一種金線蓮組織培養(yǎng)快速增殖方法
【專利摘要】本發(fā)明公開金線蓮組織培養(yǎng)快速增殖方法，對外植體清洗消毒，接入MS培養(yǎng)基，前一周弱光培養(yǎng)，一周后強(qiáng)光培養(yǎng)，光照時間10小時/天，溫度23±2℃，培養(yǎng)40天；接入配比為MS培養(yǎng)基、6-BA1.4-1.6mg/L、NAA0.2-0.3mg/L的液體培養(yǎng)基中增殖培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為暗培養(yǎng)，溫度23±2℃，培養(yǎng)周期45天；壯苗培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基，光照培養(yǎng)，光照時間8小時/天，溫度23±2℃，培養(yǎng)周期12-15天；生根培養(yǎng)基配比：1/2MS、香蕉60g/L、活性炭1g/L、水解酪蛋白0.5g/L，光照時間10小時/天，溫度23±2℃，培養(yǎng)周期3個月。該方法實(shí)現(xiàn)金線蓮工業(yè)化快速繁育，縮短了培養(yǎng)周期。
【專利說明】一種金線蓮組織培養(yǎng)快速增殖方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物【技術(shù)領(lǐng)域】，尤其是指一種金線蓮組織培養(yǎng)快速增殖方法。
【背景技術(shù)】
[0002]金線蓮(Anoectochilusroxburghii (Wall.) Lindl)是蘭科開唇蘭屬的多年生草本植物，具有清熱解毒、祛風(fēng)利濕、滋陰潤肺及降血壓等功效。同時，金線蓮株型小巧美觀，葉形優(yōu)美，葉脈金黃色，呈網(wǎng)狀排列，具有極高的觀賞價值。
[0003]然而，金線蓮種子自然萌發(fā)率和繁殖率低，生長緩慢，加上人為大量采挖及生態(tài)環(huán)境的破壞，野生金線蓮資源日漸枯竭?，F(xiàn)有技術(shù)中，通過組織培養(yǎng)建立無性繁殖系，對金線蓮資源進(jìn)行保護(hù)和合理利用。目前，金線蓮培育主要是固體培養(yǎng)基實(shí)現(xiàn)芽誘導(dǎo)、增殖與壯苗，其缺陷在于:增殖倍率低，培養(yǎng)時間長，成本高，使得金線蓮得不到較快的發(fā)展。
[0004]金線蓮培育的另一種方法為液體培養(yǎng)基培育，液體培養(yǎng)基通過搖床淺層震蕩進(jìn)行金線蓮增殖比固體增殖速度更快。液體培養(yǎng)能讓所有的外植體充分而均勻的吸收養(yǎng)分，同時能夠避免褐化物對培養(yǎng)物生長的影響，有鑒于此，本發(fā)明人研發(fā)出一種金線蓮組織培養(yǎng)快速增殖方法，本案由此產(chǎn)生。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的在于提供一種金線蓮組織培養(yǎng)快速增殖方法，解決金線蓮增殖率低，繁殖周期長及成本高等問題，實(shí)現(xiàn)金線蓮工業(yè)化快速繁育。
[0006]為達(dá)成上述目的，本發(fā)明的解決方案為:
一種金線蓮組織培養(yǎng)快速增殖方法，包括以下步驟:
外植體誘導(dǎo):采取金線蓮植株作為外植體，先對外植體進(jìn)行清洗、消毒，接入不添加激素的MS基本培養(yǎng)基誘導(dǎo)培養(yǎng),前一周弱光培養(yǎng)，光照強(qiáng)度500-800Lux, —周后強(qiáng)光培養(yǎng),光照強(qiáng)度1500-2000Lux，光照時間10小時/天，溫度23±2°C，培養(yǎng)40天；
增殖培養(yǎng):接入液體培養(yǎng)基中進(jìn)液體增殖培養(yǎng)，液體增殖培養(yǎng)基配比:MS培養(yǎng)基、6-BA(6-卞基嘌呤)1.4-1.6 mg/L、NAA (萘乙酸)0.2-0.3 mg/L，培養(yǎng)條件為暗培養(yǎng)，溫度為23±2°C，培養(yǎng)周期45天；
壯苗培養(yǎng):壯苗培養(yǎng)基為無激素液體改良MS培養(yǎng)基，光照培養(yǎng)，光強(qiáng)為1200-1500LUX，光照時間為8小時/天，溫度為23±2 °C，培養(yǎng)周期為12-15天；
生根培養(yǎng):生根培養(yǎng)基配比:1/2MS、香蕉60g/L、活性炭lg/L、水解酪蛋白0.5g/L，光照培養(yǎng)，光照時間10小時/天，光照強(qiáng)度1500-2500 Lux，溫度為23±2 °C，培養(yǎng)周期為3個月。
[0007]所述外植體清洗、消毒的具體步驟為:先用洗衣粉水溶液浸泡5 min (分鐘)，自來水沖洗干凈；置于無菌工作臺中， 75% (體積分?jǐn)?shù))的酒精消毒30s (秒)，無菌水沖洗I次，再用0.1% (質(zhì)量分?jǐn)?shù))的升汞(HgCl2)消毒3min，無菌水沖洗3次，最后用10% (質(zhì)量分?jǐn)?shù))的次氯酸鈉消毒6-8min，無菌水沖洗5次。[0008]所述外植體消毒完成后，吸干水分切成I ±0.1 cm的莖段，然后接入不添加激素的MS基本培養(yǎng)基中進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)，pH5.6-5.8。
[0009]所述增殖培養(yǎng)及壯苗培養(yǎng)均采用液體淺層震蕩培養(yǎng)，采用直徑80cm (厘米)、高IOOcm耐高溫PP組培瓶培養(yǎng)，培養(yǎng)液的量為瓶身的1/6-1/5，接種量為培養(yǎng)液的2/3-3/4，并置于大型工業(yè)搖床上，轉(zhuǎn)速80-100r/min。
[0010]所述增殖培養(yǎng)每隔15天更換一次培養(yǎng)液并分瓶，45天后轉(zhuǎn)入壯苗培養(yǎng)基中。
[0011]采用上述方案后，本發(fā)明的種金線蓮組織培養(yǎng)快速增殖方法解決了增殖倍率低，培養(yǎng)時間長及生產(chǎn)成本高等問題，實(shí)現(xiàn)金線蓮工業(yè)化快速繁育，縮短了培養(yǎng)周期，45天增殖倍率達(dá)25倍?！揪唧w實(shí)施方式】
[0012]運(yùn)用本發(fā)明進(jìn)行金線蓮組織培養(yǎng)的具體實(shí)施例:
一、外植體誘導(dǎo)培養(yǎng)
采取健壯的無病蟲害的金線蓮植株，去除根、根毛、葉片及頂芽，自來水清洗干凈，洗衣粉水浸泡5min，然后自來水沖洗干凈，移至無菌操作臺上。75%的酒精消毒30s，無菌水沖洗I次，0.1%的升汞消毒3min，無菌水沖洗3次，10%的次氯酸鈉消毒6_8min，無菌水沖洗5次，浙干水分，放入無菌的接種盤中備用。將消毒好的莖段在接種臺上剪成Icm左右，含一個莖節(jié)的若干莖段，接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，每瓶接一個莖段。若是采用無菌苗直接接種，則只需要在接種臺上將組培苗去葉，將莖段剪成1±0.1 cm，含一個莖節(jié)的若干莖段，直接接入誘導(dǎo)培養(yǎng)基中進(jìn)行誘導(dǎo)分化培養(yǎng)。培養(yǎng)條件:前一周弱光培養(yǎng)，光照強(qiáng)度500-800Lux(勒克斯)，一周后強(qiáng)光培養(yǎng)，光照強(qiáng)度1500-2000Lux，光照時間IOh/天，溫度為23±2°C，誘導(dǎo)培養(yǎng)基為不添加激素的MS基本培養(yǎng)基，40天誘導(dǎo)出1-2個腋芽。
[0013]二、金線蓮液體增殖培養(yǎng)
金線蓮經(jīng)過誘導(dǎo)階段后，每個莖段帶1-2個腋芽，高度在0.2-0.5 cm,接入液體增殖培養(yǎng)基中，液體增殖培養(yǎng)基的量為瓶身的1/6-1/5，接種量為培養(yǎng)液2/3-3/4為宜。本實(shí)施例中采用直徑80cm，高100 cm耐高溫PP組培瓶培養(yǎng)，接種量為10個帶1_2個腋芽、高
0.5-1.0cm的10個莖段，置于大型工業(yè)搖床上進(jìn)行淺層震蕩培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速80-100 r/min。培養(yǎng)基配比是MS培養(yǎng)基、6-BA1.4-1.6mg/L、NAA 0.2-0.3mg/L,培養(yǎng)條件是暗培養(yǎng)，培養(yǎng)室溫度23±2°C，培養(yǎng)周期45天，每隔15天更換一次培養(yǎng)液并且分瓶，見表1，金線蓮?fù)ㄟ^液體培養(yǎng)基增殖，增殖倍率可達(dá)25倍。
[0014]表1金線蓮不同時間段增殖特點(diǎn)
【權(quán)利要求】
1.一種金線蓮組織培養(yǎng)快速增殖方法，其特征在于，包括以下步驟: 外植體誘導(dǎo):采取金線蓮植株作為外植體，先對外植體進(jìn)行清洗、消毒，接入不添加激素的MS基本培養(yǎng)基誘導(dǎo)培養(yǎng),前一周弱光培養(yǎng)，光照強(qiáng)度500-800LUX, —周后強(qiáng)光培養(yǎng),光照強(qiáng)度1500-2000Lux，光照時間10小時/天，溫度23±2°C，培養(yǎng)40天； 增殖培養(yǎng):接入液體培養(yǎng)基中進(jìn)液體增殖培養(yǎng)，液體增殖培養(yǎng)基配比:MS培養(yǎng)基、6-BA1.4-1.6mg/L、NAA0.2-0.3mg/L，培養(yǎng)條件為暗培養(yǎng)，溫度為23±2°C，培養(yǎng)周期45天； 壯苗培養(yǎng):壯苗培養(yǎng)基為無激素液體改良MS培養(yǎng)基，光照培養(yǎng)，光強(qiáng)為1200-1500LUX，光照時間為8小時/天，溫度為23±2°C，培養(yǎng)周期為12-15天； 生根培養(yǎng):生根培養(yǎng)基配比:1/2MS、香蕉60g/L、活性炭lg/L、水解酪蛋白0.5g/L，光照培養(yǎng)，光照時間10小時/天，光照強(qiáng)度1500-2500Lux，溫度為23±2°C，培養(yǎng)周期為3個月。
2.如權(quán)利要求1所述的一種金線蓮組織培養(yǎng)快速增殖方法，其特征在于，所述外植體清洗、消毒的具體步驟為:先用洗衣粉水溶液浸泡5min，自來水沖洗干凈；置于無菌工作臺中，75%的酒精消毒30s,無菌水沖洗I次,再用0.1%的升萊消毒3 min,無菌水沖洗3次,最后用10%的次氯酸鈉消毒6-8min，無菌水沖洗5次。
3.如權(quán)利要求1所述的一種金線蓮組織培養(yǎng)快速增殖方法，其特征在于，所述外植體消毒完成后，吸干水分切成1±0.1 Cm的莖段，然后接入不添加激素的MS基本培養(yǎng)基中進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)，pH 5.6-5.8。
4.如權(quán)利要求1所述的一種金線蓮組織培養(yǎng)快速增殖方法，其特征在于，所述增殖培養(yǎng)及壯苗培養(yǎng)均采用液體淺層震蕩培養(yǎng)，采用直徑80cm、高IOOcm耐高溫PP組培瓶培養(yǎng)，培養(yǎng)液的量為瓶身的1/6-1/5，接種量為培養(yǎng)液的2/3-3/4，并置于大型工業(yè)搖床上，轉(zhuǎn)速80-100r/min。
5.如權(quán)利要求1所述的一`種金線蓮組織培養(yǎng)快速增殖方法，其特征在于，所述增殖培養(yǎng)每隔15天更換一次培養(yǎng)液并分瓶，45天后轉(zhuǎn)入壯苗培養(yǎng)基中。
【文檔編號】A01H4/00GK103858762SQ201410096819
【公開日】2014年6月18日 申請日期:2014年3月17日 優(yōu)先權(quán)日:2014年3月17日
【發(fā)明者】石斗開, 陳瑞鳳, 陳秀環(huán), 賴鷺挺, 賴鷺捷, 陸利春 申請人:廈門涌泉科技有限公司