用于分析大型植物群體中母體dna的方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種用于分析種子的母體DNA的非破壞性方法。在該方法中，所述DNA從種皮表面脫落并可用于收集關于種子的母體親本的基因組的信息。另外，本發(fā)明提供了一種用于大型植物群體的高通量DNA分析系統(tǒng)。
【專利說明】用于分析大型植物群體中母體DNA的方法 發(fā)明領域
[0001] 本發(fā)明涉及一種用于分析種子的母體DNA的方法，W及所述方法的用途。
[0002] 發(fā)明背景
[0003] 植物育種化reeding)依賴于存在于具體作物物種生殖質中的遺傳變異的有效開 發(fā)，并且所述遺傳變異決定了植物在特定環(huán)境的表型。傳統(tǒng)上該是通過在表型水平觀察到 的所期望的性狀組合的選擇來實現(xiàn)的，但該可W逐漸通過基于在遺傳上與促成特異性狀表 達的基因的等位基因型緊密連鎖的分子標記的選擇來進行。
[0004] 對于W隱性性狀方式表現(xiàn)自身的性狀，表型水平的性狀的選擇是復雜的。當親本 之一對于一個給定的基因具有一個隱性和一個顯性等位基因，并且另一個親本對于同一基 因具有兩個顯性等位基因時，該兩個親本雜交的結果會是該樣的群體，其中一在不存在 分離異常（segregationdistcxrtion)的情況下-一半的個體攜帶該基因的一個隱性等 位基因。然而，該些個體無法被識別，因為所期望的隱性性狀不會在雜合子的情況下表達自 己。只有在自交并在下一代中分析子代才能確定哪個個體攜帶隱性等位基因，并因而確定 哪個個體是雜合的。
[0005] 通常，植物育種者或研究者希望通過盡可能早地在植物群體中鑒定感興趣的等位 基因來盡可能快地進行工作。在許多情況下，確定產(chǎn)生特定種子的母本植物的遺傳組成是 特別有意義的。因此，本發(fā)明的一個目的是提供一種檢查種子的母體親本的基因組的有效 和非破壞性的方法。
[0006] 在導致本發(fā)明的研究中，令人梅訝地發(fā)現(xiàn)，少量DNA存在于種皮表面，并且該DNA 與產(chǎn)生該種子的母體親本的DNA是相同的。該DNA可W通過將種子接觸流體而從種皮表面 脫落，隨后該流體包含脫落的DNA，其可采用靈敏的分子生物學分析技術針對例如特定分子 標記進行分析。重要的是，該方法是非破壞性的，因為在已經(jīng)接觸流體之后可W將種子干 燥，并且膽存而不損失萌發(fā)能力和活力。因此，該方法允許種子的母體親本的遺傳學和分子 生物學分析，而不損傷種子或削弱其萌發(fā)能力。
[0007] 因此，本發(fā)明涉及一種用于分析種子的母體DNA的非破壞性方法，包括W下步驟： 將種子與流體接觸W從種皮表面脫落DNA，并分析從所述種皮表面脫落的DNA。
[0008] 分析DNA的技術正發(fā)展得非常迅速，并且它們正變得愈發(fā)有效和靈敏。該些高度 靈敏的DNA分析方法僅要求非常少量的DNAW產(chǎn)生可靠的信號。導致本發(fā)明的該研究證實 該種少但可檢測量的DNA位于種皮表面。
[0009] 種皮由退化的胚珠珠被（其為母體組織）發(fā)育而來。二倍體植物的種皮的倍性為 2n，在遺傳上它與種子的母體親本相同，即種子發(fā)生和發(fā)育的那個親本。
[0010] 現(xiàn)有技術中存在各種用于分析來自植物或種子的DNA的技術。它們彼此主要區(qū)別 在于收集生物材料的方式，為此所用的是何種組織或植物器官，W及進行取樣的是哪個發(fā) 育階段。在商業(yè)環(huán)境中，在不必在其整個生命周期中種植植物W產(chǎn)生下一代的種子，或優(yōu)選 甚至根本無需萌發(fā)種子并種植植物的情況下獲得遺傳材料用于分析（例如通過分子標記 分析或DNA測序的方式）是有利的。因此，人們希望從非常早的發(fā)育階段收集DNA，而不危 害幼苗（plantlet)的存活和正常的進一步發(fā)育。
[0011] 傳統(tǒng)上想要從種子獲得遺傳信息，要么種子不得不被破壞（destroyed)、被損傷 (damaged),要么種植成植物，其后種子或植物組織可W用于DNA提取。但是，本發(fā)明提供了 一種從種皮獲得DNA的非破壞性和非侵入性的方法，其中可W收集關于該種子的母體親本 的遺傳信息，而不削弱種子萌發(fā)并發(fā)育成下一代植物的能力。
[0012] 傳統(tǒng)上萌發(fā)種子并種植成苗，隨后在允許收獲足夠大的組織片段而不會對幼苗導 致嚴重傷害的發(fā)育階段收集苗的組織。DNA提取后，通過利用分子標記進行所期望的個體的 鑒定?；谒鼈?nèi)狈σ粋€或多個特定分子標記，剩余的植物（其可能代表取樣群體的非常 大的部分）被育種者相對他的有針對性的目的而鑒定為不期望的植物。該些不期望的植物 將會被丟棄，僅僅因為它們在種植設備中占用了寶貴的空間。
[0013] 用于從幼苗獲得DNA的另一種方法包括從萌發(fā)的種子收集分離的根邊緣細胞（歐 洲專利申請EP-1984496)。因為不需要植物組織，基本上不存在對幼苗的損傷，并且該方法 的速度和效率非常高，而成本較低。但是，該方法仍然要求種子的萌發(fā)W從胚根或根收集根 邊緣細胞，該需要種植空間。
[0014] 可選地，可W從種子提取DNA，然后可W分析W確定該種子如果播種了將會長成 的植物的基因型。提取DNA的最常用的操作涉及W某種其它方式破碎（crushing)、研 磨（grinding)或破壞所述種子，從而不可能仍然利用本可從該特定種子長成的特定植 物個體。另一種方法涉及通過例如切割裝置（device)或激光束W該種子仍然保持活力 并且W后可W種植的方式切掉種子的一小部分，包括胚乳（但不包括胚）。該些方法是 例如在W下文獻中所述的；歐洲專利申請EP2200419和W02011/082316、W02011/119763、 W02011/163326W及W02011/163362。
[0015] 該些技術要求精密的和復雜的裝備（equipment),因為種子需要W精確和高度可 重復性的、一致的方式定位，并精也切割從而不會嚴重損傷胚，在組織收獲過程后應當仍然 可W從其中發(fā)育出植物。每一方法均需要大量技術和實驗開發(fā)、優(yōu)化和測試時間，直到能夠 有可能對任何給定的植物物種獲得可靠的和有用的結果。
[0016] 一個具體困難是事實上即便單一物種的種子也并不總是具有完全相同的性狀、 大小和重量，例如由于遺傳和/或環(huán)境變量所致，并且該使得該些自動化高通量種子碎裂 (chipping)方法的實際應用進一步復雜化，即使是針對單一物種的種子。尤其是對于圓種 子的物種，該樣的自動化方法非常難W標準化和優(yōu)化，因為具有該樣形狀的種子內(nèi)的胚的 確切位置是無法預測的。切掉該樣的種子的隨機部分很容易會造成胚的損傷和取樣的種子 中的高死亡率，而該正是人們希望非破壞性的方法去避免的，所述方法用于選擇帶有期望 的基因型變體的種子W隨后將它們長成植物。
[0017] 在本發(fā)明中，從植物種子的種皮表面獲得母體DNA。大部分植物的種子，包括單子 葉植物（如谷物）W及雙子葉植物（豆類和許多蔬菜屬于雙子葉植物），由H個不同的層或 成分組成。該些部分中的每一個都有自己特定的倍性和發(fā)育起源。
[0018]胚，其將最終發(fā)育成為新的植物，是二倍體（2n)，具有一套母體和一套父體的染色 體。母體染色體組是由單倍體卵細胞提供的，而父體組由單倍體精細胞提供，當卵細胞通過 花粉管受精時其被運送至胚囊。
[0019]胚乳，通常形成發(fā)育胚的營養(yǎng)來源，大多數(shù)情況下是H倍體（3n)，具有兩套母體和 一套父體染色體。它起源于當二倍體中央細胞與第二個單倍體精細胞融合時，當卵細胞通 過花粉管受精時其被運送至胚囊。
[0020] 種子的外層是種皮或外種皮（testa)。它由退化的母體胚珠珠被發(fā)育并因此與母 本的母體化基因組相同，而沒有來自父本的花粉的任何貢獻。
[0021] 由于在倍性和起源中的該些區(qū)別，取決于所檢查的組織層的類型，種子組織的分 析可W產(chǎn)生不同的結果并可用于各種目的。完整種子或其包含胚乳和/或胚的部分的檢查 獲得有關其可W產(chǎn)生的植物的基因型的信息。該基因型包含母體W及父體的遺傳信息。種 皮的研究具體地獲得關于種子所起源的母體親本的基因組的數(shù)據(jù)。但是，現(xiàn)有技術教導了 從種皮獲得DNA在技術上是非常困難的。種皮的物理去除是非常乏味W及精確的活動，并 且其僅產(chǎn)生非常少量的組織。隨后，DNA需要從該組織提取，之后可W對其進行測定。通常， 種皮組織的去除會嚴重損傷種子，它們通常會無法再用了，肯定不會用于商業(yè)目的。
[0022] 本發(fā)明提供了一種從種皮表面獲得DNA的有效的和非破壞性的方法。該DNA與種 子的母體親本的DNA相同。該樣獲得的DNA可用于收集有關種子的母體親本的基因組的信 息。母體親本的基因組包括母體親本植物的核基因組和細胞質（細胞器）基因組。
[002引植物或植物組織的倍性是由核染色體數(shù)目確定的。但是，一些基因存在于核外DNA上，其可W在特定的胞質細胞器（如葉綠體和線粒體）中找到。胞質細胞器存在于細胞的 細胞質中，其圍繞細胞的細胞核。在許多細胞中，細胞器大量存在，由于在該樣的細胞中細 胞器DNA的高拷貝數(shù)使得很容易檢測細胞器DNA。帶有細胞器的細胞質例如存在于卵細胞 中，其是由母本產(chǎn)生的配子。
[0024] 當卵細胞由通過花粉管遞送到胚囊的來自父本植物的兩個精細胞（另稱為"生殖 細胞（generativecell)")之一受精時，通常沒有花粉粒的細胞質（包含父本植物的細胞 器）與精子細胞核一起轉移。幾乎在所有情況下，在兩個生殖細胞中完全不存在細胞器，其 原因是因為在花粉發(fā)育過程中發(fā)生的第一次花粉有絲分裂期間細胞器的不對稱分布。該種 不對稱的第一次花粉有絲分裂導致形成一個大的營養(yǎng)核和一個小的生殖核。由此，營養(yǎng)細 胞通常會保留所有小抱子的細胞器及其幾乎所有細胞質，而生殖細胞通常只接收非常少量 的細胞質，并且不接受細胞器。
[0025] 后來在花粉發(fā)育中，生殖細胞一其存在于營養(yǎng)細胞的細胞質內(nèi)一再次分裂 (第二次花粉有絲分裂），產(chǎn)生兩個生殖細胞。因此，當卵細胞由來自父本植物的兩個生殖 細胞之一受精時，該導致帶有唯一母體起源的細胞質細胞器的合子，W及由來自親本雙方 基本上平等貢獻組成的核基因組。因此，父本僅貢獻核DNA給受精卵，但沒有細胞器DNA。 因而，核外DNA只通過母體親本繼承。該個過程被稱為細胞質遺傳。
[0026] 可W在細胞質中發(fā)現(xiàn)幾個重要的植物育種基因，包括在幾個植物物種中的雄性不 育基因。如實施例2所述，細胞質雄性不育（CM巧基因可W例如僅通過母本被繼承。
[0027] 有許多有趣的特征可W從分析種子的母體DNA確定。有關種子的母體親本的信 息（即有關母體貢獻給種子基因組的信息）可W產(chǎn)生關于種子起源的數(shù)據(jù)。此類信息 對系統(tǒng)發(fā)生分析和其它進化研究或對散布的種子進行追蹤W評估種子移動是非常有用 的。例如，在某些研究領域中，通過比較種皮DNA而追蹤由鳥類散布的種子。通過鑒定哪 些種子起源于同一母體，可W跟蹤種子離開該母體植物（例如個體樹）的移動，并且可W 建立不同種子池內(nèi)和之間的遺傳變異（例如地理上的不同HGrivetetal. (2005),Mol. Ecol. 14:3585-3595)。然而，從種皮收集DNA是非常麻煩的，因為現(xiàn)有技術中的方法均涉及 從種子物理去除種皮。
[0028] 如果父本的身份（identity)未知，則雜交基因組的母體成分的信息（除了該雜交 基因組本身的遺傳組成信息之外的）也可用于推導有關種子的父本的遺傳身份和基因組 性質的信息。
[0029] 商業(yè)種子公司有其它原因而對獲得有關種子的母體親本信息的可能性有興趣。一 項重要的商業(yè)應用是本發(fā)明在種子的質量控制中的用途。
[0030] 當商業(yè)植物品種的種子大規(guī)模生產(chǎn)時，許多不同品種通常同時并同地產(chǎn)生。顯然 在該過程中可能發(fā)生錯誤，并存在一定的污染的風險。有可能錯誤的親本被用于某種生產(chǎn)， 或所使用的親本仍然包含不期望的遺傳變異。另外，在種子的收獲和進一步加工過程中可 能發(fā)生混合。因為對種植者來說種子對于某種作物是必不可少的原料，最重要的是種植者 確實得到他在種子公司訂購并預期收到的東西。因此，質量控制是種子公司的一個重要職 責，W確保其客戶收到盡可能高質量和一致性的種子。
[0031] 此外，取決于所用方法，質量控制活動需要大量的時間、空間和/或金錢，它們可 W顯著推遲大量的商業(yè)種子進入市場。因此，非常重要的是，在該過程中盡可能早和盡可 能快地獲得關于可能的雜質的信息。種子批次中的雜質可能來自不同原因。母體核酸 的分析可用于確定特定的種子是否來自正確的母體植物，并從而確定種子批次是否是均 一的。可W通過分析種子的母本基因型鑒定的可能的問題是錯誤的種子身份、在種子生 產(chǎn)過程中的各個階段可能已經(jīng)發(fā)生的種子批次的混合（例如親本系的種植、授粉/施服 (fertilisation)、收獲W及種子的裝袋）W及母體親本的非均一性或非純合性。
[0032] 對大量商業(yè)種子進行質量控制W檢查種子的生產(chǎn)批次的身份、純度和均一性?？?WW各種方式實現(xiàn)質量控制，例如通過分子方法或通過種子的代表性樣品的表型的體內(nèi)觀 察。任意一種方法會導致一定量的寶貴種子的損失，因此該操作是破壞性的并且進行過操 作的種子不能再進行銷售。本發(fā)明允許來自種子的母體DNA的非破壞性取樣，而不削弱種 子的活力或萌發(fā)能力。因此，在已經(jīng)發(fā)生取樣后種子仍然可W儲存、萌發(fā)并在市場上銷售。 該個特征使得本發(fā)明特別適合于質量控制目的。該應用如實施例4所示。
[0033] 種子母體DNA的特定分析的另一個重要應用在于在大型植物群體中鑒定遺傳變 異。一個例子是誘變的植物群體，如通常在例如T比LING方法中獲得的。個體或成批種子的 母體基因組的分析可W大大減少鑒定攜帶期望的遺傳變異的植物個體所需的時間、成本、 勞動力和種植空間。該如實施例5所示。
[0034] 本發(fā)明提供了一種用于分析種子的母體DNA的非破壞性方法，包括W下步驟：將 種子與流體接觸W從種皮表面脫落DM，并分析從所述種皮表面脫落的DNA。所述種子與所 述流體的接觸優(yōu)選在容器中實現(xiàn)，其允許從所述流體輕松取樣W及取樣過程的自動化。
[0035] 根據(jù)本發(fā)明，來自種皮表面的DNA是W非破壞性的方式獲得的，包括將該種子與 流體接觸。非破壞性意味著該種子沒有W任何方式被破碎或被損傷，從而它保持其萌發(fā)和 生成植物的能力。
[0036] 本發(fā)明的"種子的母體DNA"包括產(chǎn)生該種子的母體植物的基因組DNA。該DNA可 W是核和/或細胞質來源的，并且它允許例如鑒定產(chǎn)生所述種子的母體植物，W及鑒定對 種子基因組的母體貢獻?？赏ㄟ^不同核酸分析技術檢查該母體DNA，優(yōu)選采用高度靈敏的檢 測方法。該些分析技術是本領域技術人員公知的。
[0037] 種子和流體之間的接觸是通過將所述種子浸在所述流體中或通過將所述種子漂 浮在所述流體上實現(xiàn)的。任選地，可W輕輕攬拌在所述流體內(nèi)的種子W促進DNA脫落進所 述流體。但是，該對于獲得種皮DNA并不總是必需的。還可W用流體漂洗所述種子。與種 子接觸或用來漂洗的流體是水溶液，如水或緩沖液。
[0038] 在流體中或流體上一段短時間之后，種子可W或者從流體中取出，或者留在流體 內(nèi)。優(yōu)選立即分析現(xiàn)在含有種皮DNA的流體。本發(fā)明中"一段短時間"是指比吸漲（imbibe) 種子并不可逆地觸發(fā)萌發(fā)所需的時間顯著更短的一段時間。合適的時間是在30砂至30分 鐘之間，優(yōu)選在1至15分鐘之間，更有選在2至5分鐘之間。
[0039] 如果種子從流體中取出，該種子可W干燥并儲存。如果在種皮DNA已經(jīng)收集之后 立即取出并干燥回來，則本方法并不影響該種子的萌發(fā)能力。因此，通過采用本發(fā)明的方 法，所分析的種子沒有被損傷，并且，如果需要的話，之后它仍然可W儲存、萌發(fā)并市售和使 用。
[0040] 已經(jīng)與種子接觸的流體含有來自種皮表面的DNA。該DNA起源于種子的母體親本。 該母體DNA可用于分析所期望的任何遺傳信息。因此，種子的母體親本的基因組（核和細 胞器二者的）可W通過分析由所述母體親本植物產(chǎn)生的種子的種皮表面所獲得的母體DNA 來進行檢查。該可W用于例如確認屬于一批種子的個體種子是由遺傳上的同一母體植物產(chǎn) 生的，或檢測屬于一批種子的個體種子的不同母體來源。該些應用在例如商業(yè)種子生產(chǎn)的 過程中或之后的質量控制的情況下是有用的。
[0041] 因此，本發(fā)明提供了一種用于通過分析母體DNA檢查種子的母體基因組的方法， 所述母體DNA對應于產(chǎn)生該種子的母體植物的DNA。因此，對種子基因組的母體貢獻可從 所獲得的關于母體植物的基因組組成的信息推導出來，并且可W鑒定產(chǎn)生該種子的母體植 物。在本發(fā)明的方法中，種子的母體DNA通過將種子與流體接觸W從種皮表面脫落DNA而 獲得，并且隨后可將從種皮表面脫落的DNA用于分析。
[0042] 本發(fā)明的方法不需要任何組織取樣或DNA提取方法，除了與流體接觸。此外，也不 需要特殊的裝備，除了DNA分析裝備。因此，所提出的方法是高效并且具有成本效益的。
[0043] 取決于所使用的DNA分析方法，從干燥的種子開始，可W在20分鐘之內(nèi)獲得結果， 該使得獲得種子的遺傳信息及其母體起源是一個極其快速的操作。重要的是，實施本發(fā)明 無需種子的萌發(fā)，并且該方法可W應用于具有種皮的所有植物物種，而無需對操作步驟進 行重大修改。針對不同植物物種對本方法優(yōu)化僅僅涉及將種皮DNA脫落至周圍液體介質可 能需要的攬拌頻率和/或持續(xù)時間的微小變化。因此，該方法能夠非?？焖俚貙碜苑N子 的母體親本的DNA或種子群體的母體親本的DNA取樣，所述DNA隨后可采用標準DNA分析 方法進行分析。
[0044] 本發(fā)明的方法可W按比例放大至高通量設置，該樣能夠從大量平行個體種子的或 從大量個體種子批次同時分離母體DNA。在此情況下，所述方法可W是自動化的或機器人化 的，導致在從植物群體進行DNA分離操作的所有步驟中非常顯著地降低了成本和勞動力。 含有流體（種皮的DNA脫落在其中）的容器可W是多管形式或微板或大板形式的一部分， 其與用于高通量分析大型植物群體中的母體DNA的自動化系統(tǒng)兼容。在該樣的自動化設置 中，可W平行分析許多種子。因此，該方法特別適用于篩選大型群體的種子，并且它可W很 容易地應用于例如質量控制和植物育種。
[0045] 因此，根據(jù)本發(fā)明的另一方面，本發(fā)明還涉及一種用于大型植物群體的高通量DNA 分析系統(tǒng)，包括布置成用于將一個或多個種子與流體接觸W從種皮表面脫落DNA的容器陣 列，W及用于分析從所述種皮表面脫落的DNA的裝置。該系統(tǒng)尤其適用于分析母體DNA。
[0046] 在高通量設置中，多個容器可W排列成一排，或W多孔板形式布置，并且在該些容 器的每一個中，種子可W與流體接觸。
[0047] 本發(fā)明的方法的自動化包括W下自動化步驟：將個體種子與流體（其位于容器 中）接觸，任選地，攬拌流體W促進種皮DNA的脫落，從流體取出種子，W及任選地干燥種 子。任選地，同樣的自動化設置還可W進行收集含有種皮DNA的流體用于進一步分析的步 驟，W及任選地還可W進行所述DNA的實際的分子分析。種子還可W被自動化地加入到容 器內(nèi)的流體中。
[0048] 可W設想所要求保護的方法的另一個高通量應用，包括多于一個種子與單個容器 中的流體接觸，并且隨后進行所述方法的步驟。該應用能夠同時分析多個種子的母體DNA， 例如商業(yè)種子批次的代表性樣品，或從一個母本植物或一組母本植物收獲的種子的代表性 樣品。它允許在該樣的種子批次中篩選遺傳變異，目的是例如驗證該種子批次中所包括的 種子的母本植物或那些母本植物的均一性和身份，或鑒定含有有趣的遺傳變異的種子批次 (例如在TILLING群體中，其中來自一個突變植物或一些突變植物的種子可W在一批中一 起分析，并篩選母體植物中感興趣的基因組區(qū)域內(nèi)特定遺傳變異的存在。該允許有效鑒定 突變植物中的突變，所述突變能夠傳遞給下一代一即所分析的種子批次的種子一即便 該些突變W低頻率發(fā)生，并且無需破壞性組織取樣，如實施例5中所解釋的）。
[0049] 本發(fā)明將在下面的實施例進一步說明。在實施例中參考了下列附圖：
[0050] 圖1顯示通過種皮DNA中所檢測到的CMS標記的方式，檢測在一批雄性不育甘藍 種子中污染的可育甘藍子代（progeny)。
[0051] 圖2在上圖中顯示了當對本發(fā)明的所述方法所獲得的DNA進行測試時，對核標記 所獲得的標記分數(shù)（英光點）。除了純合的AA(綠色?，父體等位基因）和雜合的AB(藍色 O)對照樣品分數(shù)之外，所有樣品得分為純合的BB(紅色□，母體等位基因），該證實了利 用本發(fā)明的所述方法所獲得的DNA樣品中只有該核標記的母體等位基因可被檢測到。相比 較而言，圖2的下圖顯示了當對從相同種子采用標準的、破壞性DNA分離方法提取的基因組 DNA進行測試時，對相同核標記所獲得的結果。該分離清楚地導致了雜合DNA的分離，因為 在該測試中所有實驗樣品對該核標記得分為雜合（藍O)。 實施例
[0052] 實施例1
[0053] 從甘藍炬rassicaoleracea)種子的種皮獲得DNA
[0054] 92個甘藍種子置于96孔板中，然后加入50U1無菌MiIliQ水。將板密封，并在涂 料攬拌器（paintmixer)中攬拌2分鐘。隨后，采用96孔PCR板中的高靈敏度DNA檢測分 析（ABgene),立即將5y1的水用于DNA分析。采用該方法獲得的種皮DNA可W用于遺傳分 析，該將在下面通過其它實施例進行說明。同樣的程序也可W用于來自其它植物物種的種 子，并且采用其它DNA分析技術和設置，該將在下面通過其它實施例進行說明。涂料攬拌器 中的攬拌并沒有影響到種子的萌發(fā)能力。
[00巧]實施例2
[005引細胞質DNA的分析
[0057] 該實施例說明，本發(fā)明可用于區(qū)分雄性不育（CM巧和完全可育的植物，而無需 先萌發(fā)種子并種植植物。該在例如發(fā)生雜交種子批次或親本系的污染，W及可育種子 錯誤地與雄性不育種子一起收獲時是需要的。如果有遺傳標記可用于區(qū)分雄性不育 (male-sterility)和雄性可育能力（male-fedility)并且如果采用本發(fā)明的所述方法， 那么在種子階段就有可能進行該檢測。因而該種方法極大地節(jié)約了植物的種植空間。如果 沒有該樣的測試，所有的植物都需要生長成熟，并在它們開始開花后檢查雄性可育能力。所 有可育植物都需要在種子生成前被鑒定出來并從群體中去除，該要求勞動力的投入和寶貴 種植空間的浪費。
[0058] 本發(fā)明允許從種子批次中特異性選擇出雄性不育種子（即將會長成雄性不育植 株的種子），然后，育種者可W放也地在他的所有可用種植空間內(nèi)種滿已經(jīng)確認為雄性不育 的個體。通常線粒體一其攜帶它們細胞器基因組中的CMS標記一在每個細胞中W多拷 貝的形式存在，該一事實極大地提高了該方法的靈敏度。因此，種皮DNA樣品中CMS標記的 高拷貝數(shù)使得該標記易于檢測。
[0059] 本實驗中采用了一批西蘭花化roccoli)種子（其由83個種子組成，所述種子攜 帶細胞質雄性不育（CM巧性狀）W及5個花菜（cauliflower)種子（其缺乏該性狀，并且因 此可W生長成為完全可育植株）。將該批種子分別置于"篩選同伴管（screenmatetube)" 板的孔中，每孔加入50y1無菌MilliQ水，并且進行如實施例1中所述的操作。將種子賠 育3分鐘，并隨后在涂料攬拌器中60化pm攬拌20砂。隨后通過PCR的DNA分析正確地在 該88個種子的種子批次中鑒定到該五個可育種子。
[0060] 圖1顯示了該實驗的結果：與缺失該CMS標記的兩個對照樣品一起，缺失CMS標記 的該五個花菜種子樣品可W清楚地與該批次的其它種子區(qū)分開。該方法允許在一批"雄性 不育"種子中檢測出"污染的"可育后代。
[00川 實施例3
[0062]獲得關于種子的母本植株的遺傳信息
[0063] 該實施例證實用所要求保護的方法獲得的DNA純粹起源于母體。首先將甘藍種子 經(jīng)受如本發(fā)明實施例1所述的非破壞性的DNA分離步驟，并隨后經(jīng)受常規(guī)的、破壞性的DNA 提取方法，其中對于后一目的，所述種子被均質化。對由該兩種不同方法從相同種子已經(jīng)獲 得的DNA測試核DNA標記。對于該特定標記，已知雜交種子的父本植株對A等位基因是純 合的，而雜交種子的母本植株對B等位基因是純合的。因此，在該測定中所分析的種子的核 基因組在所有情況下對于該特定標記均是雜合的（AB)。
[0064] 圖2在上圖中顯示了當對用本發(fā)明的所述方法所獲得的DNA進行測試時，針對該 測試的核標記所獲得的標記分數(shù)（英光點）。除了純合的AA(綠色?)和雜合的AB(藍色 O)對照樣品分數(shù)之外，所有樣品得分為純合的BB(紅色□)，該證實了在用本發(fā)明的所述 方法所獲得的DNA樣品中只有該核標記的母體等位基因可被檢測到。
[006引相比較而言，圖2的下圖顯示了當對從相同種子采用標準的、破壞性DNA分離方法 提取的基因組DNA進行測試時，對相同核標記所獲得的結果。該分離顯然導致雜交DNA的 分離，因為在該測試中所有實驗樣品對該核標記得分均為雜合（藍O)。
[006引 實施例4
[0067] 種子批次中遺傳污染的檢測
[0068] 向一批89個雜交甜椒種子（甜椒Capsicumannuum)(由從特定父本系獲得的花 粉對雄性不育母本系（攜帶GMS性狀）產(chǎn)生的）混入由遺傳上不同的母本系產(chǎn)生的四個種 子（W模擬雜交種子批次意外污染了來自不同品種（variety)或母本系的種子背景程度）。 將所述種子分別置于96孔板的孔中，并應用實施例1的操作。
[0069] 隨后，對等份液體立即通過PCR進行分析，W檢測各種遺傳標記的存在與否，該些 遺傳標記能夠區(qū)分在相同的種植設備（facility)中經(jīng)常同時采用的不同甜椒母本系。由 正確的母本系產(chǎn)生的所有89個雜交種子對于其相應的標記得分為正，該四個"污染的"種 子對于該標記得分為負。然而，該四個種子對于另一標記得分為正，而其它89個種子對于 該標記的得分為負。因此，該分析明確檢測出不對應于所期望雜交基因型的另一個母本系 的四個"污染的"種子。
[0070] 為了進一步加速對生產(chǎn)設備中"污染的"母本系的檢測，還可W將來自所有93個 種子的液體混合（或可W整體提取來自該種子批次的種皮DNA)，并可W對所混合的液體測 試特異性針對生產(chǎn)設備中所采用的每個母本系的遺傳標記。在當前實施例中，該方法能夠 在該種子批次中實現(xiàn)兩個不同母體來源的陽性檢測，指示存在某種污染水平，該樣兩個不 同母體來源的陽性檢測是由于存在來自除了旨在用于產(chǎn)生該特定雜交品種的母本系之外 的另一母本系的種子所導致的。因此，該種簡單的測試能夠快速警告；從中取得該樣品的整 個種子批次應當進行更加仔細地分析。
[00川實施例5
[0072] 大型誘變?nèi)后w的遺傳分析
[0073] 在植物育種領域中，反向遺傳學的應用日益普遍。反向遺傳學涉及到該樣的方法， 其中分離基因，和通過修飾它們的一級結構和/或表達來確定基因的功能。隨著目前在基 因功能方面認識的增加（尤其是在模式系統(tǒng)如擬南芥（Ar油idopsistholiana)、水稻和玉 米中），反向遺傳學方法現(xiàn)在在作物系統(tǒng)中獲得了功效。
[0074] 為了確定特定基因或等位基因的存在，大量診斷性DNA工具對本領域技術人員來 說是可用并且已知的。篩選植物群體的成本在很大程度上由對所研究的群體的個體植株 的種植和取樣W及從該些樣品分離DNA所需的勞動力和空間決定。在研究過程中，如果一 個群體作為代表存在于該群體的個體植物中的遺傳變異的種子樣本是可獲得的，大量的勞 力已經(jīng)花費在了逐株收獲作為家系中的相關個體的種子。一旦對植物的組織已經(jīng)取樣，在 萌發(fā)或種植植物之后，優(yōu)選的植物不得不立即使用或種植至成熟W確定其遺傳價值和身份 (identity)。該過程一旦啟動，就不能被終止或逆轉。未能及時研究群體中的可用表型和 基因型信息可能導致有趣的遺傳組合或有趣的等位基因的不可逆損失。
[00巧]例如，當一群植物或種子已經(jīng)經(jīng)受了誘變（采用本領域技術人員已知的誘導突變 的操作步驟），首先獲得MO群體。根據(jù)由最常用于誘變的隨機方法（如甲賴酸己醋）所誘 變的特定細胞，MO植物通常是嵌合的。該意味著MO植物的不同部分的遺傳組成是不同的， 并且在該植物的一些區(qū)域（sector)中細胞可能攜帶感興趣的突變，而在相同植物的其它 區(qū)域中細胞攜帶該基因的野生型等位基因。所述區(qū)域的大小取決于最初誘變的細胞的發(fā)育 命運，例如在經(jīng)受誘變劑的種子中，并取決于在整個植物發(fā)育中從所述誘變細胞（或細胞 的區(qū)域）所產(chǎn)生的細胞譜系的功能。
[0076] 通常只有存在于植物的生殖系（即最終引起花粉顆粒和/或卵細胞形成的細胞譜 系）中的突變可W被傳遞給下一代。隨機誘變方法通常導致該樣的MO植物，其中一些花產(chǎn) 生攜帶期望的突變的種子，而同一植物的其它花產(chǎn)生不攜帶所述突變的種子。理論上有可 能詳細檢查該種變異并區(qū)分該兩種類型的花，但考慮到突變?nèi)后w的大小通常非常巨大并且 投入到該樣的工作所需的時間和勞動力，該不是一個研究者會去思考的事情。
[0077] 通常情況下，從每個個體植物收獲來自MO植物的種子，而并不因此在該植物的個 體果實之間進行區(qū)分。因此，在許多情況下，那些種子一稱為Ml種子一對于所期望的突 變不是均一的（其中MO植物的生殖系是嵌合的）。因此，在其中所誘變的區(qū)域僅局限于一 朵或幾朵花的生殖系的情況下，人們會很容易地忽略該突變的存在，因為攜帶該突變的Ml 種子在從相同MO植物所收獲的整個Ml種子批次中相對比較少見。研究者通常沒有足夠的 種植空間來處置萌發(fā)、種植和分析來自他的整個誘變?nèi)后w的每個單獨MO植物的所有Ml種 子，并且當分析每個MO植物的后代的隨機的小種子樣品時，可能不會觀察到僅W相對小的 百分比存在于Ml種子中的突變。
[0078] 采用本發(fā)明的方法，快速分析種子批次中產(chǎn)生所述種子批次的母本植物中期望突 變的存在是可行的。本發(fā)明的方法既可用于Ml種子，也可用于M2種子，或來自后代的種子。 一旦已經(jīng)檢測到給定種子批次中期望突變的存在，由該母本植物（或那些母本植物）所產(chǎn) 生的所有種子可W在個體基礎上采用本發(fā)明的非破壞性方法進行分析，并且隨后該些種子 仍然可W播種并萌發(fā)。
[0079] 該方法可W允許鑒定其母本攜帶所述突變的個體種子，即便它們在由所述植物或 該些植物產(chǎn)生的一批種子中是少見的。該策略極大地優(yōu)化了例如TILLING方法的效率，其 中研究者著眼于在基因組的預定區(qū)域中的突變。具有很高幾率攜帶所期望的突變的個體、 非萌發(fā)種子的快速鑒定，使得沒有必要種植所有Ml種子、或所有M2種子、或來自任何后代 的所有種子，因為它允許選擇性種植那些母本植物攜帶感興趣突變的群體的個體。該節(jié)約 了種植空間、勞動力和時間。
[0080] 可選地，如果誘變植物群體的M2代是可用的，本發(fā)明的方法的應用允許一個非常 類似的方法。M2群體具有不再存在嵌合現(xiàn)象，突變可能W純合狀態(tài)存在的優(yōu)勢，該有利于所 述突變的表型效應的分析，即便它們本質上是隱性的。
[0081] 然后，有可能例如在每個個體M2種子池或種子批次（其中每個種子池是從或者單 個Ml植物或者一組個體Ml植物收獲的）中篩選期望突變的存在，并因而鑒定特別感興趣 的M2種子批次（即由在感興趣的基因組區(qū)域攜帶突變和/特定的期望突變的母本植物所 產(chǎn)生的）。然后可W選擇僅萌發(fā)預先選定的批次的種子（其中在母體基因組中已經(jīng)檢測到 感興趣的突變），而不是萌發(fā)來自每個M2種子批次的種子并隨后用現(xiàn)有的破壞性DNA分離 操作步驟從苗或成熟植物的部分（如葉盤）分離DNA。
[0082] W該種方式，再也不需要種植成千上萬缺乏所期望的遺傳變異的植物，并且研究 者可W選擇特異性種植其中他知道檢測所期望的突變的機會很顯著的植物，因為所述突變 在之前已經(jīng)被顯示存在于所選定的種子批次的母體DNA中了。當將W雜合狀態(tài)攜帶所述 突變的Ml植物自交而獲得M2種子時，在不存在分離異常的情況下，預計在所述M2種子的 75%的基因組中實際存在該突變。當Ml植物已經(jīng)自交時，在顯性突變的情況下通常可W在 75%的M2植物中觀察到其表型表達，在隱性突變的情況下可W在25%的M2植物中觀察到 其表型表達。
[0083] 該方法大大降低了對大型種植設備的需求，因為僅來自選定的M2家系的種子需 要播種、萌發(fā)并種植至成熟，而不是所有的M2家系（其可W很容易地將所需要的實驗空間 在規(guī)模上縮小至100分之一或更?。?。
[0084] 此外，采用本發(fā)明的方法，研究者甚至可W進一步按比例縮小他的誘變項目 (project)。如果M2種子群體由多個M2種子批次組成，其中每個批次由多個Ml植物（形 成Ml家系）的合并的種子組成，期望的突變的陽性鑒定結果將表明產(chǎn)生所述M2種子批次 的Ml植物中至少之一攜帶所期望的突變。
[0085] 但是，因為在陽性得分的M2種子批次中包含的種子的混合來源，將不清楚在該種 子中所包含的個體種子的多大百分比實際上攜帶所述突變。如果例如十株Ml植物的種子 已經(jīng)被匯集形成M2種子批次，并且該十株植物中僅有一株攜帶所期望的突變，那么在M2種 子批次的種子中攜帶所期望的突變的種子會相對比較少見（例如，預計通常大約該些植物 的10%的75%攜帶該突變，其為大約7. 5%，或40株植物中有3株，而且，在隱性突變的情 況下，該3株植物中僅1株將有可能表現(xiàn)出突變表型，即40株植物中有1株）。因此，在已 經(jīng)在M2種子批次的代表性樣品的母體DNA中檢測到期望的突變后，所述種子批次內(nèi)所包含 的所有個體種子可W隨后通過本發(fā)明的非破壞性方法進行單獨分析，W精確鑒定由Ml家 系中攜帶所述突變的Ml植株（或那些植株）所產(chǎn)生的那些個體種子。
[0086] 該高通量方法允許從M2種子的亞群的混合M2種子池中選擇攜帶所述突變的Ml 植株（或那些植株）所產(chǎn)生的種子。該種預選極大地豐富了存在所期望突變的種子的群體 (其最終播種、萌發(fā)并種植用于分析）。當Ml植物（其對突變來說是雜合的）已經(jīng)自交時， 在顯性突變的情況下通?？蒞在75%的該些預選的M2植物中觀察到其表型表達，在隱性 突變的情況下可W在25%的所述預選M2植物中觀察到其表型表達。
[0087]尤其是對于具有大尺寸的植物物種，其通常要求每個個體植物有大的種植空間， 通過采用本發(fā)明方法而按比例縮小的策略是非常有吸引力的。它可W大大降低成本和占用 空間，并且可用的空間和人力可W方便地用于其它項目和活動。
[008引 實施例6
[0089] 反向子代作圖（!ReverseProgenyMapping)效率的提高
[0090]當將其結合本發(fā)明的方法，可W進一步改善如歐洲專利申請EP2366792所述的反 向子代作圖方法并使之更加高效。反向子代作圖是一項利用了W下事實的發(fā)明：通過第二 次分裂重建（SDR，第二次減數(shù)分裂的簡稱）所產(chǎn)生的SDR-O植物在它們的基因組中具有殘 余雜合性，與雙倍體值H)植物相反，后者是完全純合的。該殘余雜合性是由于W下事實：重 組（染色體交換）在第一次減數(shù)分裂過程中已經(jīng)發(fā)生了。SDR-O植物產(chǎn)生SDR-I種子，可 W在該SDR- 1代中觀察到在SDR-O母本植物屬雜合的染色體區(qū)域中存在的任何性狀的分 離。當觀察到感興趣的表型在由特定的SDR-O植物獲得的SDR-I植物中分離時，可W對該 SDR-O植物的基因組進行基因分型，W鑒定哪些精確的染色體區(qū)域是雜合的。該些雜合區(qū)域 是感興趣性狀的基因組定位的候選區(qū)域，W該種方式該性狀可W在基因組中作圖，并且可 W鑒定其潛在的基因組序列。但是，該方法的要求是收集并存儲所有SDR-O植物的基因組 DM,可W從所述植物中收獲SDR-I種子W用于隨后的SDR-I植物的分析。該種采用常規(guī)方 法的DNA分離不僅需要勞動力和時間，而且增加了實驗成本。
[00川當將本發(fā)明的方法應用于反向子代作圖時，不再需要從SDR-O植物收集DNA。在播 種前，可W對SDR-I種子進行如實施例1所述的本發(fā)明的非破壞性方法，W從它們的種皮收 集母體DNA。對于每個個體SDR-I種子，該DNA對應于產(chǎn)生該種子的SDR-O植物的基因組 DNA。然后，可W在SDR-O基因組（其已從SDR-I種子的種皮分離到）中查找在SDR-I群體 中發(fā)生表型分離的任何性狀的基因組基礎。可選地，可W收集從同一SDR-O植物收獲的僅 一個或少量SDR-I種子的種皮DNA，因為對于由同一母本SDR-O植物產(chǎn)生的所有SDR-I種 子而言預計該是相同的。任何SDR-I種子的種皮DNA代表產(chǎn)生該種子的SDR-O植物的母體 DNA，因而還代表由同一SDR-O植物收獲的所有SDR-I種子的種皮DNA。
[0092] 類似地，本發(fā)明的方法可用于進一步改善其它方法，例如近反向育種 (Near-ReverseBreeding)(WO2006/094773)。
【權利要求】
1. 一種用于分析種子的母體DNA的非破壞性方法，包括以下步驟：將種子與流體接觸 以從種皮表面脫落DNA，并分析從所述種皮表面脫落的DNA。
2. 權利要求1所述的方法，其中所述流體包含于容器中。
3. 權利要求1或2所述的方法，其中所述種子被浸在所述流體中。
4. 權利要求1或2所述的方法，其中所述種子漂浮在所述流體上。
5. 權利要求1-4中任一項所述的方法，其中所述種子在所述流體內(nèi)被攪拌。
6. 權利要求1或2所述的方法，其中所述種子用所述流體漂洗。
7. 權利要求1-6中任一項所述的方法，其中所述流體是水溶液。
8. 權利要求1-7中任一項所述的方法，其中所述流體是水。
9. 權利要求1-8中任一項所述的方法，其中所述種子從所述流體中取出，并且所述流 體用于母體DNA的分析。
10. 權利要求1-9中任一項所述的方法，其中所述種子隨后被干燥用于貯存。
11. 通過分析母體DNA而檢查種子的母體基因組的方法，其中所述DNA是由權利要求 1-10中任一項所述的方法獲得或產(chǎn)生的DNA。
12. 權利要求11所述的方法，其中所述DNA是如下獲得或產(chǎn)生的DNA:將種子與流體接 觸以從種皮表面脫落DNA，并分析從所述種皮表面脫落的DNA。
13. 權利要求2-10中任一項所述的方法，其中所述容器是用于高通量分析大型植物群 體中的母體DNA的自動化系統(tǒng)的一部分。
14. 權利要求1-13中任一項所述的方法，其中將一個以上的種子與容器中的流體接 觸。
15. -種用于大型植物群體的高通量DNA分析系統(tǒng)，包括布置成用于將一個或多個種 子與流體接觸以從種皮表面脫落DNA的容器陣列，以及用于分析從所述種皮表面脫落的 DNA的裝置。
【文檔編號】A01H1/04GK104379743SQ201380029715
【公開日】2015年2月25日 申請日期:2013年6月6日 優(yōu)先權日:2012年6月7日
【發(fā)明者】C·M·P·梵頓 申請人:瑞克斯旺種苗集團公司