一種干巴菌菌種的分離方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種干巴菌菌種的分離方法，涉及食用菌培育領域。該方法是取新鮮干巴菌子實體，用鑷子將其撕成小塊，放入無菌培養(yǎng)皿中，用封口膜裹嚴，25℃培養(yǎng)2-5天；在解剖鏡下觀察菌絲體萌發(fā)情況，選取長勢好的干巴菌塊，放到另一無菌培養(yǎng)皿中，并將PDA瓊脂塊放入其中；在解剖鏡下無菌操作，將PDA瓊脂塊用解剖刀推至干巴菌長菌絲部位，與菌絲接觸，但不能接觸菌塊，用封口膜裹嚴，25℃培養(yǎng)2-5天；在解剖鏡下觀察，當菌絲長到PDA瓊脂塊上時，在PDA瓊脂塊上得到干巴菌菌絲體。本發(fā)明能夠獲得純干巴菌菌絲體，是分離干巴菌菌種的一種簡便、易操作的方法。
【專利說明】一種干巴菌菌種的分罔方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及食用菌培育領域，尤其涉及的是一種干巴菌菌種的分離方法。
【背景技術】
[0002]干巴菌(ThelephoraganbajunZang.)屬革菌屬(Thelephora)是云南特有的珍稀野生食用菌。隨著商品經濟的發(fā)展，干巴菌越來越為國人所青睞，近幾年干巴菌市場售價每公斤均超過千元，品質較好的干巴菌要價1600元/公斤。干巴菌已成為地方重要的經濟來源之一。由于干巴菌為一種共生真菌，目前尚不能進行人工栽培，所有市售商品均來自野生資源，而且由于市場價格較高，導致了對野生資源的掠奪性開發(fā)，導致其生長的自然林地遭受嚴重破壞，干巴菌產量逐年下降，在部分地區(qū)甚至產生了嚴峻的生態(tài)環(huán)境問題和社會經濟問題。因此，在指導農民合理采收干巴菌的同時，積極開展干巴菌菌種的實驗室分離培養(yǎng)及其生長規(guī)律的研究是目前該研究領域比較緊迫的任務。
[0003]干巴菌的菌種分離非常困難。在已報道的文獻中，有研究者也發(fā)現(xiàn)干巴菌的子實體中至少有20余種真菌。這與干巴菌的形成有關，由于干巴菌主要生長在松林的根部土壤中，而干巴菌的形成與其它蘑菇類不一樣，其它蘑菇類是先形成菌蕾，由菌蕾再長大，是個體整體在長大，外形變化不大。據(jù)觀察發(fā)現(xiàn)，干巴菌的形成是一層一層形成的，耗時半個月到一個月。由于形成過程相對其它蘑菇類要慢，有大量的微生物通過風或雨水侵入到干巴菌子實體內部。因此，要想從眾多的微生物中得到干巴菌菌種，按微生物常規(guī)分離方法是很難得到的。

【發(fā)明內容】

[0004]本發(fā)明所要解決的技術問題是針對現(xiàn)有技術對干巴菌菌種分離困難的問題，提供了一種干巴菌菌種的分離方法。
[0005]本發(fā)明的技術方案如下:
[0006]一種干巴菌菌種的分離方法，其技術方案為，取新鮮干巴菌子實體，用鑷子將其撕成5*10mm小塊，放入無菌培養(yǎng)皿中，用封口膜裹嚴，25°C培養(yǎng)2_5天；在解剖鏡下觀察菌絲體萌發(fā)情況，選取長勢好的干巴菌塊，放到另一無菌培養(yǎng)皿中，并將PDA瓊脂塊放入其中；在解剖鏡下無菌操作，將PDA瓊脂塊用解剖刀推至干巴菌長菌絲部位，與菌絲接觸，但不能接觸菌塊，用封口膜裹嚴，25 °C培養(yǎng)2-5天；在解剖鏡下觀察，當菌絲長到PDA瓊脂塊上時，在PDA瓊脂塊上得到干巴菌菌絲體。
[0007]所述新鮮干巴菌子實體，其表面不做任何處理。
[0008]本發(fā)明獲得了純干巴菌菌絲體，是分離干巴菌菌種的一種簡便、易操作的方法。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0009]圖1為干巴菌組織塊與PDA瓊脂塊的擺放位置。
[0010]圖2為干巴菌菌絲萌發(fā)接觸PDA瓊脂塊。【具體實施方式】
[0011]以下結合具體實施例，對本發(fā)明進行詳細說明。
[0012]實施例
[0013]1、材料和方法
[0014]1.1分離材料:云南省嵩明縣阿子營鄉(xiāng)林地采集新鮮干巴菌子實體樣品。
[0015]培養(yǎng)基:分離培養(yǎng)基:PDA
[0016]1.2分離方法
[0017]1.2.1組織分離法
[0018]先將新鮮干巴菌子實體經紫外線照射lOmin，用鑷子瓣開，再用燒紅的手術剪剪黃豆大的組織塊，無菌操作接入PDA培養(yǎng)基斜面上，26°C培養(yǎng)。
[0019]1.2.2孢子分離法
[0020]在盛有 培養(yǎng)基的三角瓶頂部安細鋼絲鉤，鉤朝下，鉤上吊適當大不作表面消毒的新鮮干巴菌菌側朝培養(yǎng)基，待孢子彈射后，無菌操作取出細鋼絲鉤和菌蓋，收集孢子，于26°C培養(yǎng)。
[0021]1.2.3空氣傳導分離法
[0022](I)新鮮干巴菌子實體表面不做任何處理，用鑷子將干巴菌子實體撕成5*10mm小塊，放入無菌培養(yǎng)皿中，用封口膜裹嚴，25 °C培養(yǎng)2-5天。
[0023](2)在解剖鏡下觀察菌絲體萌發(fā)情況，選取長勢好的干巴菌塊，放到另一無菌培養(yǎng)皿中，并將PDA瓊脂塊放到同一培養(yǎng)皿中(如圖1)。
[0024](3)在解剖鏡下無菌操作，將PDA瓊脂塊用解剖刀推至干巴菌長菌絲部位，與菌絲接觸，但不能接觸菌塊，用封口膜裹嚴，25 °C培養(yǎng)2-5天。
[0025](4)在解剖鏡觀察菌絲是否已長到PDA瓊脂塊上(如圖2)。
[0026](5)得到的PDA瓊脂塊上菌絲體經ITS序列比對鑒定是否是干巴菌菌種。
[0027]2、結果
[0028]三種分離干巴菌菌種的結果，見表1。
[0029]由于干巴菌子實體的形成過程中有大量的微生物混入子實體里，而組織分離法無法將酵母菌和其它真菌分開，此方法沒有獲得純干巴菌菌絲體；孢子分離法雖然獲得了大量的干巴菌擔孢子，但擔孢子在PDA培養(yǎng)上，經3個月培養(yǎng)不萌發(fā)，孢子的擔萌發(fā)條件還需進一步優(yōu)化。使用空氣傳導分離法(圖1，圖2)，有效地避開了干巴菌中的酵母菌、細菌和其它真菌等微生物，可以獲得純干巴菌菌絲體，是分離干巴菌菌種的一種簡便、易操作的成功方法。
[0030]表1三種分離方法比較統(tǒng)計
[0031]
【權利要求】
1.一種干巴菌菌種的分離方法，其特征在于，取新鮮干巴菌子實體，用鑷子將其撕成5*10mm小塊，放入無菌培養(yǎng)皿中，用封口膜裹嚴，25°C培養(yǎng)2_5天；在解剖鏡下觀察菌絲體萌發(fā)情況，選取長勢好的干巴菌塊，放到另一無菌培養(yǎng)皿中，并將PDA瓊脂塊放入其中；在解剖鏡下無菌操作，將PDA瓊脂塊用解剖刀推至干巴菌長菌絲部位，與菌絲接觸，但不能接觸菌塊，用封口膜裹嚴，25°C培養(yǎng)2-5天；在解剖鏡下觀察，當菌絲長到PDA瓊脂塊上時，在PDA瓊脂塊上得到干巴菌菌絲體。
2.根據(jù)權利要求1所述的分離方法，其特征是，所述新鮮干巴菌子實體，其表面不做任何處理 。
【文檔編號】A01G1/04GK103828601SQ201410085153
【公開日】2014年6月4日 申請日期:2014年3月10日 優(yōu)先權日:2014年3月10日
【發(fā)明者】沙濤, 王康康, 張亞平, 張漢波, 李文鵬, 楊明摯 申請人:云南大學