一種同源性瘤胃微生態(tài)調控劑的制備方法及應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種同源性瘤胃微生態(tài)調控劑的制備方法及應用。用55％乙醇提取荷青花、中南魚藤根莖干粉三次，濃縮提取液至1/20，按一定比例制成復合液。用復合液連續(xù)培養(yǎng)瘤胃液，獲得低甲烷活性瘤胃培養(yǎng)物。將培養(yǎng)物懸浮于人工唾液和復合液中，制成同源性瘤胃微生態(tài)調控劑。按體重的0.01％，將調控劑分別注入兩種牛的瘤胃內(nèi)，瘤胃甲烷產(chǎn)量分別下降了23.44％和21.45％，總揮發(fā)性脂肪酸提高了12.53％和19.47％，乙/丙下降了35.21％和37.71％，微生物蛋白提高了12.43％～25.88％和13.78％～26.4％，產(chǎn)甲烷菌和原蟲分別下降了兩個數(shù)量級，真菌和細菌分別提高了1-2個數(shù)量級。
【專利說明】—種同源性瘤胃微生態(tài)調控劑的制備方法及應用
【技術領域】:
[0001]本發(fā)明涉及一種減少瘤胃甲烷生成、改善瘤胃發(fā)酵性能的同源性瘤胃微生態(tài)調控劑的制備方法及應用。
【背景技術】:
[0002]甲烷(CH4)是超強溫室氣體，其溫室效應是二氧化碳的20多倍。反芻動物是甲烷氣體的主要來源之一，占到甲烷排放總量的15%，其中90%以上來自反芻動物瘤胃厭氧發(fā)酵。瘤胃產(chǎn)生甲烷也是反芻動物能量損失的重要原因，在反芻動物瘤胃厭氧發(fā)酵過程中約有6%?15%的飼料能量以甲烷的形式損耗。因此，降低瘤胃甲烷的產(chǎn)量，不僅能減少反芻動物溫室氣體排放，而且還可以提高瘤胃的飼料利用率，改善反芻動物的生產(chǎn)性能。
[0003]利用甲烷調控劑控制瘤胃甲烷生成是反芻動物甲烷減排的主要技術手段。瘤胃甲烷調控劑包括具有降甲烷作用的化學合成物、抗生素、微生物制劑和天然產(chǎn)物等。在各類甲烷調控劑中，化學合成和抗生素類調控劑由于生物毒性和殘留問題多數(shù)已被禁止使用。微生物和天然產(chǎn)物甲烷調控劑是在對飼料添加劑要求越來越嚴格的背景下，近年開始研究的新型瘤胃甲烷調控劑，由于毒副作用小、無殘留或殘留極小、不易產(chǎn)生抗藥性，較好地消除了化學合成物和抗生素類甲烷調控劑衍生的健康與環(huán)境問題，符合反芻動物健康養(yǎng)殖的要求，是瘤胃甲烷調控劑的發(fā)展方向。
[0004]盡管微生物和天然產(chǎn)物甲烷調控劑與化學合成和抗生素類甲烷調控劑相比，在安全性方面有著顯著的優(yōu)勢，但降甲烷效果與其它甲烷調控劑一樣，存在著有效時間較短、作用不夠專一和穩(wěn)定、調控效果不明顯的問題。這種現(xiàn)象與反芻動物瘤胃微生物區(qū)系及其微生態(tài)系統(tǒng)特點密切相關。瘤胃微生物數(shù)量巨大、種群多樣、群落結構復雜，建立在微生物群落基礎上的瘤胃微生態(tài)系統(tǒng)具有抗干擾、自我修復和排斥外來生物的特點，這些特點與瘤胃特定的厭氧、高滲等環(huán)境條件共同構成了瘤胃的生態(tài)屏障。當天然產(chǎn)物調控劑進入瘤胃后，瘤胃中不同微生物群體相互作用，通過降解、轉化等一系列生物化學過程，在較短時間內(nèi)就可能削弱調控劑的影響，使調控作用減弱。而當異源性微生物甲烷調控劑進入瘤胃后，瘤胃原籍菌群則會通過競爭、排斥等一系列作用，使之難以在瘤胃內(nèi)定居，更難形成能發(fā)揮作用的穩(wěn)定種群。由此可見，如何克服瘤胃生態(tài)屏障，有效控制瘤胃甲烷生成，是反芻動物甲烷減排的關鍵問題。

【發(fā)明內(nèi)容】
:
[0005]技術問題
[0006]為了克服上述瘤胃生態(tài)屏障問題，改善瘤胃調控效果，有效減少瘤胃甲烷生成，本發(fā)明提供了一種同源性微生態(tài)調控劑的制備方法。將該方法制備的同源性微生態(tài)調控劑應用在肉牛養(yǎng)殖上，可顯著減少瘤胃的甲烷生成量、提高瘤胃總揮發(fā)性脂肪酸產(chǎn)量、降低瘤胃乙酸/丙酸比值、提高瘤胃菌體蛋白產(chǎn)量、減少瘤胃內(nèi)產(chǎn)甲烷菌和原蟲數(shù)量、增加瘤胃細菌和真菌數(shù)量，且效果明顯優(yōu)于單獨使用的降甲烷天然產(chǎn)物。[0007]技術方案
[0008]實現(xiàn)本發(fā)明的技術方案是:
[0009]A、提取物復合液的制備
[0010]采集荷青花(Hylomecon japonica)和中南魚藤(Derris fordii)成熟植株根莖，分別置50°C干燥箱內(nèi)烘至恒重，粉碎過0.25mm篩，干粉用5倍量55%乙醇回流提取3次，每次2小時，分別合并提取液，回收乙醇并濃縮至原體積的1/20。按荷青花濃縮液1:中南魚藤濃縮液1、荷青花濃縮液2:中南魚藤濃縮液1、荷青花濃縮液1:中南魚藤濃縮液2三種體積份比，配成提取物復合液。用于本發(fā)明具體實施的提取物復合液，其優(yōu)選體積份比為荷青花濃縮液2:中南魚藤濃縮液I。
[0011]B、低甲烷活性瘤胃培養(yǎng)物的制備
[0012]培養(yǎng)裝置采用固液氣分流式瘤胃模擬系統(tǒng)。開始時向兩個發(fā)酵罐分別注入670mL成年永豐黃牛新鮮瘤胃液，分別向兩罐加入15g配制的?；A飼糧，向其中一個罐(培養(yǎng)罐)注入5mL提取物復合液(荷青花濃縮液2:中南魚藤濃縮液I)，向另一個罐(對照罐)注入5mL滅菌水，最后用人工唾液分別將兩罐的發(fā)酵體積調至lOOOmL。設定培養(yǎng)條件:溫度39°C、轉速15r/min、液體稀釋率8% /h、固體稀釋率4% /h。每天9:00和21:00分別從兩發(fā)酵罐的排固口抽出IOOmL發(fā)酵過食糜，從加料口分別向兩罐中加入15g?；A飼糧補料、95mL人工唾液補液，向培養(yǎng)罐注入5mL提取物復合液，向對照罐注入5mL滅菌水，分別向兩罐中不斷充入N2，用以維持罐內(nèi)的厭氧環(huán)境。兩發(fā)酵罐分別外接一個氣體采集袋，每三天一次分別收集補料后72h內(nèi)的氣體樣本，用氣相色譜測定甲烷含量。連續(xù)培養(yǎng)24d后，培養(yǎng)罐的甲烷生成量比同期對照罐減少44.3%，達到最低值，繼續(xù)培養(yǎng)24d，甲烷生成量一直維持在最低點值附近，這表明培養(yǎng)罐內(nèi)培養(yǎng)物的低甲烷活性特點已穩(wěn)定，因此在第48d的19:00終止培養(yǎng)，靜置2小時后，于21:00從培養(yǎng)罐中部的排液口將發(fā)酵液收集到離心管內(nèi)，用純N2飽和后密封，于39°C和4000rpm條件下離心lOmin，在厭氧操作下棄除上清液，合并離心固形物，該合并的離心固形物為低甲烷活性牛瘤胃培養(yǎng)物。對照罐的甲烷生成量自始至終保持平穩(wěn)。
[0013]C、同源性瘤胃微生態(tài)調控劑的制備
[0014]用上述低甲烷活性牛瘤胃培養(yǎng)物八倍量的人工唾液加上兩倍量的提取物復合液(荷青花濃縮液2:中南魚藤濃縮液I)，在厭氧操作箱中分散懸浮培養(yǎng)物，就制成了同源性瘤胃微生態(tài)調控劑。
[0015]D、同源性瘤胃微生態(tài)調控劑的應用
[0016]選擇大小相近的12月齡雄性永豐黃牛6頭，以及大小相近的12月齡雄性夏洛萊牛6頭，安裝永久性瘤胃瘺管，在相同條件下喂養(yǎng)I月。14月齡時，永豐黃牛和夏洛萊牛各自隨機分為同源性微生態(tài)調控劑試驗組、降甲烷植物提取物試驗組和對照組，每組2頭。同源性微生態(tài)調控劑試驗組每天按體重的0.01%，經(jīng)由瘤胃瘺管一次性灌注新鮮同源性瘤胃微生態(tài)調控劑，降甲烷植物提取物試驗組用同樣的方法一次性灌注同樣份量的前述提取物復合液(荷青花濃縮液2:中南魚藤濃縮液I)，對照組按相同比例和相同方法灌注滅菌水。與此同時，向每頭牛瘤胃投放SF6滲透管，采用SF6示蹤技術分別在第Od (灌注前)、6d、12d、18d、24d和第30d收集牛全天經(jīng)口、鼻排出的氣體樣本,用氣相色譜檢測甲烷含量,計算出瘤胃24小時的甲烷產(chǎn)生量。在采集氣體樣本的同一天，經(jīng)由瘤胃瘺管采集瘤胃液樣本，用氣相色譜法定量瘤胃樣品中乙酸、丙酸、丁酸等揮發(fā)性脂肪酸，并計算乙酸/丙酸比值；采用嘌呤法測定樣品中的微生物蛋白質含量，采用比色法測定氨態(tài)氮濃度；同時提取各時間點瘤胃液樣品的微生物基因組DNA，使用RT-qPCR技術檢測細菌、真菌、產(chǎn)甲烷菌和原蟲的相對數(shù)量。應用試驗持續(xù)時間30d。
[0017]有益效果
[0018]A、減少瘤胃甲烷生成的效果
[0019]瘤胃甲烷排放量測試結果表明，同源性瘤胃微生態(tài)調控劑試驗組的永豐黃牛和夏洛萊牛的甲烷生成量走勢基本相同，前期均呈連續(xù)下降趨勢，至第24d趨于穩(wěn)定，試驗結束時永豐黃牛和夏洛萊牛瘤胃甲烷生成量分別減少了 23.44%和21.45%;降甲烷植物提取物試驗組甲烷的最大降幅出現(xiàn)在第6d，永豐黃牛比試驗前減少了 16.01%，夏洛萊牛比試驗前減少了 15.47%，此后甲烷生成量緩慢回升，至試驗結束時永豐黃牛減少了 10.33%，夏洛萊牛減少了 12.93% ;而對照組永豐黃牛和夏洛萊牛的甲烷生成量在試驗前后沒有明顯變化。可見，同源性瘤胃微生態(tài)調控劑可顯著減少牛瘤胃的甲烷生成量，且作用優(yōu)于單獨使用的降甲烷植物提取物。
[0020]B、對瘤胃揮發(fā)性脂肪酸的影響
[0021]瘤胃液樣本揮發(fā)性脂肪酸測試結果表明，同源性微生態(tài)調控劑可提高牛瘤胃的揮發(fā)性脂肪酸產(chǎn)量，永豐黃牛和夏洛萊牛分別提高了 12.53%和19.47%，與此同時，同源性微生態(tài)調控劑還降低了乙酸/丙酸比值，與試驗前相比，永豐黃牛和夏洛萊牛瘤胃的乙酸/丙酸比值分別降低35.21%和37.71% ;降甲烷植物提取物也提高了瘤胃揮發(fā)性脂肪酸產(chǎn)量，其中永豐黃牛提高了 3.43%?4.91%，夏洛萊牛提高了 1.17%?7.26%，并降低了瘤胃乙酸/丙酸比值，其中永豐黃牛降低了 11.59%?16.43%，夏洛萊牛降低了 9.39%?20.31% ;對照組永豐黃牛和夏洛萊牛瘤胃的揮發(fā)性脂肪酸產(chǎn)量和乙酸/丙酸比值試驗前后均無明顯變化。由此可見，兩種甲烷調控劑都能提高牛瘤胃的揮發(fā)性脂肪酸產(chǎn)量，降低乙酸/丙酸比值，但同源性微生態(tài)調控劑的效果顯著優(yōu)于降甲烷植物提取物。
[0022]C、對瘤胃氨氮和菌體蛋白產(chǎn)量的影響
[0023]試驗期間，同源性微生態(tài)調控劑分別降低了永豐黃牛和夏洛萊牛瘤胃氨氮濃度10.61%?18.17%和14.07 %?24.4 %，提高了瘤胃菌體蛋白產(chǎn)量12.43 %?25.88%和13.78%?26.4% ;降甲烷植物提取物降低永豐黃牛和夏洛萊牛瘤胃氨氮的幅度為4.65%?10.56%和5.62%?12.59%,同時提高菌體蛋白產(chǎn)量6.34 %?19.97 %和
4.92%?18.49% ο試驗結果表明，兩種調控劑均能提聞牛瘤胃氣氣的利用率和菌體蛋白廣量，但同源性微生態(tài)調控劑的作用更明顯。對照組牛瘤胃的氨氮和菌體蛋白濃度在試驗期間均未出現(xiàn)明顯變化。
[0024]D、對瘤胃微生物的影響
[0025]瘤胃微生物的RT-qPCR檢測結果表明，隨著試驗進程，同源性微生態(tài)調控劑試驗組永豐黃牛瘤胃的產(chǎn)甲烷菌數(shù)量下降了 2個數(shù)量級，在試驗期間的各個時段都比對照組低2-3個數(shù)量級,原蟲數(shù)量也下降了 2個數(shù)量級,相反,細菌數(shù)量提高了 2個數(shù)量級,真菌數(shù)量提高了約I個數(shù)量級；降甲烷植物提取物試驗組永豐黃牛瘤胃的微生物數(shù)量構成介于同源性微生態(tài)調控劑試驗組和對照組之間。RT-qPCR檢測結果同樣顯示，兩種調控劑對夏洛萊牛瘤胃微生物的影響與對永豐黃牛瘤胃微生物的影響相似。試驗結果表明，兩種調控劑對牛瘤胃的微生物數(shù)量構成均可產(chǎn)生顯著影響，但同源性微生態(tài)調控劑的作用更為明顯。
[0026]利用荷青花和中南魚藤的提取物復合液經(jīng)過體外發(fā)酵，生產(chǎn)出低甲烷活性瘤胃培養(yǎng)物，再利用荷青花和中南魚藤的提取物復合液和低甲烷活性瘤胃培養(yǎng)物，制備出同源性瘤胃微生態(tài)調控劑，可有效解決瘤胃甲烷調控中的生態(tài)屏障問題，改善調控效果。應用本方法制備的瘤胃微生態(tài)調控劑，不僅能減少瘤胃甲烷生成量，還能顯著改善瘤胃的發(fā)酵性能，提高瘤胃揮發(fā)性脂肪酸，降低乙酸/丙酸比值，提高瘤胃菌體蛋白產(chǎn)量，其作用明顯優(yōu)于單獨使用的降甲烷天然產(chǎn)物。本方法制備的瘤胃微生態(tài)調控劑應用在親緣關系較遠的永豐黃牛和夏洛萊牛上，效果沒有明顯差異，說明該瘤胃微生態(tài)調控劑具有較廣闊的應用領域和較好的開發(fā)前景。
【具體實施方式】:
[0027]A、提取物復合液的制備
[0028]采集荷青花(Hylomecon japonica)和中南魚藤(Derris fordii)成熟植株根莖，分別置50°C干燥箱內(nèi)烘至恒重，粉碎過0.25mm篩，干粉用5倍量55%乙醇回流提取3次，每次2小時，分別合并提取液，回收乙醇并濃縮至原體積的1/20。按荷青花濃縮液1:中南魚藤濃縮液1、荷青花濃縮液2:中南魚藤濃縮液1、荷青花濃縮液1:中南魚藤濃縮液2三種體積份比，配成提取物復合液。用于本發(fā)明具體實施的提取物復合液，其優(yōu)選體積份比為荷青花濃縮液2:中南魚藤濃縮液I。
[0029]B、低甲烷活性瘤胃培養(yǎng)物的制備
[0030]培養(yǎng)裝置采用固液氣分流式瘤胃模擬系統(tǒng)。開始時向兩個發(fā)酵罐分別注入670mL成年永豐黃牛新鮮瘤胃液，分別向兩罐加入15g配制的?；A飼糧(詳見表I)，向其中一個罐(培養(yǎng)罐)注入5mL提取物復合液(荷青花濃縮液2:中南魚藤濃縮液I)，向另一個罐(對照罐)注入5mL滅菌水，最后用人工唾液(詳見表2、表3)分別將兩罐的發(fā)酵體積調至lOOOmL。設定培養(yǎng)條件:溫度39°C、轉速15r/min、液體稀釋率8% /h、固體稀釋率4% /h。每天9:00和21:00分別從兩發(fā)酵罐的排固口抽出IOOmL發(fā)酵過食糜，從加料口分別向兩罐中加入15g?；A飼糧補料、95mL人工唾液補液，向培養(yǎng)罐注入5mL提取物復合液，向對照罐注入5mL滅菌水，分別向兩罐中不斷充入N2，用以維持罐內(nèi)的厭氧環(huán)境。兩發(fā)酵罐分別外接一個氣體采集袋，每三天一次分別收集補料后72h內(nèi)的氣體樣本，用氣相色譜測定甲烷含量。連續(xù)培養(yǎng)24d后，培養(yǎng)罐的甲烷生成量比同期對照罐減少44.3%，達到最低值，繼續(xù)培養(yǎng)24d,甲燒生成量一直維持在最低點值附近(詳見表4),這表明培養(yǎng)罐內(nèi)培養(yǎng)物的低甲烷活性特點已穩(wěn)定，因此在第48d的19:00終止培養(yǎng)，靜置2小時后，于21:00從培養(yǎng)罐中部的排液口將發(fā)酵液收集到離心管內(nèi)，用純N2飽和后密封，于39°C和4000rpm條件下離心lOmin，在厭氧操作下棄除上清液，合并離心固形物，該合并的離心固形物為低甲烷活性牛瘤胃培養(yǎng)物。對照罐的甲烷生成量自始至終保持平穩(wěn)。
[0031]C、同源性瘤胃微生態(tài)調控劑的制備
[0032]用上述低甲烷活性牛瘤胃培養(yǎng)物八倍量的人工唾液加上兩倍量的提取物復合液(荷青花濃縮液2:中南魚藤濃縮液I)，在厭氧操作箱中分散懸浮培養(yǎng)物，就制成了同源性瘤胃微生態(tài)調控劑。
[0033]D、同源性瘤胃微生態(tài)調控劑的應用[0034]選擇大小相近的12月齡雄性永豐黃牛6頭，以及大小相近的12月齡雄性夏洛萊牛6頭，安裝永久性瘤胃瘺管，在相同條件下喂養(yǎng)I月。14月齡時，永豐黃牛和夏洛萊牛各自隨機分為同源性微生態(tài)調控劑試驗組、降甲烷植物提取物試驗組和對照組，每組2頭。同源性微生態(tài)調控劑試驗組每天按體重的0.01%，經(jīng)由瘤胃瘺管一次性灌注新鮮同源性瘤胃微生態(tài)調控劑，降甲烷植物提取物試驗組用同樣的方法一次性灌注同樣份量的前述提取物復合液(荷青花濃縮液2:中南魚藤濃縮液I)，對照組按相同比例和相同方法灌注滅菌水。與此同時，向每頭牛瘤胃投放SF6滲透管，采用SF6示蹤技術分別在第Od (灌注前)、6d、12d、18d、24d和第30d收集牛全天經(jīng)口、鼻排出的氣體樣本,用氣相色譜檢測甲烷含量,計算出瘤胃24小時的甲烷產(chǎn)生量，檢測結果詳見表5。在采集氣體樣本的同一天，經(jīng)由瘤胃瘺管采集瘤胃液樣本，用氣相色譜法定量瘤胃樣品中乙酸、丙酸、丁酸等揮發(fā)性脂肪酸，并計算乙酸/丙酸比值，檢測結果詳見表6 ;采用嘌呤法測定樣品中的微生物蛋白質含量，采用比色法測定氨態(tài)氮濃度，檢測結果詳見表7、表8 ;同時提取各時間點瘤胃液樣品的微生物基因組DNA，使用RT-qPCR技術檢測細菌、真菌、產(chǎn)甲烷菌和原蟲的相對數(shù)量，檢測結果詳見表9、表10。應用試驗持續(xù)時間30d。試驗前后日糧配方詳見表I。
[0035]表I?；A飼糧組成(干物質基礎)
[0036]
原料含量(％)
黑麥草6Z00
玉米26.00
麩皮3.00
棉粕7.00
磷酸氫鈣0.36
碳酸鈣0.60
食鹽0.40
小蘇打0.40
微量元素預混料0.04
維生素預混料0.20
[0037]人工唾液配制:
[0038]表2人工唾液原液配制表
[0039]
【權利要求】
1.一種同源性瘤胃微生態(tài)調控劑的制備方法及應用，其特征在于:將植物提取物復合液和低甲烷活性瘤胃培養(yǎng)物按一定比例，配制成同源性瘤胃微生態(tài)調控劑。
2.根據(jù)權利要求1所述的同源性瘤胃微生態(tài)調控劑，其特征在于:采集荷青花和中南魚藤成熟植株根莖，烘至恒重，分別粉碎過0.25mm篩，用55%乙醇提取三次，分別濃縮至原體積的1/20，按荷青花提取物濃縮液2:中南魚藤提取物濃縮液I的體積份配成植物提取物復合液。
3.根據(jù)權利要求1所述的同源性瘤胃微生態(tài)調控劑，其特征在于:利用植物提取物復合液在體外連續(xù)培養(yǎng)牛瘤胃液48d，離心收集低甲烷活性瘤胃培養(yǎng)物。
4.根據(jù)權利要求1所述的同源性瘤胃微生態(tài)調控劑，其特征在于:用相當于培養(yǎng)物8倍量的人工唾液加上2倍量的植物提取物復合液，懸浮分散低甲烷活性瘤胃培養(yǎng)物，制成同源性瘤胃微生態(tài)調控劑。
5.根據(jù)權利要求1所述的同源性瘤胃微生態(tài)調控劑，其特征在于:按動物體重的0.01%，每日經(jīng)由瘤胃瘺管，將同源性瘤胃微生態(tài)調控劑一次性注入牛瘤胃。
6.根據(jù)權利要求5所述的同源性瘤胃微生態(tài)調控劑，其特征在于:同源性瘤胃微生態(tài)調控劑不僅可顯著地減少牛瘤胃的甲烷生成量，同時還能提高總揮發(fā)性脂肪酸產(chǎn)量，降低乙/丙酸比值，提高瘤胃菌體蛋白含量。
【文檔編號】A23K1/16GK103798523SQ201410084545
【公開日】2014年5月21日 申請日期:2014年3月10日 優(yōu)先權日:2014年3月10日
【發(fā)明者】于一尊, 丁建南, 王菊華, 張志紅, 王東升 申請人:南昌資環(huán)生態(tài)科技有限公司