一種香樟品種涌金植株再生的方法
【專利摘要】一種香樟品種‘涌金’植株再生的方法，包括下列步驟：(1)采集香樟品種‘涌金’當年抽的新梢，帶回實驗室后去除葉片，剪成帶有1～2個帶腋芽的莖段，無菌化后接種至含有6-芐氨基腺嘌呤和吲哚丁酸的MS培養(yǎng)基中誘導腋芽的形成；(2)將長勢良好的‘涌金’腋芽連同莖段接種至含有6-芐氨基腺嘌呤和吲哚乙酸的MS培養(yǎng)基中進行繼代和增殖培養(yǎng)；(3)將生長幼嫩、平均芽長為2.0cm左右、長勢良好增殖形成的叢生芽用解剖刀切割后接種至含有吲哚丁酸的1/2MS培養(yǎng)基中誘導不定根的形成。本發(fā)明克服了腋芽誘導與生長困難、繼代與增殖新葉黑死、脫落和生長勢衰弱的現(xiàn)象，使得無菌材料長期繼代，從而能夠大量增殖。誘導產(chǎn)生的叢生芽生勢旺盛、遺傳性狀與母本一致。
【專利說明】一種香樟品種涌金植株再生的方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明屬于組織培養(yǎng)領域，具體涉及一種香樟品種‘涌金’植株再生的方法。
【背景技術】
[0002]樟樹(Cinnamomum caphora)又名香樟,為樟科樟屬的亞熱帶常綠闊葉喬木。其生長迅速，枝繁葉茂，四季常綠，葉形秀麗而又散發(fā)濃香，既是珍貴的芳香油類樹種又是城市重要的景觀和綠化樹種。香樟新品種‘涌金’(Cinnamomum camphora ‘Yongjin’，國家植物新品種權號2009009)系香樟種子變異種，枝干鮮紅色，新葉、花呈金黃色，果皮呈黃色，并且枝干、葉、果皮色澤具有季相變化，作為高大的彩葉喬木，具有非常高的園林觀賞及推廣應用潛力與價值。但‘涌金’種子遺傳物質不穩(wěn)定，育苗后代退化率高達99%以上，為獲得優(yōu)良無性系目前已經(jīng)開展嫁接實驗以期獲得保持母本優(yōu)良性狀的子代。采用扦插繁殖，由于母樹枝條數(shù)量有限，很難滿足現(xiàn)實的需求。
[0003]組織培養(yǎng)是最具有應用潛力的無性快速繁殖技術，能保持母本的優(yōu)良遺傳特性。通過植物組織培養(yǎng)技術，不 但可在短期內提供整齊一致的良種苗木，而且還能樹種改良和利用及遺傳轉化打下基礎，已經(jīng)在許多植物育苗中獲得應用。目前國內外對普通香樟組培非常重視，從1992年連方青報道香樟的組培研究成果以來，國內外學者利用伐根萌條、不同齡期的莖段、莖尖、種子、離體胚、幼葉、嫩芽等作為外植體進行了組織培養(yǎng)研究工作并誘導出完整植株。‘涌金’作為普通香樟的變異品種，其組培研究工作國內外尚未見報道。香樟新品種‘涌金’是普通香樟種子變異而來，作為重要的彩葉樹種未來推廣應用的價值潛力巨大，當前數(shù)量稀少，其快速繁殖的研究工作非常迫切。因此，探索‘涌金’植株再生的方法，實現(xiàn)其規(guī)模化繁殖，不但可豐富園林彩葉植物品種，滿足市場需求，也對樟科其它植物的組培技術研究具有重要的借鑒意義。

【發(fā)明內容】

[0004]為解決上述現(xiàn)有技術存在的問題，本發(fā)明主要填補現(xiàn)有香樟新品種‘涌金’組培技術空白，針對以莖段為外植體的‘涌金’植株再生過程中腋芽的誘導與生長困難、腋芽的繼代與增殖過程新葉脫落和黑死、叢生芽生根難度大等問題，研究適合‘涌金’組培快繁各個階段的培養(yǎng)條件，旨在為實現(xiàn)‘涌金’快速繁殖提供有效幫助。
[0005]為達到上述目的，本發(fā)明的技術方案為:
[0006]一種香樟品種‘涌金’植株再生的方法，包括下列步驟:
[0007](I)采集香樟品種‘涌金’當年抽的新梢，帶回實驗室后去除葉片，剪成帶有I~2個帶腋芽的莖段，用洗潔精清洗4~5min，流水沖洗30min以上。在超凈工作臺上用75%的酒精消毒30s，無菌水沖洗3次，再用0.1 %升汞根據(jù)莖段直徑大小消毒8~12min，無菌水沖洗4~5次。濾紙吸干水分，切去莖段褐化部分，接種至無激素的MS培養(yǎng)基中。挑選無菌莖段作為腋芽誘導的外植體，含有6-芐氨基腺嘌呤和吲哚丁酸的MS培養(yǎng)基中，20d后腋芽開始萌動并逐漸展葉、伸長；[0008](2)將長勢良好的‘涌金’腋芽連同莖段接種至含有6-芐氨基腺嘌呤和吲哚乙酸的MS培養(yǎng)基中腋芽能夠正常生長和增殖，30d后平均有效芽最多可達到6.5個；
[0009](3)將生長幼嫩、平均芽長為2.0cm左右、長勢良好增殖形成的叢生芽用解剖刀切割后成單芽接種至含有吲哚丁酸的1/2MS培養(yǎng)基中誘導不定根的形成，30d后最高生根率為41.3%，繼續(xù)培養(yǎng)30d后將再生植株移栽至泥炭:珍珠巖=3: I的基質中移栽成活率可達到85%。
[0010]上述過程所采用的培養(yǎng)條件為:pH值5.8~6.0，溫度24~26°C，光照2000Lux，每日光照時間12h。
[0011]其中，在步驟(1)中外植體采集的時間是8月份，所述誘導腋芽的培養(yǎng)基中添加6-BA1.0mg/L、IBA0.02mg/L、蔗糖 30%。
[0012]在步驟(2)中伸長的腋芽需得連同原莖段一同接入繼代與增殖培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基中添加 6-BA3.0mg/L、IAA0.05mg/L、鹿糖 30%。
[0013]在步驟(3)中所述促進不定根誘導與伸長的培養(yǎng)基中添加IBA0.05mg/L、蔗糖20%。
[0014]相對于現(xiàn)有技術，本發(fā)明的有益效果為:本發(fā)明以香樟品種‘涌金’莖段為外植體，通過直接器官發(fā)生方式獲得了再生植株，并通過激素種類和濃度的調控克服了腋芽誘導與生長困難、繼代與增殖新葉黑死、脫落和生長勢衰弱的現(xiàn)象，使得無菌材料長期繼代，從而能夠大量增殖。通過本發(fā)明誘導產(chǎn)生的叢生芽生勢旺盛、遺傳性狀與母本一致，為實現(xiàn)優(yōu)質材料的大規(guī)模組培生產(chǎn)奠定基礎。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0015]圖1為‘涌金’腋芽在萌動；
[0016]圖2為‘涌金’腋芽伸長與展葉；
[0017]圖3為‘涌金’腋芽新葉黑死、脫落；
[0018]圖4為‘涌金’腋芽的木質化難以增殖；
[0019]圖5為‘涌金’腋芽增殖；
[0020]圖6為‘涌金’叢生芽的生根。
【具體實施方式】
[0021]下面結合附圖及具體實施例對本發(fā)明做進一步詳細描述:若無特殊說明，以下試劑均為市售試劑，以下設備均為本領域常用設備。
[0022]實施例1:
[0023]本發(fā)明的實驗材料取自寧波林業(yè)局種苗中心邱隘基地生長14年的香樟新品種‘涌金’植株。取發(fā)育充實、半木質化的側梢和頂梢部分，去除葉片，剪成帶有I~2個帶腋芽的莖段，用洗潔精清洗4~5min，流水沖洗30min以上。在超凈工作臺上用75%的酒精消毒3min，無菌水沖洗3次，再用0.1 %升汞根據(jù)莖段直徑大小消毒8~12min，無菌水沖洗4~5次。濾紙吸干水分，切去莖段褐化部分，接種至無激素的MS培養(yǎng)基中。挑選無菌莖段作為腋芽的外植體，接種至MS+6-BA1.0mg/L+IBA0.02mg/L的誘導培養(yǎng)基中，20d后待腋芽的莖段開始萌動并繼續(xù)生長。[0024]將在上述培養(yǎng)條件中獲得的高度為2cm左右的腋芽轉移至MS+6-BA3.0mg/L+IAA0.05mg/L繼代與增殖培養(yǎng)基中，在此培養(yǎng)基上腋芽新葉黑死、落葉、生長逐漸衰弱等問題得到解決，而且每個腋芽可形成6.5個有效芽。
[0025]將生長一致、高度為2cm左右的叢生芽切下接種至1/2MS+IBA0.05mg/L的生培養(yǎng)基中，30d后在此培養(yǎng)基中可犾得香棒新品種‘涌金’的完整植株。
[0026]下面一些具體的實驗情況將有助于說明本發(fā)明所述‘涌金’莖段再生過程各個發(fā)育階段所用配方的有效性，所有實驗至少重復3次。
[0027]試驗例1，激素對‘涌金’腋芽萌發(fā)與生長的影響
[0028]在添加有適宜濃度的6-BA與IBA培養(yǎng)基中，無菌化后的‘涌金’莖段20d后腋芽開始萌動、抽長并長出新葉見(圖1、圖2)。分析表1可知，在單獨添加6-BA的誘導培養(yǎng)基中，腋芽的萌發(fā)率隨6-BA濃度的增加而提高，當6-BA濃度為1.0mg. l-1及以上時帶腋芽的莖段均可萌發(fā)，但伸長困難且不展葉，這說明單獨添加6-BA不利于‘涌金’莖段的萌發(fā)。進一步實驗表明，在添加有IBA的誘導培養(yǎng)基中，盡管可以提高莖段萌發(fā)率，但6-BA過低或過高都不利于‘涌金’莖段腋芽的生長。當IBA濃度為0.02~0.lmg/L,6-BA為0.5mg/L時，腋芽生長緩慢，難以展葉；6-BA為3mg/L時，腋芽雖可伸長，但是腋芽新葉尖端出現(xiàn)壞死，新葉出現(xiàn)脫落現(xiàn)象，基部愈傷組織增多進而褐化的情況，繼代培養(yǎng)表明，腋芽容易衰弱死亡。在MS+6-BAlmg/L+IBA0.02mg/L培養(yǎng)基中誘導芽從平均葉長、平均芽長與其他培養(yǎng)基的誘導均具有顯著優(yōu)勢，同時生長勢旺盛并伴不定芽的分化(圖2)，因此綜合分析得出該培養(yǎng)基是本次實驗‘涌金’莖段腋芽有誘導的最佳培養(yǎng)基。
[0029]表1不同6-BA與IBA濃度組合對腋芽萌發(fā)的影響①
[0030]
【權利要求】
1.一種香樟品種‘涌金’植株再生的方法，包括下列步驟: (1)采集香樟品種‘涌金’當年抽的新梢，帶回實驗室后去除葉片，剪成帶有I~2個帶腋芽的莖段，用洗潔精清洗4~5min，流水沖洗30min以上，在超凈工作臺上用75%的酒精消毒30s，無菌水沖洗3次，再用0.1 %升汞根據(jù)莖段直徑大小消毒8~12min，無菌水沖洗4~5次，濾紙吸干水分，切去莖段褐化部分，接種至無激素的MS培養(yǎng)基中，挑選無菌莖段作為腋芽誘導的外植體，含有6-芐氨基腺嘌呤和吲哚丁酸的MS培養(yǎng)基中，20d后腋芽開始萌動并逐漸展葉、伸長； (2)將長勢良好的‘涌金’腋芽連同莖段接種至含有6-芐氨基腺嘌呤和吲哚乙酸的MS培養(yǎng)基中腋芽能夠正常生長和增殖，30d后平均有效芽最多可達到6.5個； (3)將生長幼嫩、平均芽長為2.0cm左右、長勢良好增殖形成的叢生芽用解剖刀切割后成單芽接種至含有吲哚丁酸的1/2MS培養(yǎng)基中誘導不定根的形成，30d后最高生根率為41.3%，繼續(xù)培養(yǎng)30d后將再生植株移栽至泥炭:珍珠巖=3: I的基質中移栽一個月。
2.如權利要求1所述的方法，其特征在于，上述過程所采用的培養(yǎng)條件為:pH值5.8~6.0，溫度24~26。。，光照2000Lux，每日光照時間12h。
3.如權利要求1所述的方法，其特征在于，在步驟(1)中外植體采集的時間是8月份，所述誘導腋芽的培養(yǎng)基中添加6-芐氨基腺嘌呤1.0mg/L、吲哚丁酸0.02mg/L、蔗糖30%。
4.如權利要求1所述的方法，其特征在于，在步驟(2)中伸長的腋芽需得連同原莖段一同接入繼代與增殖培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基中添加6-芐氨基腺嘌呤3.0mg/L、吲哚乙酸0.05mg/L、鹿糖30%。
5.如權利要求1所`述的方法，其特征在于，在步驟(3)中所述促進不定根誘導與伸長的培養(yǎng)基中添加吲哚丁酸0.05mg/L、蔗糖20%。
【文檔編號】A01H4/00GK103782906SQ201310737749
【公開日】2014年5月14日 申請日期:2013年12月30日 優(yōu)先權日:2013年12月30日
【發(fā)明者】何月秋, 王建軍 申請人:寧波城市職業(yè)技術學院, 寧波市林業(yè)局林特種苗繁育中心