通常樹高7-9米。長(zhǎng)期以來(lái)，許多果樹工作者努力尋求具有矮化基因的柿樹種質(zhì)資源，矮生型柿品種一一南通小方柿是我國(guó)珍貴的柿樹種質(zhì)資源，該品種樹體矮小，早果性好，且豐產(chǎn)穩(wěn)定，果實(shí)色艷、無(wú)核、質(zhì)優(yōu)，能自然脫澀，是矮化密植栽培的優(yōu)良柿品種。將對(duì)我國(guó)今后柿樹的栽培、育種及其發(fā)展產(chǎn)生深遠(yuǎn)的影想。但是傳統(tǒng)柿樹繁殖技術(shù)較難移栽，成活率和嫁接后存活率均較低。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的是針對(duì)傳統(tǒng)柿樹繁殖技術(shù)較難移栽成活率和嫁接后存活率低，提供一種南通小方柿組培快繁方法。
[0005]一種南通小方柿 的組培培快繁方法，包括以下步驟:
[0006](I)消毒處理
[0007]取南通小方柿一年生枝條上的休眠芽，剝?nèi)ネ饷?-3片鱗片，在流水下沖洗2小時(shí)；將休眠芽轉(zhuǎn)放到超凈工作臺(tái)上，用75%酒精表面殺菌30s (秒)后無(wú)菌水沖洗3遍；之后將休眠芽放入10%雙氧水中浸泡20min (分鐘),浸泡期間須不?；蝿?dòng)使雙氧水產(chǎn)生大量氣泡，最后用無(wú)菌水沖洗3次，放到墊有無(wú)菌吸水紙的培養(yǎng)皿里；
[0008]將經(jīng)過(guò)消毒的休眠芽接種于含有500mg/L PVP(聚乙烯毗咯烷酮)不添加生長(zhǎng)素和細(xì)胞分裂素的MS培養(yǎng)基上培養(yǎng)；
[0009](2)繼代增殖培養(yǎng)
[0010]南通小方柿在MS培養(yǎng)基上萌動(dòng)生長(zhǎng)的休眠芽接種于MS(1/2N)培養(yǎng)基中，添加的細(xì)胞分裂素為ZT2mg/L,繼代培養(yǎng)2-3代后玉米素濃度減少至lmg/L ;細(xì)胞生長(zhǎng)素為NAA0.05mg/L ；PVP500mg/L ;蔗糖 30g/L ;瓊脂 6.0g/L ；
[0011]組培苗繼代培養(yǎng)4-5代后(苗長(zhǎng)勢(shì)健壯，高度約Icm左右)用(1/2N)MS+ZT1.0mg/L+IAA0.05-0.3mg/L+GA30.05mg/L+PVP500mg/L+ 蔗糖 30g/L+ 瓊脂 6.0g/L 和(1/2N)MS+ZT1.0mg/L+IAA0.05-0.3mg/L+PVP500mg/L+ 蔗糖 30g/L+ 瓊脂 6.0g/L 培養(yǎng)基交替培養(yǎng)，將前一代培養(yǎng)的組培苗腋芽切下插入培養(yǎng)基進(jìn)行增殖擴(kuò)繁，每種培養(yǎng)基繼代增殖培養(yǎng)25-30天左右。
[0012]有益效果
[0013]本發(fā)明針對(duì)柿樹傳統(tǒng)的繁殖方法是砧木嫁接移栽成活率和嫁接后存活率都較其他果樹低，在前人研究的基礎(chǔ)上，首次建立了矮生型樹品種南通小方柿的組培快繁技術(shù)。
[0014]本方法基本解決了南通小方柿初代褐化嚴(yán)重的問(wèn)題，初代成活率達(dá)到80%。通過(guò)添加適量赤霉素以及篩選特定的基礎(chǔ)培養(yǎng)基與不同種類、濃度的細(xì)胞分裂素、生長(zhǎng)素，解決了南通小方柿繼代增殖問(wèn)題。促進(jìn)了矮生型柿品種南通小方柿的快速繁育和生產(chǎn)推廣工作。南通小方柿快繁技術(shù)的研究，為快速獲得大量苗木提供可能，促進(jìn)了矮生型柿樹種產(chǎn)業(yè)在我國(guó)的推廣和快速發(fā)展。同時(shí)，小方柿柿組培苗再生體系的建立為生理研究及分子方面研究其矮化機(jī)理性狀等奠定了基礎(chǔ)。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0015]圖1:不同消毒劑對(duì)休眠芽培養(yǎng)的影響
[0016]圖2:南通小方柿組培苗圖片
【具體實(shí)施方式】
[0017]I外植體最佳消毒方法確定的材料和方法
[0018]南通小方柿休眠芽從一年生枝條上切下剝?nèi)パ康耐獠?-3片鱗片，在肥皂水中洗滌芽段2-3遍，流水沖洗2小時(shí)后在超凈臺(tái)上進(jìn)行消毒處理。
[0019]消毒時(shí)間及步驟 為:用75%酒精表面滅菌30s，分別按以下三種方法進(jìn)行后續(xù)消毒:(1)在含有10% H2O2溶液中分別浸泡10min、20min，浸泡過(guò)程中要不時(shí)搖動(dòng)，使雙氧水分解產(chǎn)生大量氧氣起到殺菌作用。最后用無(wú)菌水沖洗5次；(2)在含有0.1%吐溫一 80的5% NaCIO(安替福民)溶液中浸泡lOmin，浸泡過(guò)程中要不時(shí)搖動(dòng)，最后用無(wú)菌水沖洗5次；(3)在含有0.1 %吐溫一 80的0.1 % HgC1:(升汞)溶液中浸泡IOmin,浸泡過(guò)程中要不時(shí)搖動(dòng)，最后用無(wú)菌水沖洗5次。將經(jīng)過(guò)不同方法消毒的休眠芽接種于含有500mg/LPVP (聚乙烯毗咯烷酮)不添加生長(zhǎng)素和細(xì)胞分裂素的MS培養(yǎng)基上，每個(gè)處理60瓶，2周后統(tǒng)計(jì)成活率。
[0020]如圖1，用次氯酸鈉和升汞消毒的休眠芽雖然消毒效果好污染率低但是褐化嚴(yán)重成活率低，分別為54%、40%。雙氧水對(duì)休眠芽進(jìn)行消毒10min、20min的成活率分別是68%和80%，外植體無(wú)褐化現(xiàn)象，成活率高。同時(shí)消毒時(shí)雙氧水分解產(chǎn)生的活性氧對(duì)小方柿休眠芽的萌發(fā)、生長(zhǎng)有促進(jìn)作用。所以小方柿休眠芽接種前處理時(shí)采用酒精表面滅菌30s，雙氧水浸泡消毒20min (需不?；蝿?dòng))，最后用無(wú)菌水沖洗5次的方法成活率高，且有效解決了休眠芽初代褐化死亡的問(wèn)題。
[0021]2.最佳繼代增殖培方法的確定
[0022]2.1材料和方法
[0023]試驗(yàn)所用培養(yǎng)基中的蔗糖濃度為3%，瓊脂濃度均為0.6%，PVP(聚乙烯毗咯烷? )0.5%, pH 值為 5.7-5.8 ;培養(yǎng)基經(jīng) 121。。(0.105-0.12MPa)高溫濕熱滅菌 15min，培養(yǎng)條件均為:培養(yǎng)溫度25°C左右，光照時(shí)間16h/d，在光照強(qiáng)度為1500-20001x的白熾燈下培養(yǎng)。每代組培苗均培養(yǎng)25-30天。
[0024]南通小方柿萌動(dòng)生長(zhǎng)的休眠芽接種于接種于I號(hào)繼代培養(yǎng)基中，繼代培養(yǎng)2-3代后改用II號(hào)(玉米素含量減半)繼代培養(yǎng)基培養(yǎng)；所述的I號(hào)繼代培養(yǎng)基配方為MS(1/2N) +玉米素 2mg/L+萘乙酸 0.05mg/L+PVP500mg/L+蔗糖 30g/L+瓊脂 6.0g/L ；II 號(hào)繼代培養(yǎng)基配方為MS(1/2N)+玉米素lmg/L+萘乙酸0.05mg/L+PVP500mg/L+鹿糖30g/L+瓊脂 6.0g/L。
[0025]2.2不同基本培養(yǎng)基對(duì)南通小方柿組培苗增殖影響
[0026]萌動(dòng)生長(zhǎng)的休眠芽在含有ZTl.0mg/L+NAA0.05mg/L的MS(1/2N)培養(yǎng)基上繼代培養(yǎng)2代后的南通小方柿組培苗，分別接種在含有ZTl.0mg/L+NAA0.05mg/L的MS、1/2MS、MS(1/2N)培養(yǎng)基中，比較基本培養(yǎng)基對(duì)南通小方柿組培苗快繁增殖的影響。
[0027]如表1所示，采用改良培養(yǎng)基(1/2N) MS培養(yǎng)的組培苗植株高度與其他兩種培養(yǎng)基培養(yǎng)的存顯著差異，并且長(zhǎng)勢(shì)好，葉片大翠綠，基部愈傷小組織小。1/2MS和MS培養(yǎng)基培養(yǎng)的組培苗高度之間差異不顯著，組培苗基本呈蓮座狀生長(zhǎng)，莖很短，組培苗長(zhǎng)勢(shì)弱，葉片呈黃綠色部分褐化，基部愈傷組織大不利于繼代擴(kuò)繁。說(shuō)明柿子外植體生長(zhǎng)需要較低濃度的礦質(zhì)元素，尤其是較低濃度的氮素。
[0028]表1.不同基本培養(yǎng)基對(duì)南通小方柿組培苗增殖影響
[0029]
【權(quán)利要求】
1.一種南通小方柿的組培培快繁方法，其特征在于: (1)消毒處理 取南通小方柿一年生枝條上的休眠芽，剝?nèi)ネ饷?-3片鱗片，流水沖洗2-3小時(shí)；將休眠芽轉(zhuǎn)放到超凈工作臺(tái)上，用75%酒精表面殺菌30s后無(wú)菌水沖洗3遍；之后將休眠芽放入.10%雙氧水中浸泡20min,浸泡期間須不?；蝿?dòng)使雙氧水產(chǎn)生大量氣泡,最后用無(wú)菌水沖洗.3次，放到墊有無(wú)菌吸水紙的培養(yǎng)皿中； (2)出芽培養(yǎng):將經(jīng)過(guò)消毒的休眠芽接種于含有500mg/LPVP不添加生長(zhǎng)素和細(xì)胞分裂素的MS培養(yǎng)基上培養(yǎng)2周；培養(yǎng)溫度為25~28°C，光照時(shí)間16~18h/d，光照強(qiáng)度為.1500-20001x ； (3)繼代增殖培養(yǎng) 將上一步培養(yǎng)2周的休眠芽接種于I號(hào)繼代培養(yǎng)基中，繼代培養(yǎng)2-3代后改用II號(hào)繼代培養(yǎng)基培養(yǎng)2-3代；所述的I號(hào)繼代培養(yǎng)基配方為MS(1/2N)+玉米素2mg/L+萘乙酸.0.05mg/L+PVP500mg/L+蔗糖30g/L+瓊脂6.0g/L ；II號(hào)繼代培養(yǎng)基配方為MS (1/2N) +玉米素 lmg/L+萘乙酸 0.05mg/L+PVP500mg/L+蔗糖 30g/L+瓊脂 6.0g/L ;培養(yǎng)溫度為 25 ~28°C，光照時(shí)間16~18h/d，光照強(qiáng)度為1500-20001x ;上述每代均培養(yǎng)25-30天。 組培苗繼代培養(yǎng)4-5代后用III號(hào)培養(yǎng)基和IV號(hào)培養(yǎng)基交替培養(yǎng)，交替培養(yǎng)時(shí)將前一代培養(yǎng)的組培苗腋芽切下插入培養(yǎng)基進(jìn)行增殖擴(kuò)繁培養(yǎng)，每種培養(yǎng)基繼代增殖培養(yǎng)25-30天，培養(yǎng)溫度為25~28°C，光照時(shí)間16~18h/d，光照強(qiáng)度為1500_20001x ；III號(hào)培養(yǎng)基配方為(1/2N) MS+ 玉米素 1.0mg/L+ 吲哚-3-乙酸 0.05-0.3mg/L+ 赤霉素 GA30.05mg/L+PVP500mg/L+ 蔗糖 3 0g/L+ 瓊脂 6.0g/L,或(1/2N) MS+ 玉米素 1.0mg/L+IBA0.05mg/L+ 赤霉素 GA30.05mg/L+PVP500mg/L+ 蔗糖 30g/L+ 瓊脂 6.0g/L ；IV 號(hào)培養(yǎng)基配方為(1/2N) MS+玉米素 1.0mg/L+ 吲哚-3-乙酸 0.05-0.3mg/L+PVP500mg/L+ 蔗糖 30g/L+ 瓊脂 6.0g/L,或(1/2N) MS+ 玉米素 1.0mg/L+IBA0.05mg/L+PVP500mg/L+ 蔗糖 30g/L+ 瓊脂 6.0g/L。
【文檔編號(hào)】A01H4/00GK103988776SQ201410124082
【公開日】2014年8月20日 申請(qǐng)日期:2014年3月28日 優(yōu)先權(quán)日:2014年3月28日
【發(fā)明者】渠慎春, 李寧寧, 屠煦童, 蔣振瑩, 章鎮(zhèn) 申請(qǐng)人:南京農(nóng)業(yè)大學(xué)