用于儲存和運(yùn)輸nk-92細(xì)胞系的方案和培養(yǎng)基的制作方法
【專利摘要】本文中描述了用于運(yùn)輸NK-92細(xì)胞的儲存培養(yǎng)基，其包含：人血清、約200IU/mL的IL-2、和一定密度的未輻照的NK-92細(xì)胞，所述NK-92細(xì)胞在遞送至治療場所時足以提供治療量的NK-92細(xì)胞，其中所述培養(yǎng)基的溫度維持在20℃至40℃之間的選定溫度的±5℃內(nèi)，使得所述NK-92細(xì)胞在放入儲存培養(yǎng)基中以后多達(dá)至少24小時的時段內(nèi)保持存活以施用給患者。也描述了運(yùn)輸NK-92細(xì)胞的方法，使得所述NK-92細(xì)胞在放入儲存培養(yǎng)基中以后多達(dá)至少24小時的時段內(nèi)保持存活以施用給患者。
【專利說明】用于儲存和運(yùn)輸NK-92細(xì)胞系的方案和培養(yǎng)基

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及NK-92細(xì)胞的儲存和運(yùn)輸，使得所述細(xì)胞保持存活以用于施用給患 者，例如，在放入儲存培養(yǎng)基中以后存活至少24小時的時段。

【背景技術(shù)】
[0002] 免疫系統(tǒng)的某些細(xì)胞對特定靶細(xì)胞具有細(xì)胞毒性活性。天然殺傷（NK)細(xì)胞(通常 占循環(huán)淋巴細(xì)胞的約10-15%)會結(jié)合和殺死靶細(xì)胞，包括病毒感染的細(xì)胞和許多惡性細(xì)胞， 就抗原而言是非特異性的，且沒有先前免疫致敏。Herberman等人，Science214:24 (1981)。 靶細(xì)胞的殺死通過誘導(dǎo)細(xì)胞裂解而發(fā)生。已經(jīng)證實，NK細(xì)胞在具有晚期癌癥的患者的 離體療法和體內(nèi)治療中都是有效的。但是，內(nèi)源NK細(xì)胞（即，從供體或從患者收獲的那 些）仍然難以起作用和應(yīng)用于免疫療法。難以離體繁殖維持它們的體內(nèi)靶向腫瘤能力、 殺腫瘤能力和殺病毒能力的NK細(xì)胞，這是它們在過繼細(xì)胞免疫療法中的臨床應(yīng)用的主 要障礙。Melder,等人，Cancer Research48:3461-3469 (1988); Stephen,等人，LeuL Lymphoma377-399(1992);Rosenberg，等人，New Engl. J.Med. 316:889-897(1987)。此外， 內(nèi)源NK細(xì)胞的制品包括，如果使用NK細(xì)胞來治療與供體無關(guān)的患者則必須除去的T細(xì)胞 和/或其它免疫效應(yīng)細(xì)胞。
[0003] 本文中描述的實施方案一般地涉及用于運(yùn)輸和/或遞送NK-92細(xì)胞的儲存培養(yǎng) 基，以及涉及運(yùn)輸和使用運(yùn)輸?shù)腘K-92細(xì)胞的方法。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] NK-92細(xì)胞系是一種被發(fā)現(xiàn)在有白介素2(IL-2)存在下會繁殖的獨(dú)特細(xì)胞系。 Gong等人，Leukemia8:652-658 (1994)。這些細(xì)胞對多種癌癥具有高細(xì)胞裂解活性。NK-92 細(xì)胞系是具有寬抗腫瘤細(xì)胞毒性的均勻NK細(xì)胞群體，在繁殖以后具有可預(yù)測的產(chǎn)率。I期 臨床試驗已經(jīng)證實了它的安全性譜，并且已經(jīng)觀察到在某些具有晚期癌癥的患者中的抗腫 瘤應(yīng)答。
[0005] 用NK-92細(xì)胞治療患者的一種限制是，在長時間段內(nèi)儲存和/或運(yùn)輸所述細(xì)胞的 能力。在患者療法中使用的NK細(xì)胞必須維持在當(dāng)前良好制備規(guī)程（cGMP)下，由此限制可 以培養(yǎng)和制備NK-92細(xì)胞系的場所的數(shù)目。迄今為止，NK-92細(xì)胞在患者療法中的應(yīng)用已 經(jīng)受限于非常鄰近要在其中進(jìn)行治療的醫(yī)院的培養(yǎng)和生產(chǎn)場所的可用性；現(xiàn)在在鄰近醫(yī)院 的場所中制備NK-92細(xì)胞，然后攜帶至醫(yī)療隊用于治療患者。目前，冷凍的NK-92細(xì)胞在解 凍后表現(xiàn)出急劇下降的細(xì)胞毒性。即使在幾天的培養(yǎng)恢復(fù)期以后，NK-92細(xì)胞數(shù)目和細(xì)胞 毒性仍然是次優(yōu)的。
[0006] 迄今，對內(nèi)源NK細(xì)胞的研究已經(jīng)指示，IL-2(1000IU/mL)對于運(yùn)輸過程中的NK細(xì) 胞活化是至關(guān)重要的，但是所述細(xì)胞不需要維持在37°C和5%二氧化碳下。Koepsell,等 人，Transfusion53:398-403(2013)。但是，內(nèi)源NK細(xì)胞顯著不同于NK-92細(xì)胞，這主要是 由于它們的不同起源：NK-92是癌癥衍生的細(xì)胞系，而內(nèi)源NK細(xì)胞收獲自供體（或患者） 并在加工后用于輸注進(jìn)患者中。內(nèi)源NK細(xì)胞制品似乎異質(zhì)細(xì)胞群體，而NK-92細(xì)胞是均勻 的克隆細(xì)胞系。NK-92細(xì)胞在維持細(xì)胞毒性的同時可容易地培養(yǎng)繁殖，而內(nèi)源NK細(xì)胞卻不 能。另外，內(nèi)源NK細(xì)胞的異質(zhì)群體不會以高密度聚集。因此，在儲存和/或運(yùn)輸這2種細(xì) 胞類型以后，生存力和細(xì)胞毒性的最大化需要非常不同的考慮。
[0007] NK-92細(xì)胞存在其它問題。例如，NK-92需要IL-2的存在才能保持存活和繁殖， 并且會在少至llU/mL的IL-2中繁殖。Gong，等人.出處同上。此外，細(xì)胞形態(tài)學(xué)和/或 表型隨著在培養(yǎng)基中使用的IL-2的量而變化。Gong，等人.出處同上。例如，IL-2受體 (⑶-25)表達(dá)與IL-2濃度成反比。Gong,等人·出處同上。
[0008] 更進(jìn)一步，在高濃度的NK-92細(xì)胞聚集會消極地影響它們在治療患者中的應(yīng)用。 這會產(chǎn)生困難，因為在沒有IL-2存在下，NK-92細(xì)胞會喪失生存力，而在有IL-2存在下，所 述細(xì)胞會繁殖。實際上，在正常細(xì)胞培養(yǎng)條件下，NK-92細(xì)胞的數(shù)目在約26-32小時內(nèi)倍增。 該困難被下述事實進(jìn)一步復(fù)雜化：儲存培養(yǎng)基必須能夠允許在NK-92細(xì)胞放入儲存培養(yǎng)基 中以后多達(dá)至少24小時內(nèi)運(yùn)輸至醫(yī)院。為了防止在運(yùn)輸過程中的聚集，必須考慮在任何給 定IL-2濃度下的NK-92細(xì)胞增殖速率。
[0009] 例如至少約24小時的時間范圍允許將所述細(xì)胞放入儲存培養(yǎng)基中，運(yùn)輸至醫(yī)院， 然后實現(xiàn)適當(dāng)操作以將NK-92細(xì)胞注射進(jìn)患者中。一旦NK-92細(xì)胞到達(dá)醫(yī)院（或其它治 療場所），將它們洗滌并轉(zhuǎn)移進(jìn)適合于注射進(jìn)患者中的溶液，例如，磷酸鹽緩沖鹽水（PBS)。 也輻照NK-92細(xì)胞以防止體內(nèi)增殖。盡管將輻射劑量設(shè)計成維持細(xì)胞毒性，它會不利地影 響細(xì)胞的生存力。因此，重要的是，用于運(yùn)輸?shù)膬Υ媾囵B(yǎng)基會在盡可能最大的程度上維持 NK-92細(xì)胞生存力，以便在轉(zhuǎn)化成可用于治療的形式的過程中使細(xì)胞群體的降解最小化。 [0010] 因此，需要用于運(yùn)輸NK-92細(xì)胞系的儲存培養(yǎng)基，使得所述細(xì)胞可以在中心場所 培養(yǎng)和制備，并分配至遙遠(yuǎn)醫(yī)院或其它治療場所，用于在接收后不久治療患者。該需要包括 這樣的方法：所述方法會在儲存和/或運(yùn)輸過程中維持NK-92細(xì)胞生存力和細(xì)胞毒性，同時 使細(xì)胞增殖最小化至發(fā)生大量聚集的點(diǎn)。本發(fā)明提供了儲存和/或運(yùn)輸未輻照的NK-92細(xì) 胞的儲存培養(yǎng)基和方法，它們滿足了這些需要。
[0011] 本發(fā)明在某些實施方案中提供了用于儲存和/或運(yùn)輸NK-92細(xì)胞系的儲存培養(yǎng)基 和方法，以便維持所述細(xì)胞的生存力和細(xì)胞毒性，用于在遠(yuǎn)離NK-92細(xì)胞的起源場所的場 所處治療患者。本發(fā)明是基于下述驚人發(fā)現(xiàn)：在有低水平的IL-2存在下和在最小可變溫度 儲存NK-92細(xì)胞，可以限制增殖，仍然阻止由增加的細(xì)胞密度引起的大量聚集，同時也維持 細(xì)胞生存力和細(xì)胞毒性。中心場所可以制備用于治療的NK-92細(xì)胞，然后在由本發(fā)明提供 的條件下運(yùn)輸所述細(xì)胞，用于遙遠(yuǎn)治療場所處的患者的治療用途，無需在治療場所處具有 專門的符合cGMP的場所。本發(fā)明因而提供了可再現(xiàn)的"貨架外'WK-92產(chǎn)品，在治療場所處 僅需要最少的細(xì)胞操作。本發(fā)明另外提供了在一致細(xì)胞生存力下將均勻NK-92細(xì)胞產(chǎn)品遞 送至目的地的方法。
[0012] 在一個方面，本文中描述的發(fā)明一般地涉及用于運(yùn)輸和/或遞送細(xì)胞的細(xì)胞儲存 培養(yǎng)基，例如，涉及用于運(yùn)輸和遞送NK-92細(xì)胞的無菌等滲NK-92細(xì)胞儲存培養(yǎng)基，所述儲 存培養(yǎng)基包含：人血清或人血清白蛋白；初始密度的未輻照的、基本上未聚集的NK-92細(xì) 胞，其在遞送至治療場所時足以提供治療量的NK-92細(xì)胞；和約200IU/mL的IL-2濃度，其 中所述培養(yǎng)基在有足以維持細(xì)胞的生存力的氧存在下維持在為運(yùn)輸選擇的溫度±5°C內(nèi)， 且進(jìn)一步其中所述為運(yùn)輸選擇的溫度是在約20°C至約40°C之間，使得所述NK-92細(xì)胞在放 入儲存培養(yǎng)基中以后多達(dá)至少24小時的時段內(nèi)保持存活以施用給患者。在一個優(yōu)選的實 施方案中，所述培養(yǎng)基中的NK-92細(xì)胞的治療量是，在遞送至治療場所時，不超過約2. 5xl06 個細(xì)胞/ml。在某些實施方案中，在運(yùn)輸過程中，將NK-92細(xì)胞密度維持在約IxlO4個細(xì)胞 /mL至約IxlO7個細(xì)胞/mL之間。在某些實施方案中，在運(yùn)輸過程中，將NK-92細(xì)胞密度維 持在約0. 5xl06個細(xì)胞/mL至約8xl06個細(xì)胞/mL之間。在某些實施方案中，將所述培養(yǎng)基 維持在為運(yùn)輸選擇的溫度±2°C內(nèi)。在某些實施方案中，所述培養(yǎng)基包含約1%至約5%人 血清或人血清白蛋白。在某些實施方案中，所述為運(yùn)輸選擇的溫度是在約25°C至約38°C之 間。在某些實施方案中，所述初始細(xì)胞密度是在約IxlO 6個細(xì)胞/ml至6xl06個細(xì)胞/ml之 間。
[0013] 在另一個方面，本文中描述的發(fā)明涉及用于運(yùn)輸未輻照的、基本上未聚集的NK-92 細(xì)胞以維持所述用于施用給患者的NK-92細(xì)胞的生存力的方法，所述生存力維持至多達(dá)放 入儲存培養(yǎng)基中以后至少24小時的時段，所述方法包括：
[0014] (a)提供無菌儲存容器；
[0015] (b)將無菌儲存培養(yǎng)基加入所述容器中，其中所述培養(yǎng)基包含人血清或人血清白 蛋白、和約200IU/mL的IL-2 ;
[0016] (C)向所述容器中加入初始密度的未輻照的、基本上未聚集的NK-92細(xì)胞，其在遞 送至治療場所時足以提供治療量的NK-92細(xì)胞；
[0017] (d)密封所述容器；
[0018] (e)將所述培養(yǎng)基維持在為運(yùn)輸選擇的溫度±5°C內(nèi)，其中所述為運(yùn)輸選擇的溫 度是在約20°C至約40°C之間；和
[0019] (f)在有足以維持細(xì)胞的生存力的氧存在下，運(yùn)輸所述NK-92細(xì)胞持續(xù)至在放入 儲存培養(yǎng)基中以后多達(dá)至少24小時的時段，
[0020] 使得所述NK-92細(xì)胞在放入儲存培養(yǎng)基中以后多達(dá)至少24小時的時段內(nèi)保持存 活以施用給患者。
[0021] 在一個優(yōu)選的實施方案中，所述培養(yǎng)基中的NK-92細(xì)胞的治療量是，在遞送至治 療場所時，不超過約2. 5xl06個細(xì)胞/ml。在某些實施方案中，在運(yùn)輸過程中，將NK-92細(xì)胞 密度維持在約IxlO 4個細(xì)胞/mL至約IxlO7個細(xì)胞/mL之間。在某些實施方案中，在運(yùn)輸過 程中，將NK-92細(xì)胞密度維持在約0. 5xl06個細(xì)胞/mL至約8xl06個細(xì)胞/mL之間。在某些 實施方案中，將所述培養(yǎng)基維持在為運(yùn)輸選擇的溫度±2°C內(nèi)。在某些實施方案中，溫度控 制裝置將儲存培養(yǎng)基維持在為運(yùn)輸選擇的溫度±5°C內(nèi)。在某些實施方案中，所述儲存容器 標(biāo)有將未輻照的NK-92細(xì)胞加入培養(yǎng)基中的日期和時間。在某些實施方案中，所述培養(yǎng)基 包含約1%至約5%人血清或人血清白蛋白。在某些實施方案中，所述為運(yùn)輸選擇的溫度是 在約25°C至約38°C之間。在某些實施方案中，所述初始細(xì)胞密度是在約IxlO 6個細(xì)胞/ml 至6xl06個細(xì)胞/ml之間。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0022] 圖1顯示了 NK-92細(xì)胞在生長培養(yǎng)基中的倍增時間。
[0023] 圖2A指示NK-92細(xì)胞的細(xì)胞毒性，所述NK-92細(xì)胞以IxlO6個細(xì)胞/mL(紅色圓 圈）或6xl06個細(xì)胞/mL (藍(lán)色正方形）的密度運(yùn)輸過夜，或者以4xl05個細(xì)胞/mL (綠色三 角形）的密度在培養(yǎng)箱中儲存過夜。圖2B指示在稀釋和靜置以后的細(xì)胞的細(xì)胞毒性。
[0024] 圖3指示以IxlO6個細(xì)胞/mL或6xl06個細(xì)胞/mL的密度運(yùn)輸過夜的NK-92細(xì)胞 的流式細(xì)胞計量術(shù)分析的結(jié)果。

【具體實施方式】
[0025] 在公開和描述本發(fā)明的組合物和方法之前，應(yīng)當(dāng)理解，下述的方面不限于特定組 合物、方法或用途，因為這些當(dāng)然可以變化。還應(yīng)該理解，本文中使用的術(shù)語僅用于描述特 定方面的目的，無意是限制性的。
[0026] 在本說明書中和在下面的權(quán)利要求書中，將提及許多應(yīng)當(dāng)定義為具有下述含義的 術(shù)語：
[0027] 必須指出，如在說明書和所附權(quán)利要求書中使用的，單數(shù)形式"一個"、"一種"和 "所述"包括復(fù)數(shù)指示物，除非上下文另外清楚地指明。
[0028] 本文中使用的術(shù)語"約"是指，值可以變化±15%，且保持在本發(fā)明范圍內(nèi)。例如， "約200IU/mL的IL-2濃度"包括在170IU/mL和230IU/mL之間的IL-2濃度。
[0029] 用于描述本發(fā)明的"天然殺傷（NK)細(xì)胞"是，在沒有特定抗原刺激存在下殺死靶 細(xì)胞的免疫系統(tǒng)細(xì)胞，且沒有根據(jù)MHC類別的限制。靶細(xì)胞可以是腫瘤細(xì)胞或攜帶病毒的 細(xì)胞。NK細(xì)胞的特征在于，⑶56的存在和⑶3表面標(biāo)志物的缺失。
[0030] 術(shù)語"內(nèi)源NK細(xì)胞"用于表示，源自供體（或患者）的NK細(xì)胞，其區(qū)別于NK-92 細(xì)胞系。內(nèi)源NK細(xì)胞通常是在其中已經(jīng)富集NK細(xì)胞的異質(zhì)細(xì)胞群體?？梢灶A(yù)見到內(nèi)源NK 細(xì)胞用于患者的自體或同種異基因治療。
[0031] 永生的NK細(xì)胞系NK-92最初得自具有非霍奇金淋巴瘤的患者。就本發(fā)明的目的 而言和除非另外指出，術(shù)語"NK-92"意圖表示原始NK-92細(xì)胞系以及已經(jīng)修飾（例如，通過 引入外源基因）的NK-92細(xì)胞系。NK-92細(xì)胞及其示例性的和非限制性的修飾描述于美國 專利號7, 618, 817、8, 034, 332和8, 313, 943,它們都通過引用整體并入本文。
[0032] 本文中使用的"未輻照的NK-92細(xì)胞"是尚未輻照的NK-92細(xì)胞。輻照會使得細(xì) 胞不能生長和增殖。預(yù)見到，在治療患者之前，將在治療場所或某個其它地點(diǎn)輻照NK-92細(xì) 胞，因為輻射和輸注之間的時間應(yīng)當(dāng)不長于4小時，以便保留最佳活性。可替換地，可以通 過另一種機(jī)制將NK-92細(xì)胞滅活。
[0033] 用于描述本發(fā)明的NK-92細(xì)胞的"滅活"會使得它們不能生長和/或不能實現(xiàn)它們 的正常功能，尤其是它們的細(xì)胞毒性活性。滅活也可能與NK-92細(xì)胞的死亡有關(guān)。預(yù)見到， 在NK-92細(xì)胞已經(jīng)在治療用途中有效地清除與病變有關(guān)的細(xì)胞的離體樣品以后，或者在它 們已經(jīng)在哺乳動物體內(nèi)停留足以有效地殺死許多或所有存在于體內(nèi)的靶細(xì)胞的時間段以 后，可以將NK-92細(xì)胞滅活。作為非限制性例子，通過施用NK-92細(xì)胞對其敏感的鈍化劑， 可以誘導(dǎo)滅活。
[0034] 本文中使用的術(shù)語"基本上未聚集的"是指，NK-92細(xì)胞密度小于對聚集具有不良 作用的密度。也就是說，NK-92細(xì)胞的密度使得，任何聚集不會實質(zhì)上改變它們的體內(nèi)效力。 預(yù)見到約IxlO 7個細(xì)胞/mL的細(xì)胞密度是當(dāng)維持適當(dāng)生存力和不聚集時的NK-92細(xì)胞密度 的上限。
[0035] 通過大于約IxlO7個細(xì)胞/mL的細(xì)胞密度，測量聚集的程度（Materiality)。在運(yùn) 輸過程中小于約IxlO 7個細(xì)胞/mL的NK-92細(xì)胞密度不會實質(zhì)上改變它們的體內(nèi)效力。由 于NK-92細(xì)胞將在儲存培養(yǎng)基中繁殖，最初加入儲存培養(yǎng)基中的細(xì)胞的量必須反映生長的 程度和將要維持儲存的時間長度。這樣的計算屬于本領(lǐng)域的技能。
[0036] 用于描述本發(fā)明的術(shù)語"細(xì)胞毒性"和"細(xì)胞裂解"當(dāng)用于描述諸如NK細(xì)胞等效 應(yīng)細(xì)胞的活性時，意圖是同義的。一般而言，細(xì)胞毒性活性涉及通過多種生物、生化或生物 物理學(xué)機(jī)制中的任一種來殺死靶細(xì)胞。細(xì)胞裂解更具體地表示這樣的活性：其中效應(yīng)物裂 解靶細(xì)胞的質(zhì)膜，由此破壞它的物理完整性。這會導(dǎo)致靶細(xì)胞的殺死。不希望受理論的約 束，據(jù)信，NK細(xì)胞的細(xì)胞毒性效應(yīng)是由于細(xì)胞裂解。
[0037] 用于描述本發(fā)明的"靶細(xì)胞"是，通過本發(fā)明的NK細(xì)胞的細(xì)胞毒性活性殺死的細(xì) 胞。這些具體地包括惡性細(xì)胞或以其它方式從癌癥衍生出的細(xì)胞，以及被致病性病毒(諸如 HIV、EBV、CMV或皰疹）感染的細(xì)胞。
[0038] 用于描述本發(fā)明的"清除"涉及效應(yīng)細(xì)胞(諸如離體NK細(xì)胞)對靶細(xì)胞的殺死。靶 細(xì)胞可以被包括在得自哺乳動物的生物樣品中，所述哺乳動物被認(rèn)為遭受與靶細(xì)胞在樣品 中的存在有關(guān)的病變。所述病變可以是由樣品中的腫瘤細(xì)胞引起的癌癥或惡性腫瘤，且可 以如下進(jìn)行治療：清除腫瘤細(xì)胞的樣品，并將所述樣品返回哺乳動物的體內(nèi)。
[0039] 用于描述本發(fā)明的"癌癥"、"腫瘤"和"惡性腫瘤"都等同地涉及組織或器官的增 生。如果所述組織是淋巴或免疫系統(tǒng)的一部分，惡性細(xì)胞可以包括循環(huán)細(xì)胞的非實體瘤。其 它組織或器官的惡性腫瘤可以產(chǎn)生實體瘤。一般而言，本發(fā)明的方法可以用于治療淋巴細(xì) 胞、循環(huán)的免疫細(xì)胞和實體瘤。
[0040] 用于描述本發(fā)明的"致病性病毒"是在宿主中造成疾病的病毒。所述致病性病毒 會感染宿主動物的細(xì)胞，并且這樣的感染的后果是宿主的健康的衰退。
[0041] 本文中使用的術(shù)語"10V'等同于10y。因此，2.5ΧΚΓ6等同于2.5x10 s或 2, 500, 000。
[0042] 本文中使用的術(shù)語"治療場所"表示所述細(xì)胞要運(yùn)送到的任何場所、醫(yī)院、診所或 其它機(jī)構(gòu)。在一個優(yōu)選的實施方案中，將所述細(xì)胞運(yùn)送至治療患者的場所。
[0043] 本文中使用的"運(yùn)輸方法"包括，從NK-92細(xì)胞最初所在的實驗室或其它場所運(yùn)輸 至治療場所的任何方法，包括但不限于道路運(yùn)輸、航空運(yùn)輸、鐵路運(yùn)輸，和在適當(dāng)時的徒步 運(yùn)輸（例如，行走）。
[0044] 為了讀者的方便，可以在說明書中使用標(biāo)題或小標(biāo)題，它們無意影響本發(fā)明的范 圍。另外，在下面更具體地定義了在本說明書中使用的一些術(shù)語。
[0045] NK-92 細(xì)朐系
[0046] Gong等人（1994)已經(jīng)描述了 NK-92細(xì)胞系。發(fā)現(xiàn)它會展示CD56bl:ight、CD2、CD7、 ⑶11a、⑶28、⑶45和⑶54表面標(biāo)志物。此外，它不展示⑶1、⑶3、⑶4、⑶5、⑶8、⑶10、 ⑶14、⑶16、⑶19、⑶20、⑶23和⑶34標(biāo)志物。培養(yǎng)中的NK-92細(xì)胞的生長依賴于重組白 介素2(rIL-2)的存在，低至llU/mL的劑量足以維持增殖。IL-7和IL-12不會支持長期生 長，試驗的其它細(xì)胞因子(包括IL-I a、IL-6、腫瘤壞死因子α、干擾素 α和干擾素 Y )也 不會。ΝΚ-92可非常有效地殺死某些腫瘤細(xì)胞，諸如Κ562(紅白血?。┖虳audi (伯基特淋 巴瘤）細(xì)胞，因為它即使在1:1的低效應(yīng)物：靶標(biāo)（Ε:Τ)比率下也具有高細(xì)胞毒性。Gong， 等人，出處同上。另外，NK-92細(xì)胞對8E5細(xì)胞具有高細(xì)胞毒性活性，所述8E5細(xì)胞被HIV 感染且產(chǎn)生HIV病毒粒子。將NK-92細(xì)胞保藏在美國典型培養(yǎng)物保藏中心（ATCC)，命名為 CRL-2407。
[0047] NK-92細(xì)胞表現(xiàn)出對寬范圍的惡性靶細(xì)胞的裂解活性。這些包括：源自循環(huán)靶 細(xì)胞(諸如急性和慢性淋巴母細(xì)胞和髓性白血病)、淋巴瘤、骨髓瘤、黑素瘤的細(xì)胞系，以及 源自實體瘤的細(xì)胞，諸如前列腺癌、神經(jīng)母細(xì)胞瘤和乳腺癌細(xì)胞系。即使在非常低的效應(yīng) 物：靶標(biāo)比率下，也觀察到該效應(yīng)。該裂解優(yōu)于從用IL-2刺激4天的正常外周血單核細(xì) 胞得到的細(xì)胞毒性。在患者中使用輻照過的NK-92細(xì)胞的早期臨床研究已經(jīng)指示良好耐 受性，具有有益效果的跡象。這些研究已經(jīng)在具有多種癌癥類型的患者中進(jìn)行，在例如腎 細(xì)胞癌癥和骨髓瘤（Arai等人，Cytotherapy 10:625-632, 2008)和肺癌（Tonn等人，J. Hematother. &Stem Cell Res. 10:535-544, 2001)中具有鼓舞人心的結(jié)果。
[0048] 鉬合物和方法
[0049] 一些實施方案一般地涉及儲存培養(yǎng)基，包括用于運(yùn)輸和/或遞送NK92細(xì)胞的培養(yǎng) 基，所述培養(yǎng)基具有一個或多個如本文中所述的參數(shù)。在一個方面，本文中描述的發(fā)明涉及 用于運(yùn)輸和遞送NK-92細(xì)胞的無菌的、等滲的NK-92細(xì)胞儲存培養(yǎng)基，所述儲存培養(yǎng)基包 含：人血清或人血清白蛋白；初始密度的未輻照的、基本上未聚集的NK-92細(xì)胞，其在遞送 至治療場所時足以提供治療量的NK-92細(xì)胞；和約200IU/mL的IL-2濃度，其中所述培養(yǎng)基 在有足以維持細(xì)胞的生存力的氧存在下維持在為運(yùn)輸選擇的溫度±5°C內(nèi)，且進(jìn)一步其中 所述為運(yùn)輸選擇的溫度是在約20°C至約40°C之間，使得所述NK-92細(xì)胞在放入儲存培養(yǎng)基 中以后多達(dá)至少24小時的時段內(nèi)保持存活以施用給患者。
[0050] 在另一個方面，本文中描述的發(fā)明涉及用于運(yùn)輸未輻照的、基本上未聚集的NK-92 細(xì)胞以維持所述用于施用給患者的NK-92細(xì)胞的生存力的方法，所述生存力維持至多達(dá)放 入儲存培養(yǎng)基中以后至少24小時的時段，所述方法包括：
[0051] (a)提供無菌儲存容器；
[0052] (b)將無菌儲存培養(yǎng)基加入所述容器中，其中所述培養(yǎng)基包含人血清或人血清白 蛋白、和約200IU/mL的IL-2 ;
[0053] (c)向所述容器中加入初始密度的未輻照的、基本上未聚集的NK-92細(xì)胞，其在遞 送至治療場所時足以提供治療量的NK-92細(xì)胞；
[0054] (d)密封所述容器；
[0055] (e)將所述培養(yǎng)基維持在為運(yùn)輸選擇的溫度±5°C內(nèi)，其中所述為運(yùn)輸選擇的溫 度是在約20°C至約40°C之間；和
[0056] (f)在有足以維持細(xì)胞的生存力的氧存在下，運(yùn)輸所述NK-92細(xì)胞持續(xù)至在放入 儲存培養(yǎng)基中以后多達(dá)至少24小時的時段，
[0057] 使得所述NK-92細(xì)胞在放入儲存培養(yǎng)基中以后多達(dá)至少24小時的時段內(nèi)保持存 活以施用給患者。
[0058] 在某些實施方案中，在運(yùn)輸過程中，將NK-92細(xì)胞密度維持在約IxlO4個細(xì)胞/mL 至約IxlO7個細(xì)胞/mL之間。在某些實施方案中，在運(yùn)輸過程中，將NK-92細(xì)胞密度維持在 約0. 5xl05個細(xì)胞/mL至約IxlO7個細(xì)胞/mL之間。在某些實施方案中，在運(yùn)輸過程中，將 NK-92細(xì)胞密度維持在約IxlO5個細(xì)胞/mL至約IxlO7個細(xì)胞/mL之間。在某些實施方案 中，在運(yùn)輸過程中，將NK-92細(xì)胞密度維持在約IxlO6個細(xì)胞/mL至約IxlO7個細(xì)胞/mL之 間。在某些實施方案中，在運(yùn)輸過程中，將NK-92細(xì)胞密度維持在約2xl05個細(xì)胞/mL至 約IxlO 7個細(xì)胞/mL之間。在某些實施方案中，在運(yùn)輸過程中，將NK-92細(xì)胞密度維持在約 IxlO4個細(xì)胞/mL至約9xl06個細(xì)胞/mL之間。在某些實施方案中，在運(yùn)輸過程中，將NK-92 細(xì)胞密度維持在約IxlO 4個細(xì)胞/mL至約8xl06個細(xì)胞/mL之間。在某些實施方案中，在運(yùn) 輸過程中，將NK-92細(xì)胞密度維持在約IxlO 4個細(xì)胞/mL至約6xl06個細(xì)胞/mL之間?？梢?將NK-92細(xì)胞維持在這些范圍中的任意范圍內(nèi)的任意密度，包括端點(diǎn)。
[0059] 在某些實施方案中，NK-92細(xì)胞的初始密度是在約0. 5xl04個細(xì)胞/ml至約9xl06 個細(xì)胞/ml之間。在某些實施方案中，NK-92細(xì)胞的初始密度是在約IxlO5個細(xì)胞/ml至 約9xl0 6個細(xì)胞/ml之間。在某些實施方案中，NK-92細(xì)胞的初始密度是在約IxlO6個細(xì)胞 /ml至約9xl0 6個細(xì)胞/ml之間。在某些實施方案中，NK-92細(xì)胞的初始密度是在約IxlO6 個細(xì)胞/ml至約8xl06個細(xì)胞/ml之間。在某些實施方案中，NK-92細(xì)胞的初始密度是在約 IxlO6個細(xì)胞/ml至約7xl06個細(xì)胞/ml之間。在某些實施方案中，NK-92細(xì)胞的初始密度 是在約IxlO 6個細(xì)胞/ml至約6xl06個細(xì)胞/ml之間。NK-92細(xì)胞的初始密度可以是在這 些范圍中的任意范圍內(nèi)的任意密度，包括端點(diǎn)。
[0060] 在某些實施方案中，所述為運(yùn)輸選擇的溫度是在約20°C和約40°C之間。在一個優(yōu) 選的實施方案中，所述為運(yùn)輸選擇的溫度是在約25°C和約38°C之間。在某些實施方案中， 所述為運(yùn)輸選擇的溫度是在約20°C和約25°C之間。在某些實施方案中，所述為運(yùn)輸選擇的 溫度是約室溫。在某些實施方案中，所述為運(yùn)輸選擇的溫度是約37°C。
[0061] 在某些實施方案中，將所述培養(yǎng)基維持在為運(yùn)輸選擇的溫度±5°C內(nèi)。在某些實施 方案中，將所述培養(yǎng)基維持在為運(yùn)輸選擇的溫度±4°C內(nèi)。在某些實施方案中，將所述培養(yǎng) 基維持在為運(yùn)輸選擇的溫度±3°C內(nèi)。在某些實施方案中，將所述培養(yǎng)基維持在為運(yùn)輸選擇 的溫度±2°C內(nèi)。在某些實施方案中，將所述培養(yǎng)基維持在為運(yùn)輸選擇的溫度±1°C內(nèi)。
[0062] 在某些實施方案中，溫度控制裝置將儲存培養(yǎng)基維持在為運(yùn)輸選擇的溫度±5°C 內(nèi)。這樣的溫度控制裝置是本領(lǐng)域已知的。示例性的溫度控制裝置包括：加熱至期望溫度 的凝膠包、便攜式運(yùn)輸培養(yǎng)箱、生物反應(yīng)器或本領(lǐng)域已知的任意其它合適的裝置。
[0063] 在某些實施方案中，所述NK-92細(xì)胞在放入儲存培養(yǎng)基中以后多達(dá)至少24小時的 時段內(nèi)保持存活以施用給患者。在某些實施方案中，所述NK-92細(xì)胞在放入儲存培養(yǎng)基中 以后多達(dá)約14小時的時段內(nèi)保持存活以施用給患者。在某些實施方案中，所述NK-92細(xì)胞 在放入儲存培養(yǎng)基中以后多達(dá)約20、16、12、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1小時的時段內(nèi)保持存 活以施用給患者。在某些實施方案中，所述NK-92細(xì)胞在放入儲存培養(yǎng)基中以后大于24小 時的時段內(nèi)保持存活以施用給患者。在某些實施方案中，所述NK-92細(xì)胞在放入儲存培養(yǎng) 基中以后多達(dá)約36、48、60或72小時的時段內(nèi)保持存活以施用給患者。
[0064] 在某些實施方案中，在到達(dá)治療場所以后，可以將NK-92細(xì)胞儲存一段時間。例 如，可以在所述場所儲存和/或培養(yǎng)NK-92細(xì)胞，然后實現(xiàn)操作以將NK-92細(xì)胞注射進(jìn)患 者。在一個實施方案中，在遞送以后，用生長培養(yǎng)基（例如，含有更高濃度的IL-2)替換儲 存培養(yǎng)基。在一個實施方案中，將額外培養(yǎng)基加給NK-92細(xì)胞進(jìn)行儲存；也就是說，NK-92 細(xì)胞的密度降低。在一個實施方案中，在遞送至所述場所以后，將NK-92細(xì)胞儲存12小時、 24小時、36小時或48小時。在一個實施方案中，NK-92細(xì)胞的儲存條件取決于細(xì)胞密度、 細(xì)胞生長、細(xì)胞生存力、IL-2水平或它們的任意組合。
[0065] 在某些實施方案中，所述培養(yǎng)基包含人血清或其等效物。在某些實施方案中，所述 培養(yǎng)基包含人血清白蛋白。在某些實施方案中，所述培養(yǎng)基包含人血漿。在某些實施方案 中，所述培養(yǎng)基包含約1%至約15%人血清或人血清等效物。在某些實施方案中，所述培養(yǎng) 基包含約1%至約10%人血清或人血清等效物。在某些實施方案中，所述培養(yǎng)基包含約1% 至約5%人血清或人血清等效物。在一個優(yōu)選的實施方案中，所述培養(yǎng)基包含約2. 5%人血 清或人血清等效物。在某些實施方案中，所述血清是人AB血清。在某些實施方案中，使用 可接受的用于人治療劑中的血清替代物來替代人血清。這樣的血清替代物可以是本領(lǐng)域已 知的，或者在將來開發(fā)出。盡管可以使用超過15%的人血清濃度，預(yù)見到，大于約5%的濃度 將是成本過高的（cost-prohibitive)。
[0066] 在本文所述發(fā)明中使用的儲存容器可以是任意細(xì)胞儲存容器。在某些實施方案 中，所述儲存容器可以是本領(lǐng)域已知的任意儲存容器。在某些實施方案中，所述儲存容器是 氧可透過的袋。在某些實施方案中，所述儲存容器是組織培養(yǎng)瓶。在某些實施方案中，所述 儲存容器是氧可透過的燒瓶。這樣的燒瓶的一個例子是，由Wilson Wolf Manufacturing 制造的G-Rex燒瓶。在某些實施方案中，所述儲存容器是氧不可透過的袋，其在頂空中具有 足夠的氧以在運(yùn)輸過程中維持細(xì)胞的生存力。
[0067] 在某些實施方案中，所述儲存容器標(biāo)有信息。在一個優(yōu)選的實施方案中，所述儲存 容器標(biāo)有關(guān)于將NK-92細(xì)胞放入儲存培養(yǎng)基中的日期和時間的信息。標(biāo)記容器的方法是本 領(lǐng)域眾所周知的。在某些實施方案中，所述標(biāo)記是條形碼。在某些實施方案中，所述標(biāo)記是 射頻識別（RFID)標(biāo)簽。在某些實施方案中，所述標(biāo)記是二維條形碼。在某些實施方案中， 所述標(biāo)記是快速應(yīng)答（QR)代碼。在某些實施方案中，所述標(biāo)記是手寫的、打字的或蓋印的。 在某些實施方案中，采用多種標(biāo)記方法。
[0068] 在本申請中使用下述縮寫：
[0069]

【權(quán)利要求】
1. 一種用于運(yùn)輸和遞送NK-92細(xì)胞的無菌的、等滲的NK-92細(xì)胞儲存培養(yǎng)基，所述儲存 培養(yǎng)基包含： (i)人血清或人血清白蛋白； (ii)初始細(xì)胞密度的未輻照的、基本上未聚集的NK-92細(xì)胞，所述NK-92細(xì)胞在遞送至 治療場所時足以提供治療量的NK-92細(xì)胞；和 (iii)約200IU/mL的IL-2濃度， 其中所述培養(yǎng)基在有足以維持所述細(xì)胞的生存力的氧存在下維持在為運(yùn)輸選擇的溫 度±5°C內(nèi)，且進(jìn)一步其中所述為運(yùn)輸選擇的溫度是在約20°C至約40°C之間，使得所述 NK-92細(xì)胞在放入所述儲存培養(yǎng)基中以后多達(dá)至少24小時的時段內(nèi)保持存活以施用給患 者。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的儲存培養(yǎng)基，其中在運(yùn)輸過程中，將所述NK-92細(xì)胞密度維持 在約lxlO4個細(xì)胞/mL至約lxlO7個細(xì)胞/mL之間。
3.根據(jù)權(quán)利要求3所述的儲存培養(yǎng)基，其中在運(yùn)輸過程中，將所述NK-92細(xì)胞密度維持 在約0. 5xl06個細(xì)胞/mL至約8xl06個細(xì)胞/mL之間。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的儲存培養(yǎng)基，其中所述初始細(xì)胞密度是在約lxlO6個細(xì)胞/ ml至6xl06個細(xì)胞/ml之間。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的儲存培養(yǎng)基，其中將所述培養(yǎng)基維持在所述為運(yùn)輸選擇的溫 度±2°C內(nèi)。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的儲存培養(yǎng)基，其中所述培養(yǎng)基包含約1%至約5%人血清或人 血清白蛋白。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的儲存培養(yǎng)基，其中所述為運(yùn)輸選擇的溫度是在約25°C至約 38°C之間。
8. -種用于運(yùn)輸未輻照的、基本上未聚集的NK-92細(xì)胞以維持用于施用給患者的所述 NK-92細(xì)胞的生存力的方法，所述生存力維持至多達(dá)放入儲存培養(yǎng)基中以后至少24小時的 時段，所述方法包括： (a)提供無菌儲存容器； (b)將無菌儲存培養(yǎng)基加入所述容器中，其中所述培養(yǎng)基包含人血清或人血清白蛋白 和約200IU/mL的IL-2 ; (c)向所述容器中加入初始密度的未輻照的、基本上未聚集的NK-92細(xì)胞，所述NK-92 細(xì)胞在遞送至治療場所時足以提供治療量的NK-92細(xì)胞； (d)密封所述容器； (e)將所述培養(yǎng)基維持在為運(yùn)輸選擇的溫度±5°C內(nèi)，其中所述為運(yùn)輸選擇的溫度是 在約20°C至約40°C之間；和 (f)在有足以維持所述細(xì)胞的生存力的氧存在下，運(yùn)輸所述NK-92持續(xù)至在放入所述 儲存培養(yǎng)基中以后多達(dá)至少24小時的時段， 使得所述NK-92細(xì)胞在放入所述儲存培養(yǎng)基中以后多達(dá)至少24小時的時段內(nèi)保持存 活以施用給患者。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其中在運(yùn)輸過程中，將所述NK-92細(xì)胞密度維持在約 lxlO4個細(xì)胞/mL至約lxlO7個細(xì)胞/mL之間。
10. 根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其中在運(yùn)輸過程中，將所述NK-92細(xì)胞密度維持在約 0. 5xl06個細(xì)胞/mL至約8xl06個細(xì)胞/mL之間。
11. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其中所述初始密度是在約lxlO6個細(xì)胞/ml至6xl06 個細(xì)胞/ml之間。
12. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其中將所述培養(yǎng)基維持在所述為運(yùn)輸選擇的溫度 ±2°C內(nèi)。
13. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其中溫度控制裝置將所述儲存培養(yǎng)基維持在所述為 運(yùn)輸選擇的溫度±5 °C內(nèi)。
14. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其中所述儲存容器標(biāo)有將所述NK-92細(xì)胞加入所述儲 存培養(yǎng)基中的日期和時間。
15. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其中所述培養(yǎng)基包含約1%至約5%人血清或人血清白 蛋白。
16. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其中所述為運(yùn)輸選擇的溫度是在約25°C至約38°C之 間。
【文檔編號】A01N1/02GK104509529SQ201410004944
【公開日】2015年4月15日 申請日期:2014年1月3日 優(yōu)先權(quán)日:2013年10月8日
【發(fā)明者】漢斯·G·克林格曼, 巴里·J·西蒙 申請人:康克韋斯特公司