一種脾虛痰濁型高脂血癥病證結(jié)合動(dòng)物模型的制作方法
【專利摘要】一種脾虛痰濁型高脂血癥病證結(jié)合動(dòng)物模型的制作方法屬于養(yǎng)殖脊椎動(dòng)物的【技術(shù)領(lǐng)域】。該動(dòng)物模型重復(fù)性和穩(wěn)定性好，可適用于脾虛痰濁型高脂血癥的基礎(chǔ)研究以及中醫(yī)健脾祛痰法治法治療高脂血癥的中藥篩選。第一階段、高脂飼料喂飼階段：以配方8%花生油、1.5%膽固醇、0.4%甲基硫氧嘧啶、6%蔗糖、5%蛋黃粉、1%谷氨酸鈉，以及78.1%基礎(chǔ)飼料的高脂飼料，連續(xù)飼喂4周。第二階段、饑飽失常及活動(dòng)限制階段：高脂飼料喂飼階段后，單日飼喂上述高脂飼料不限量，及以1ml/100g豬油灌胃；雙日飼喂干燥甘藍(lán)壓制的甘藍(lán)條不限量；并單體置于尺寸為15×8×10cm的籠中飼養(yǎng)以減少活動(dòng)，持續(xù)4周。即制成脾虛痰濁高脂血癥病證結(jié)合動(dòng)物模型。
【專利說明】一種脾虛痰濁型高脂血癥病證結(jié)合動(dòng)物模型的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于養(yǎng)殖脊椎動(dòng)物的【技術(shù)領(lǐng)域】，具體地，是涉及一種用于脾虛痰濁型高脂血癥的基礎(chǔ)研究和中醫(yī)健脾法治療高脂血癥中藥篩選的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型建立方法。
【背景技術(shù)】
[0002]高脂血癥也稱血脂異常，是指由于脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)或代謝異常，使血漿中的總膽固醇(TC)、總甘油三脂(TG)、低密度脂蛋白(LDL-C)、極低密度脂蛋白(VLDL-C)等致動(dòng)脈粥樣硬化脂質(zhì)中的一種或多種水平高于正常，高密度脂蛋白(HDL-C)水平低于正常的一類代謝疾病。高脂血癥是動(dòng)脈粥樣硬化的重要成因，也是導(dǎo)致心腦血管疾病的主要病理基礎(chǔ)，其防治已在全球受到廣泛關(guān)注，成為目前研究熱點(diǎn)。隨著人民生活水平的提高，高脂血癥的發(fā)病率逐年攀升，嚴(yán)重危害著人類健康。
[0003]中醫(yī)藥在防治高脂血癥方面具有明顯特色和優(yōu)勢(shì)，在《中藥新藥臨床研究指導(dǎo)原貝U》中將高脂血癥的中醫(yī)辨證分為:脾虛痰濁證、脾腎陽虛證、肝腎陰虛證、陰虛陽亢證和氣滯血瘀證等。但在臨床實(shí)踐中發(fā)現(xiàn)，高脂血癥尤以脾虛運(yùn)化無力而致痰濁內(nèi)停的脾虛痰濁證為多見。在臨床治療高脂血癥時(shí)，將其歸為中醫(yī)學(xué)“痰瘀”范疇，認(rèn)為脾失健運(yùn)而生痰濁，痰以致瘀，痰瘀互結(jié)為高脂血癥的主要病機(jī)?，F(xiàn)代臨床研究表明，人群脾虛痰濁型高脂血癥的危險(xiǎn)因素主要有三:第一、肥甘厚味，長期攝入高膽固醇、高甘油三酯食物，使得血脂水平升高，代謝失償；第二、現(xiàn)代人生活不規(guī)律，常不能按時(shí)進(jìn)餐，饑餓過后又過量飲食，使得脾氣受損，運(yùn)化無力，而致脂類堆積血脈；第三，大部分現(xiàn)代人生活壓力大，體力勞動(dòng)少，很少進(jìn)行鍛煉，機(jī)體氣化無力 ，導(dǎo)致痰濁淤積，血脂升高。
[0004]西醫(yī)高脂血癥動(dòng)物經(jīng)典模型的制備方法通常是以高脂飼料飼喂動(dòng)物。這種造模方法可使動(dòng)物產(chǎn)生從血脂異常到動(dòng)脈粥樣硬化的一系列病變，可以模擬高脂血癥的整個(gè)病變進(jìn)程。高脂飼料飼喂所致高脂血癥模型具有與臨床相似度大、方法簡單、模型重復(fù)性好、動(dòng)物間個(gè)體差異小等特點(diǎn)，是目前高脂血癥動(dòng)物模型復(fù)制的主要方法。
[0005]在以往的關(guān)于健脾化痰法治療高脂血癥的中醫(yī)和中西醫(yī)結(jié)合實(shí)驗(yàn)研究中，也多延用上述單純高脂飲食飼喂的方法，但是這種方法在中醫(yī)證型方面無法加以控制，所制備高脂血癥動(dòng)物模型因動(dòng)物自身體質(zhì)因素形成了多種證型混雜。在基礎(chǔ)研究中，無法客觀的體現(xiàn)脾虛痰濁型高脂血癥的基本致病因素和病理特征。對(duì)于普通高脂模型采用健脾化痰法治療后，由于模型證型的不確定性，實(shí)驗(yàn)結(jié)果重復(fù)性和穩(wěn)定性差，無法正確評(píng)價(jià)方藥的確切療效，對(duì)健脾化痰治法的各種方藥療效評(píng)價(jià)工作造成極大干擾。
[0006]過去的中醫(yī)證候動(dòng)物模型中，常綜合膏粱厚味、勞倦過度、苦寒瀉下、饑飽失常和寒濕困阻等方法來構(gòu)成導(dǎo)致脾虛的要素，但經(jīng)實(shí)踐證明這些因素不能良好的反應(yīng)臨床的主要致病因素，所以探索一種方法上能夠體現(xiàn)脾虛痰濁型高脂血癥現(xiàn)代致病因素，結(jié)果上能夠體現(xiàn)脾虛痰濁型高脂血癥病理變化的模型是亟需解決的重要問題。

【發(fā)明內(nèi)容】
[0007]本發(fā)明就是針對(duì)上述問題，彌補(bǔ)現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明提供了一種脾虛痰濁型高脂血癥動(dòng)物模型的制備方法，擬采用高脂飲食喂養(yǎng)復(fù)制高脂血癥動(dòng)物模型，并在此基礎(chǔ)上結(jié)合饑飽失常脾虛證動(dòng)物模型復(fù)制方法，并結(jié)合運(yùn)動(dòng)控制，建立一種符合高脂血癥致病機(jī)理及病程進(jìn)展，且與中醫(yī)臨床最為常見的中醫(yī)辨證分型相似的病證結(jié)合的脾虛痰濁高脂血癥動(dòng)物模型。該動(dòng)物模型重復(fù)性和穩(wěn)定性好，可適用于脾虛痰濁型高脂血癥的基礎(chǔ)研究以及中醫(yī)健脾祛痰法治法治療高脂血癥的中藥篩選。
[0008]為實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案。
[0009]第一階段、高脂飼料喂飼階段:
以配方8%花生油、1.5%膽固醇、0.4%甲基硫氧嘧啶、6%蔗糖、5%蛋黃粉、1%谷氨酸鈉，以及78.1%基礎(chǔ)飼料的高脂飼料，連續(xù)飼喂4周。
[0010]第二階段、饑飽失常及活動(dòng)限制階段:
高脂飼料喂飼階段后，單日飼喂上述高脂飼料不限量，及以lml/100g (動(dòng)物體重)豬油灌胃；雙日飼喂干燥甘藍(lán)壓制的甘藍(lán)條不限量；并單體置于尺寸為15X8X IOcm(長X寬X高)的籠中飼養(yǎng)以減少活動(dòng)，持續(xù)4周。
[0011]即制成脾虛痰濁高脂血癥病證結(jié)合動(dòng)物模型。
[0012]其中，基礎(chǔ)飼料是大麥15%、小麥31%、玉米15%、麩皮15%、魚粉6%，豆柏、油和鹽共計(jì) 18%。
[0013]所述的動(dòng)物是指270g± 30g的SPF級(jí)SD大鼠。
[0014]但在實(shí)際操作中`，如果直接飼喂甘藍(lán)會(huì)遇到很多問題:1、甘藍(lán)是一種易于腐爛的生鮮蔬菜，難以保存，需要實(shí)驗(yàn)人員現(xiàn)用現(xiàn)購，一方面加大了勞動(dòng)量，另一方面每次購買甘藍(lán)的數(shù)量較少，多次購買甘藍(lán)品質(zhì)可能會(huì)有差異，無法保證實(shí)驗(yàn)前后時(shí)期和各處理組之間的條件均一性。2、生鮮甘藍(lán)難以消毒，現(xiàn)階段大部分實(shí)驗(yàn)要求使用SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，而未經(jīng)消毒的甘藍(lán)無法帶入SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)室。3、生鮮甘藍(lán)含水量大，在制作脾虛證動(dòng)物模型時(shí)，作為動(dòng)物模型的評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，常需統(tǒng)計(jì)動(dòng)物進(jìn)食量和進(jìn)水量，喂食生鮮甘藍(lán)會(huì)影響進(jìn)水量的統(tǒng)計(jì)。
[0015]為了解決工作中遇到的上述困難，我們發(fā)明了一種用于饑飽失常飲食不節(jié)法致脾虛模型中使用的甘藍(lán)條，這種經(jīng)過了均質(zhì)化、干燥處理的甘藍(lán)條，能完美的解決上述問題。
[0016]所述的甘藍(lán)條是經(jīng)過以下方法制得:將甘藍(lán)去除老葉，粗切后清洗，60_80°C烘干，粉碎過150目篩，加入占總質(zhì)量5%淀粉糊(含淀粉20%)作為粘合劑，拌均后壓制成直徑1.5cm的條狀，進(jìn)行烘烤，爐溫在200-220°C，烘烤10-15分鐘，120°C高溫、1.3Mpa高壓消毒殺菌或福射消毒，I小時(shí)，最后冷卻進(jìn)行真空包裝。
[0017]通過上述方法制得的甘藍(lán)條，具有以下優(yōu)勢(shì):1、經(jīng)過清洗和消毒的甘藍(lán)條無細(xì)菌、真菌及芽孢，符合SPF實(shí)驗(yàn)室要求，可以進(jìn)行SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的飼喂。2、經(jīng)過粉碎、均質(zhì)的制作過程后，甘藍(lán)條的質(zhì)地均一，營養(yǎng)成分構(gòu)成相同，排除了實(shí)驗(yàn)動(dòng)物食用不同甘藍(lán)部位造成的處理因素的差異。大批量生產(chǎn)的甘藍(lán)條也排除了甘藍(lán)購買批次不同，品種和狀態(tài)不同所造成的營養(yǎng)含量不同，造成的各時(shí)段處理因素的差異。3、經(jīng)過了烘干的甘藍(lán)條可在實(shí)驗(yàn)中控制其水分全部由飲水?dāng)z入，可以更好的統(tǒng)計(jì)動(dòng)物每日攝食量和飲水量。
[0018]與現(xiàn)有技術(shù)相比本發(fā)明的有益效果。
[0019](I)采用長期飼喂高脂飼料造成血脂異常，并在血脂異常的基礎(chǔ)上發(fā)生肝細(xì)胞脂肪堆積，動(dòng)脈粥樣硬化，從而復(fù)制出高脂血癥特有病變。[0020](2)對(duì)于所用的高脂飼料的組成及配比進(jìn)行了改進(jìn)，并排除了經(jīng)典高脂配方飼料中所用的膽鹽。因在實(shí)踐中發(fā)現(xiàn)，膽鹽入肝經(jīng)膽經(jīng)，大寒大苦；在配方中加入膽鹽使得肝膽經(jīng)亦有病變，影響動(dòng)物成模。
[0021](3)根據(jù)中醫(yī)理論復(fù)制脾虛痰濁大鼠模型，具有痰濁困脾證候，如毛發(fā)油膩發(fā)黃、食欲低下、便溏、體重增長緩慢等表現(xiàn)。
[0022](4)大鼠放置在小籠中飼養(yǎng)，在使其運(yùn)動(dòng)量減少的同時(shí)，因并未加以束縛，不會(huì)造成大鼠情志障礙，使造模分型準(zhǔn)確。
[0023](5)使用干燥甘藍(lán)制成的甘藍(lán)條，可進(jìn)行SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物造模。
[0024](6)與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明所構(gòu)建的動(dòng)物模型與脾虛型高血脂癥臨床病變癥狀、體征相似，并經(jīng)過重復(fù)建模，證明其重復(fù)性和穩(wěn)定性良好，適用于中醫(yī)健脾祛痰法治療高脂血癥的中藥篩選，可為開展相關(guān)的新藥研發(fā)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0025]圖1-1和圖1-2是實(shí)驗(yàn)I的大鼠油紅染色結(jié)果對(duì)比圖(400X);其中，圖1_1為正常組，圖1_2為脾虛聞脂血癥組。
[0026]圖2-1、圖2-2和圖2-3是實(shí)驗(yàn)2的大鼠油紅染色結(jié)果對(duì)比圖(400X );其中，圖
2-1為正常組，圖2-2為高脂血癥組，圖2-3為脾虛高脂血癥組。
【具體實(shí)施方式】
[0027]實(shí)驗(yàn)I。
[0028]實(shí)驗(yàn)材料:①動(dòng)物:雄性SD大鼠，SPF級(jí)，體重270g±30g，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，合格證號(hào)SCXK(京)2012-0001。動(dòng)物購進(jìn)后，飼養(yǎng)環(huán)境溫度為(25土 I) °C，自然光照，喂以正常飼料自由飲食，適應(yīng)環(huán)境7天，進(jìn)入實(shí)驗(yàn)過程。隨機(jī)分為正常組和脾虛痰濁高脂血癥組。
[0029]②主要試劑:TC測(cè)定試劑盒(批號(hào):0113011), TG測(cè)定試劑盒(批號(hào):0113011),LDL-C測(cè)定試劑盒(批號(hào):0113011)、HDL-C測(cè)定試劑盒(批號(hào):0113011)、AMY測(cè)定試劑盒(批號(hào):0113011)，均購自于四川邁新生物技術(shù)有限公司。D-木糖試劑盒，購自南京建成生物工程研究所。
[0030]③主要儀器:iMark型酶標(biāo)儀,Trans-BlotSD 半干轉(zhuǎn)印(Bio-Rad) ;Mx300P 型 RealTime PCR儀(Agilent)，熒光顯微鏡(Leica);全自動(dòng)生化分析儀(日本東芝)。
[0031]脾虛高脂血癥組以配方為8%花生油、1.5%膽固醇、0.4%甲基硫氧嘧啶、6%蔗糖、5%蛋黃粉、1%谷氨酸鈉，以及78.1%基礎(chǔ)飼料的高脂飼料，飼喂4周。而后單日飼喂上述高脂飼料不限量，并以lml/100g豬油灌胃；雙日飼喂干燥甘藍(lán)壓制的蔬菜餅不限量，大鼠單只小籠(15 X 8 X IOcm)飼養(yǎng)以減少活動(dòng)，持續(xù)4周。
[0032]實(shí)驗(yàn)方法:(1)一般體征評(píng)分。根據(jù)下表中各項(xiàng)，對(duì)于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物逐一評(píng)分。評(píng)分采用隨機(jī)盲評(píng)法,實(shí)驗(yàn)人員由A、B、C三個(gè)小組組成。A小組成員由本實(shí)驗(yàn)的人員組成,負(fù)責(zé)捉取實(shí)驗(yàn)鼠，具體操作為拋硬幣決定實(shí)驗(yàn)鼠所屬組別，并按照實(shí)驗(yàn)鼠編號(hào)由小至大逐一捉入小籠，交給未看到此過程的B小組成員并記錄組別、實(shí)驗(yàn)鼠編號(hào)和順序號(hào)。B小組成員由不清楚本實(shí)驗(yàn)內(nèi)容的人員構(gòu)成，負(fù)責(zé)將實(shí)驗(yàn)鼠呈現(xiàn)給C小組成員并報(bào)告順序號(hào)。C小組成員由不清楚本實(shí)驗(yàn)內(nèi)容，但有一定的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)經(jīng)驗(yàn)的人員組成，負(fù)責(zé)按照下述評(píng)分表逐一進(jìn)行打分，并按順序號(hào)記錄。評(píng)分全部結(jié)束后，由本實(shí)驗(yàn)小組成員按照A小組成員的記錄統(tǒng)計(jì)各組評(píng)分。
【權(quán)利要求】
1.一種脾虛痰濁型高脂血癥病證結(jié)合動(dòng)物模型的制作方法，其特征在于: 第一階段、高脂飼料喂飼階段: 以配方8%花生油、1.5%膽固醇、0.4%甲基硫氧嘧啶、6%蔗糖、5%蛋黃粉、1%谷氨酸鈉，以及78.1%基礎(chǔ)飼料的高脂飼料，連續(xù)飼喂4周； 第二階段、饑飽失常及活動(dòng)限制階段: 高脂飼料喂飼階段后，單日飼喂上述高脂飼料不限量，及以lml/100g (動(dòng)物體重)豬油灌胃；雙日飼喂干燥甘藍(lán)壓制的甘藍(lán)條不限量；并單體置于尺寸為15X8X10 (長X寬X聞)的籠中詞養(yǎng)以減少活動(dòng)，持續(xù)4周； 即制成動(dòng)物模型。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制作方法，其特征在于:其制得的動(dòng)物模型用于脾虛痰濁型聞脂血癥的基礎(chǔ)研究以及中醫(yī)健脾怯疲法治法治療聞脂血癥的中藥篩選。
3.權(quán)利要求1所述的甘藍(lán)條的制作方法，其特征在于:將甘藍(lán)去除老葉，粗切后清洗，60-80°C烘干，粉碎過150目篩，加入占總質(zhì)量5%淀粉糊(含淀粉20%)作為粘合劑，拌均后壓制成直徑1.5cm的條狀，進(jìn)行烘烤，爐溫在200-220°C，烘烤10-15分鐘，120°C高溫、1.3Mpa高壓消毒殺菌或輻射消毒，I小時(shí)，最后冷卻進(jìn)行真空包裝。
4.權(quán)利要求1所述的脾虛痰濁型高脂血癥病證結(jié)合動(dòng)物模型的檢測(cè)方法，其特征在于: 實(shí)驗(yàn)材料:①動(dòng)物:雄性SD大鼠，SPF級(jí)，體重270g±30g，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，合格證號(hào)SCXK(京)2012-0001 ;動(dòng)物購進(jìn)后，飼養(yǎng)環(huán)境溫度為(25 土 I)V,自然光照，喂以正常飼料自由飲食，適應(yīng)環(huán)境7天，進(jìn)入實(shí)驗(yàn)過程，隨機(jī)分為正常組和脾虛痰濁高脂血癥組； ②主要試劑:TC測(cè)定試劑盒(批號(hào):0113011)、TG測(cè)定試劑盒(批號(hào):0113011)、LDL-C測(cè)定試劑盒(批號(hào):0113011)、HDL-C測(cè)定試劑盒(批號(hào):0113011)、AMY測(cè)定試劑盒(批號(hào):0113011)，均購自于四川邁新生物技術(shù)有限公司；D-木糖試劑盒，購自南京建成生物工程研究所； ③主要儀器:iMark型酶標(biāo)儀，Trans-BlotSD半干轉(zhuǎn)印(Bio-Rad) ;Mx300P型RealTime PCR儀(Agilent)，熒光顯微鏡(Leica);全自動(dòng)生化分析儀(日本東芝)； 脾虛高脂血癥組以配方為8%花生油、1.5%膽固醇、0.4%甲基硫氧嘧啶、6%蔗糖、5%蛋黃粉、1%谷氣酸納，以及78.1%基礎(chǔ)詞料的聞脂詞料，詞喂4周；而后單日詞喂上述聞脂詞料不限量，并以lml/100g豬油灌胃；雙日飼喂干燥甘藍(lán)壓制的蔬菜餅不限量，大鼠單只小籠(15X8X IOcm)飼養(yǎng)以減少活動(dòng)，持續(xù)4周； 實(shí)驗(yàn)方法:(1) 一般體征評(píng)分；根據(jù)下表中各項(xiàng)，對(duì)于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物逐一評(píng)分，評(píng)分采用隨機(jī)盲評(píng)法，實(shí)驗(yàn)人員由A、B、C三個(gè)小組組成，A小組成員由本實(shí)驗(yàn)的人員組成,負(fù)責(zé)捉取實(shí)驗(yàn)鼠，具體操作為拋硬幣決定實(shí)驗(yàn)鼠所屬組別，并按照實(shí)驗(yàn)鼠編號(hào)由小至大逐一捉入小籠，交給未看到此過程的B小組成員并記錄組別、實(shí)驗(yàn)鼠編號(hào)和順序號(hào)，B小組成員由不清楚本實(shí)驗(yàn)內(nèi)容的人員構(gòu)成，負(fù)責(zé)將實(shí)驗(yàn)鼠呈現(xiàn)給C小組成員并報(bào)告順序號(hào)，C小組成員由不清楚本實(shí)驗(yàn)內(nèi)容，但有一定的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)經(jīng)驗(yàn)的人員組成，負(fù)責(zé)按照下述評(píng)分表逐一進(jìn)行打分，并按順序號(hào)記錄，評(píng)分全部結(jié)束后，由本實(shí)驗(yàn)小組成員按照A小組成員的記錄統(tǒng)計(jì)各組評(píng)分； (2)D-木糖排泄率；大鼠禁食不禁水12小時(shí)，3%D-木糖溶液每只4ml灌胃，置于代謝籠中，禁食不禁水，收集5小時(shí)尿液，稱量總尿量，并每例取0.5ml尿液樣本，對(duì)溴苯胺法測(cè)量尿液中D-木糖含量，并計(jì)算D-木糖排泄率； (3)TG、TC、LDL-C、HDL-C、α -淀粉酶；大鼠水合氯醛麻醉，腹主動(dòng)脈取血，室溫靜置30分鐘，2000rpm離心20分，取血清，Toshiba全自動(dòng)血液分析儀測(cè)定TG、TC、LDL-C, HDL-C,α-淀粉酶； (4)肝臟油紅O染色；肝臟樣本制備冰凍切片(6μ m),切片干燥后入50%乙醇水洗，油紅O染色8min，50%乙醇分化，自來水終止分化，蘇木素復(fù)染，自來水反藍(lán)，甘油明膠封片；光學(xué)顯微鏡下觀察各組大鼠肝組 織脂質(zhì)沉積情況。
【文檔編號(hào)】A01K67/02GK103749385SQ201410024236
【公開日】2014年4月30日 申請(qǐng)日期:2014年1月20日 優(yōu)先權(quán)日:2014年1月20日
【發(fā)明者】楊關(guān)林, 賈連群, 李寧, 張立德, 張會(huì)永, 陳陽, 朱美林, 冷雪, 杜瑩 申請(qǐng)人:遼寧中醫(yī)藥大學(xué)