少女石竹的組織培養(yǎng)方法
【專利摘要】一種少女石竹的組織培養(yǎng)方法，采用少女石竹嫩枝的莖尖作為外植體，滅菌處理后，在培養(yǎng)溫度25±1℃，光照強(qiáng)度2500Lx，除白天自然光照外，夜間補(bǔ)光4小時／天的培養(yǎng)條件下，依次接種到由MS、0.01mg／L6-BA、0.05mg/L?NAA組成的初代誘導(dǎo)培養(yǎng)基，由MS、0.01mg／L6-BA、0.05mg/L?NAA組成的繼代培養(yǎng)基，由1／2MS、0.05mg／L?IBA組成的生根培養(yǎng)基上進(jìn)行培育，該培養(yǎng)方法可以短時間內(nèi)獲得室內(nèi)大規(guī)模繁殖的少女石竹培苗，生產(chǎn)率高，具有潛在的生態(tài)效益和社會效益。
【專利說明】少女石竹的組織培養(yǎng)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于植物生物【技術(shù)領(lǐng)域】，具體而言，涉及一種少女石竹的組織培養(yǎng)方法，該培養(yǎng)方法特別適用于少女石竹，遠(yuǎn)優(yōu)于該培養(yǎng)基對于其他石竹的組織培養(yǎng)方法，包括石竹外植體的選擇，莖尖組織培養(yǎng)中繼代培養(yǎng)基及培養(yǎng)代數(shù)的選擇，組織培養(yǎng)過程中培養(yǎng)條件的選擇等內(nèi)容。
【背景技術(shù)】
[0002]石竹是多年生作一、二年生栽培的草花，因其花色豐富，花期長，栽培管理粗放，是重要的觀賞花卉。全球約有600余種，廣布于北溫帶，主要分布于歐亞大陸，尤其是地中海地區(qū)，少數(shù)產(chǎn)北美和北非。據(jù)《中國植物志》記載，我國石竹屬有17個種、I個亞種、9個變種，多分布于北方草原和山區(qū)草地，大多生于干燥向陽處，有些種生于林緣或林下、荒漠及半荒漠。內(nèi)蒙古水資源嚴(yán)重缺乏，景觀綠化要多用陽光少用水，應(yīng)全面推廣抗旱綠化植物，而生長在內(nèi)蒙古干旱、半干旱地區(qū)的石竹，有頑強(qiáng)的生命力，可以在野外順利越冬，在雨水少、無澆灌的情況下也能正常生長，其根系龐大，可防止水土流失并能抗有害氣體和病蟲害，有重要的衛(wèi)生環(huán)保功能，可作為園林的重要組成部分，也可用于高速公路、高架公路等路基、路坡等多種場所的綠化美化。但由于來自人類活動或自然變遷兩方面的威脅，使其種群數(shù)量存在著自然退化問題并且組培擴(kuò)繁種中出現(xiàn)玻璃花現(xiàn)象導(dǎo)致工廠化育苗數(shù)量受限。解決的辦法就是改良現(xiàn)有對石竹的組織培養(yǎng)方法，這是快速繁殖、脫毒復(fù)壯和降低玻璃花的有效方法。在實(shí)驗(yàn)室條件下，降低其玻璃花是一項(xiàng)需實(shí)踐去摸索和探討的新課題，在制定技術(shù)方案時可以參考的資料不多，都必須通過試驗(yàn)來逐一解決，關(guān)鍵要解決外植體取材部位、時期；各培養(yǎng)時期培養(yǎng)基的選擇；培養(yǎng)條件以及成苗后快繁技術(shù)等。本發(fā)明以開發(fā)利用，降低成本為目標(biāo)，以形成工廠化、產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)為目的，制定相應(yīng)的工作計(jì)劃和實(shí)施辦法。
[0003]組織培養(yǎng)在離體培養(yǎng)條件下，不同植物以及同種植物不同部位的組織細(xì)胞對營養(yǎng)要求不同，只有滿足了它們各自的特殊要求，才能更好地生長發(fā)育。掌握培養(yǎng)基的配制及篩選方法是取得組培成功的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一。
[0004]植物組織培養(yǎng)是很重要的生物技術(shù)手段。植物的細(xì)胞、莖段、葉片等均可以培養(yǎng)。取植物的細(xì)胞、器官和組織，置入適當(dāng)培養(yǎng)基的容器中，在一定的培養(yǎng)條件下，可分化形成完整植株。作為生物技術(shù)有力手段的組織培養(yǎng)，日益受到重視，在農(nóng)林作物的脫毒快繁、突變誘發(fā)、細(xì)胞工程和基因工程等方面都發(fā)揮著重要作用。
[0005]在石竹科植物的組織培養(yǎng)中，常選擇莖段、葉片、花瓣和莖尖等作為外植體來獲得再生植株。莖段也是石竹科植物快速繁殖中的常用材料之一，由于其具有取材方便、數(shù)量多等優(yōu)點(diǎn)而被廣泛采用。Watad等研究了以莖段作外植體，采用凝膠培養(yǎng)基培養(yǎng)、液體搖動培養(yǎng)以及液體培養(yǎng)基上漂浮界面膜輔助培養(yǎng)等3種不同培養(yǎng)方式對香石竹再生頻率的影響，結(jié)果表明，第三種培養(yǎng)方式的再生頻率比另外兩種方式可提高兩至三倍，這在植物快繁過程中可大大節(jié)約成本。Godo等對剪秋羅莖段培養(yǎng)進(jìn)行了研究，外植體在I / 2MS+0.2mg /L BA和I / 2MS培養(yǎng)基上的再生頻率分別為30%和70%。在MS+10mg/L BA培養(yǎng)基上每個莖段節(jié)點(diǎn)平均可以生成8個可利用芽，而且芽的遺傳穩(wěn)定性相當(dāng)穩(wěn)定。
[0006]石竹科植物的葉片培養(yǎng)可通過直接或間接再生途徑獲得再生植株。了等向培養(yǎng)基中加入生長素？~V對中國石竹葉片的愈傷組織進(jìn)行再分化研究。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，最適愈傷組織分化培養(yǎng)基為13+84(2.0,5.01118 / 1) +^^(0.5,1.0^/1)0無論單獨(dú)或組合使用8八，嫩八，2，4-0，愈傷組織都不能再分化產(chǎn)生芽。此外，他們還對中國石竹的第1片葉子(從頂部開始)和第2片葉子的愈傷組織誘導(dǎo)情況做了比較，研究表明第1片葉子和第2片葉子基部誘導(dǎo)出的愈傷組織具有再生能力，而第2片葉子其余部分誘導(dǎo)的愈傷組織不具有再生能力。1^111:151等研究報(bào)道:中國石竹葉片外植體在3呢/ I 8^+0.5^/1購V和3^/I 8^+1^/1嫩八的13基本培養(yǎng)墓上培養(yǎng)，都會直接產(chǎn)生不定芽；而在0.508/1 8^+1^/12, 4-0的13培養(yǎng)基上雖也可以產(chǎn)生不定芽，但伴隨有愈傷組織的產(chǎn)生，產(chǎn)生的不定芽要在含8八和嫩八的培養(yǎng)基上才能生長。？犯'64等以香石竹、中國石竹和美國石竹的葉片為外植體，采用13+1呢/ 12，4-0液體培養(yǎng)基誘導(dǎo)出了體細(xì)胞胚，體細(xì)胞胚在13+108 / I以3固體培養(yǎng)基上發(fā)育成幼苗，首次建立了石竹科植物直接體細(xì)胞胚誘導(dǎo)再生體系。
[0007]似匕如等以香石竹花瓣、葉片和莖段為外植體誘導(dǎo)不定芽。結(jié)果只有花瓣具有較高的再生頻率，適宜的培養(yǎng)基為13+1.1-2.2^/1 8八和13+0.9^/1嫩八。等以香石竹花瓣為外植體研究了兩種培養(yǎng)方式對石竹芽再生頻率的影響。結(jié)果表明，石竹花瓣在液體培養(yǎng)基比固體培養(yǎng)基上的再生率高(前者可達(dá)100%，而后者只有50% )；花瓣的各部位都會形成再生芽，每個外植體最多可產(chǎn)生7個不定芽。01821110^等也由香石竹花瓣誘導(dǎo)出再生芽，誘導(dǎo)率達(dá)84.4%，而轉(zhuǎn)基因香石竹花瓣的再生芽誘導(dǎo)率高達(dá)90.4%。[0008]莖尖是石竹科植物組織培養(yǎng)中常用的一個取材部位，除用于快速繁殖外，還用于脫毒培養(yǎng)、種質(zhì)資源保存等。從20世紀(jì)90年代初開始，國內(nèi)外報(bào)道了這方面的研究成果。香石竹由于生產(chǎn)中采用的扦插繁殖導(dǎo)致品質(zhì)嚴(yán)重下降，因此，它的莖尖培養(yǎng)具有重要的生產(chǎn)實(shí)踐意義。^11等研究了不同生長素、細(xì)胞分裂素和赤霉素組合對瞿麥莖尖快繁的影響，結(jié)果表明:莖尖分生組織在13+5.0呢凡8^+1.0^ / I 培養(yǎng)基中比在含其他幾種生長調(diào)節(jié)劑組合的培養(yǎng)基中產(chǎn)生的叢生芽多。0=3皿1等報(bào)道了 102的劑量和處理時間對香石竹莖尖離體繁殖效率的影響很大。他們的研究表明，102的濃度為1 一51118 /匕處理時間為
3-10(1，對香石竹莖尖進(jìn)行離體繁殖時，效率可達(dá)100 %。
[0009]迄今為止，國內(nèi)外組織培養(yǎng)成功的石竹科品種很多，但多見于報(bào)道的是用于香石竹的生產(chǎn)和栽培，對少女石竹組織培養(yǎng)研究較少。總結(jié)近20年來的文獻(xiàn)數(shù)據(jù)，少女石竹科品種組織培養(yǎng)多數(shù)是莖段、葉片比較成功，有關(guān)少女石竹莖尖培養(yǎng)的更是屈指可數(shù)。少女石竹的人工繁殖仍主要采用播種法及扦插法，繁殖數(shù)量有限、時間長且極易導(dǎo)致不定芽玻璃花、病害感染和品質(zhì)退化。目前可用于解縮短育苗時間、工廠化生產(chǎn)、幼苗玻璃化問題、更新復(fù)壯的組織培養(yǎng)法繁殖研究較少，因此深入開展少女石竹組織培養(yǎng)研究已成為科研工作者亟待進(jìn)行的工作之一。用我國豐富的野生資源進(jìn)行品種創(chuàng)新，應(yīng)用多樣化的育種手段，在重視常規(guī)雜交育種的基礎(chǔ)上，結(jié)合現(xiàn)代生物技術(shù)手段進(jìn)行新品種選育，同時以脫毒組培種苗作為生產(chǎn)性原種來進(jìn)行種球的工廠化開發(fā)，是少女石竹組織培養(yǎng)的發(fā)展方向。組織培養(yǎng)法繁殖取材方便，不受自然條件的限制，可以不斷進(jìn)行大量繁殖，是少女石竹快速繁殖、減少玻璃化、脫毒復(fù)壯以及新品種培育的最有效方法，可以在短期內(nèi)獲得大量小苗，解決了少女石竹玻璃化、縮短育苗時間、栽培中種源較少的問題，為少女石竹今后的研究以及規(guī)?；?、產(chǎn)業(yè)化開發(fā)利用提供了理論依據(jù)。
[0010]莖尖組織培養(yǎng)的完整過程一般分為制定培養(yǎng)方案、外植體選擇與處理、接種、初代培養(yǎng)、繼代增殖擴(kuò)繁培養(yǎng)、壯苗與生根培養(yǎng)、試管苗的馴化移栽等幾個技術(shù)環(huán)節(jié)，前已提到掌握培養(yǎng)基的配制及篩選方法是取得組培成功的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。本發(fā)明篩選出用于少女石竹組織培養(yǎng)中不同時期的最佳培養(yǎng)基，調(diào)整對不同時期培養(yǎng)基中激素的配比，按照不同配方配制的培養(yǎng)基滿足了少女石竹各個時期的營養(yǎng)需要和生長發(fā)育，同時解決了少女石竹幼苗大量玻璃化現(xiàn)象和育苗周期長的問題。
[0011]前已提到國內(nèi)外諸多學(xué)者對石竹的組織培養(yǎng)也進(jìn)行了研究，目前已應(yīng)用于香石竹石竹生產(chǎn)中，但多見于報(bào)道的是栽培品種用于鮮切花生產(chǎn)的，培養(yǎng)基和方法并不適用于少女石竹，本發(fā)明系統(tǒng)地研究了少女石竹的外植體的選擇、最佳培養(yǎng)條件、不同階段的最佳培養(yǎng)基及增殖培養(yǎng)代數(shù)。
[0012]本發(fā)明操作簡便，成本低廉，具有良好的應(yīng)用前景。本發(fā)明系統(tǒng)地研究了少女石竹的組培中不同階段的最佳培養(yǎng)基，最適的培養(yǎng)條件及培養(yǎng)方式，解決了少女石竹玻璃化、縮短育苗時間、栽培中種源較少的問題的難題，為實(shí)現(xiàn)抗旱景觀綠化新理念增添了品種并具有較強(qiáng)的實(shí)用性，為實(shí)現(xiàn)石竹的工廠化生產(chǎn)奠定了可靠的基礎(chǔ)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0013]本發(fā)明的實(shí)施方案中，包含一種少女石竹的組織培養(yǎng)方法，其特征在于它由以下步驟組成:
[0014]步驟1:外植體取自少女石竹嫩枝的莖尖；
[0015]步驟2:將外植體接種于初代誘導(dǎo)培養(yǎng)基MS+6-BA0.01mg/L+NAA0.05mg / L上，誘導(dǎo)分化出叢生芽；
[0016]步驟3:將初代誘導(dǎo)的叢生芽在繼代培養(yǎng)基MS+6-BA0.01mg / L+NAA0.05mg/L上培養(yǎng)3代，然后將其叢生芽在改良的MS培養(yǎng)基上培養(yǎng)2代，最后將上述的叢生芽在繼代培養(yǎng)基上培養(yǎng)I代后，將其轉(zhuǎn)移到生根培養(yǎng)基I / 2MS+IBA0.05mg / L上培養(yǎng)；
[0017]步驟4:將上述誘導(dǎo)生根后的少女石竹生根苗進(jìn)行移栽。
[0018]各步驟的培養(yǎng)條件為:培養(yǎng)溫度25土TC，光照強(qiáng)度2500LX，除白天自然光照外，夜間補(bǔ)光4小時/天。
[0019]其中，改良的MS培養(yǎng)基是改變MS培養(yǎng)基中部分無機(jī)鹽和離子濃度的離子平衡溶液，用于少女石竹繼代增殖培養(yǎng)的基本培養(yǎng)基，其具體組成為:
[0020]大量元素:KN031900mg/L；NH4N03413mg/L ；CaCl2.2H20440mg/L ；MgS04.7H20370mg/L ；KH2P04310mg / L
[0021]微量元素:K10.83mg/ L ；H3B036.2mg / L ；MnS04.4H2022.3mg / L ；ZnSO4.7H208.6mg / L ；Na2Mo04.2H200.25mg / L ；CuSO4.5H200.25mg / L ；CoCl2.6H200.025mg / L
[0022]鐵鹽=FeSO4.7H2027.8mg / L ；Na2-EDTA.2H2037.3mg / L
[0023]有機(jī)物質(zhì):肌醇lOOmg/L ;煙酸0.5mg/L ;鹽酸批卩多醇(維生素Β6)0.5mg/L ;鹽酸硫胺素(維生素BI) 0.lmg/L ;甘氨酸2.0mg / L
[0024]6-BA1.0mg/L ；NAA0.5mg/L。[0025]在本發(fā)明實(shí)施方案中，少女石竹的組織培養(yǎng)步驟1中少女石竹外植體的滅菌處理過程為:在超凈臺上放入無菌容器中，在每升滴加2-3滴“ 1冊611”的75%的酒精中浸泡10秒，再用0.15%的升汞溶液處理5分鐘，無菌水洗2次，最后無菌濾紙上吸干水分。
[0026]在本發(fā)明實(shí)施方案中，少女石竹的組織培養(yǎng)步驟2接種過程中，少女石竹嫩枝莖尖葉原基切口插入培養(yǎng)基。
[0027]本發(fā)明還經(jīng)過比較試驗(yàn)，篩選出少女石竹組培各個階段最佳培養(yǎng)基:
[0028]￡1.初代誘導(dǎo)培養(yǎng)基:13+6-8六0.011118 / [+^^0.051^ / [是少女石竹最佳的初代誘導(dǎo)培養(yǎng)基，不但誘導(dǎo)率高，而且每個外植體新增芽數(shù)多，分化率最高，其分化率可達(dá)200%。
[0029]I繼代增殖培養(yǎng)基:13+6-840.01呢/1+嫩八0.05^ / 1,高濃度的6-8八對少女石竹增殖有抑制作用，濃度過高，可抑制芽的生長，隨著6-8八濃度的增高，當(dāng)6-8八濃度超過
0.21118丨[時，叢生矮化明顯，易產(chǎn)生玻璃化苗。
[0030]0.生根培養(yǎng)基:1 / 213+18八0.05呢/匕低鹽濃度對少女石竹的生根有利。
[0031]少女石竹無論在初代培養(yǎng)還是在繼代培養(yǎng)中，在13+6-840.01^/1+^0.05^ /I培養(yǎng)中，對叢生芽的生長都有促進(jìn)作用，相比其他組合更為理想，叢生芽數(shù)量多，幼苗較大，移植出苗率效果最佳。
[0032]本發(fā)明具體實(shí)施方案中還包括少女石竹生根后的煉苗移栽階段，結(jié)果表明，蛭石+羊糞+磷酸二銨作為栽培基質(zhì)效果最佳，非常適合小苗根系的生長。
【具體實(shí)施方式】
[0033]實(shí)施例1.少女石竹外植體的選`取和操作方法對不定芽誘導(dǎo)的影響
`[0034]實(shí)驗(yàn)用的少女石竹采于自內(nèi)蒙古和信園蒙草抗旱綠化股份有限公司抗旱植物研究院實(shí)驗(yàn)基地的試驗(yàn)苗圃，根據(jù)試驗(yàn)進(jìn)展、不同時期取樣并隨時取樣補(bǔ)充。采少女石竹幼嫩枝條上長約0.5-1.0(^的莖尖，經(jīng)流水沖洗后，用70%的酒精浸泡1086(3，然后用0.1%的升汞消毒5111111，無菌水沖洗2次，每次5111111，接種于改良的初代培養(yǎng)基(13)上，建立試管苗無性繁殖系。選取繼代10(1左右的叢生芽，叢生芽剪去基部；取叢生芽的莖尖，長約
0.5-1.0(3111，作為再生的外植體。
[0035]其中，改良的初代13培養(yǎng)基是改變13培養(yǎng)基中部分無機(jī)鹽和離子濃度的離子平衡溶液，用于少女石竹初代培養(yǎng)的基本培養(yǎng)基，其具體組成為:
[0036]大量元素:謂03950呢71；順4勵3825呢/1 ；03012 ?2??！20220呢丨 I ；%804 ?7^0185^/
I；腿2？0485呢丨I
[0037]微量元^:1(10.831118/1438036.21118 丨 I ；111804 ? 4^022.3111^/1 ；211804 # 7?。?08.6111? 丨 I ；^821004 # 21^00.；011804 # 5！！200.25?& 丨 I ；00012.6400.025呢/1
[0038]鐵鹽:？6804.74027.8呢丨 I ；恥2-20！'八.2112037.3呢/1
[0039]有機(jī)物質(zhì):肌醇100呢/ I ；煙酸0.5呢/ I ；鹽酸吡卩多醇(維生素86)0.5^/1 ；鹽酸硫胺素(維生素81)0.1^/1 ；甘氨酸2.0^/1
[0040]6-8八2.5呢/ I ；嫩八1.0呢/ I ；活性炭1^/1 ；水解絡(luò)蛋白0.5^/1 ；抗生素50^/匕[0041]實(shí)施例2.少女石竹組織培養(yǎng)各個階段最佳培養(yǎng)基的篩選
[0042]1、篩選效果的統(tǒng)計(jì)計(jì)算公式
[0043]成活率=(有生活力的外植體數(shù)/接種的外植體總數(shù))X 100%
[0044]初代芽誘導(dǎo)率=(出芽的外植體數(shù)/接種的外植體總數(shù))X 100%
[0045]繼代增殖倍數(shù)=(誘導(dǎo)出的叢生芽數(shù)/接入單株芽的總數(shù))X 100%
[0046]生根率=(分化根的外植體數(shù)/接種的外植體總數(shù))X 100%
[0047]2、石竹組織培養(yǎng)各個階段最佳培養(yǎng)基的篩選
[0048]以MS為基本培養(yǎng)基，用3.5g / L的卡拉膠作固化劑，3%的食用白糖代替蔗糖作為碳源，以自來水代替蒸餾水，分別添加不同配比的細(xì)胞分裂素和生長素進(jìn)行培養(yǎng)基的篩選。
[0049]2.1、誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基的選擇
[0050]將6-BA 的濃度設(shè) 0.01mg / L、0.05mg / L、0.1mg/L、0.2mg / L、0.5mg/L 五個濃度梯度，NAA的濃度設(shè)0.01mg / L、0.05mg/L、0.1mg / L、0.2mg/L四個濃度梯度,進(jìn)行不同組配，接種時每瓶接2-3個少女石竹莖尖(莖尖長約0.5-lcm)，觀察莖尖在不同培養(yǎng)基上不定芽的發(fā)生情況。
[0051]從表1可見，7種激素組合均可誘導(dǎo)少女石竹分化叢生芽，但各個組合的分化率不同，I號MS+6-BA0.01mg/L+NAA0.05mg / L是少女石竹莖尖培養(yǎng)基是最佳的誘導(dǎo)培養(yǎng)基，不但誘導(dǎo)率高，而且每個外植體新增芽數(shù)多，分化率最高，其分化率可達(dá)200 %。
[0052]表1激素濃度及其組合對少女石竹莖尖叢生芽誘導(dǎo)的影響
[0053]
【權(quán)利要求】
1.一種少女石竹的組織培養(yǎng)方法，其特征在于它由以下步驟組成: 步驟1:采少女石竹幼嫩枝條上長約0.5-1.00111的莖尖，滅菌處理后接種于改良的13培養(yǎng)基，選取繼代10(1左右的叢生芽，叢生芽剪去基部；取叢生芽的莖尖，長約0.5-1.0挪，作為再生的外植體； 步驟2:將外植體接種于初代誘導(dǎo)培養(yǎng)基13+6-840.01^/1+^0.05呢/1上，誘導(dǎo)分化出叢生芽； 步驟3:將初代誘導(dǎo)的叢生芽在繼代培養(yǎng)基13 + 6-840.01^/1 +嫩八0.05^/1上培養(yǎng)3代，然后將其叢生芽在改良的13培養(yǎng)基上培養(yǎng)2代，最后將上述的叢生芽在繼代培養(yǎng)基上培養(yǎng)一代后，將其轉(zhuǎn)移到生根培養(yǎng)基1/213 + 18^0.05^/1上培養(yǎng)； 步驟4:將上述誘導(dǎo)生根后的少女石竹生根苗進(jìn)行移栽。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的培養(yǎng)方法，其特征在于，各步驟的培養(yǎng)條件為:培養(yǎng)溫度25±1.0，光照強(qiáng)度2500匕，除白天自然光照外，夜間補(bǔ)光4小時/天。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的培養(yǎng)方法，其特征在于，步驟1的外植體的滅菌處理過程為:在超凈臺上放入無菌容器中，在每升滴加2-3滴“ 1冊611”的75%的酒精中浸泡10秒，再用0.15%的升汞溶液處理5分鐘，無菌水洗2次，最后無菌濾紙上吸干水分。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的培養(yǎng)方法，其特征在于，步驟1接種過程中，少女石竹嫩枝莖尖葉原基切口插入培養(yǎng)基。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的培養(yǎng)方法，其特征在于，步驟3移栽后栽培的基質(zhì)由蛭石、羊糞、磷酸二銨組成。
【文檔編號】A01H4/00GK103828716SQ201310714887
【公開日】2014年6月4日 申請日期:2013年12月13日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月13日
【發(fā)明者】馬懷林, 王召明, 高秀梅, 田志來 申請人:內(nèi)蒙古和信園蒙草抗旱綠化股份有限公司