一種兜唇石斛組培快速繁殖的方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種兜唇石斛組培快速繁殖的方法，通過(guò)將兜唇石斛自交開(kāi)裂的成熟種子萌發(fā)，原球莖的形成及分化，以及生根培養(yǎng)后得到完整植株并移栽成活。與傳統(tǒng)的高位芽截取或分株的繁殖方法相比，本發(fā)明采用組培技術(shù)進(jìn)行兜唇石斛繁殖，通過(guò)原球莖的途徑進(jìn)行兜唇石斛的組培，其繁殖速度快，能獲得大量種苗，苗生長(zhǎng)健壯，不僅能在短期內(nèi)培育大量性狀一致的兜唇石斛種苗，移栽成活率高，滿足市場(chǎng)需求，而且具有成本低，周期短，產(chǎn)出高等諸多優(yōu)勢(shì)。
【專利說(shuō)明】一種兜唇石斛組培快速繁殖的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種兜唇石斛組培快速繁殖的方法，屬于植物組織培養(yǎng)【技術(shù)領(lǐng)域】。
【背景技術(shù)】
[0002]5?唇石斛(/--/?.aphyllum (Roxb.) C.E.Fischer)又名天弓石斛、倒垂春石斛， 為蘭科石斛屬多年生附生草本植物，生于海拔400~1500米，陽(yáng)光充足的常綠闊葉林中樹(shù)干上或疏林下巖石上，主要分布于我國(guó)云南及印度、緬甸、泰國(guó)、老撾、越南、馬來(lái)西亞等國(guó)家。它既是重要的觀賞植物，同時(shí)又是商品中藥材石斛的重要原植物之一，以鮮莖或干燥莖入藥，是我國(guó)民間習(xí)用藥用石斛種類之一。兜唇石斛清熱除煩，清肝息風(fēng)，利尿解毒。治熱病津傷之煩渴，肝陽(yáng)上亢證，食物中毒。主治咳嗽、咽喉痛、口干舌燥、燒傷燙傷。
[0003]隨著人們對(duì)兜唇石斛的藥用需求量的增大，國(guó)內(nèi)野生資源日趨減少，野生植株遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足人們的日常需求，為了能在滿足人們需求的同時(shí)又能保護(hù)野生資源，走可持續(xù)發(fā)展道路，就迫切需要進(jìn)行人工栽培途經(jīng)提供原料。目前，國(guó)內(nèi)繁殖兜唇石斛的方法主要有高位芽截取、分株繁殖等，這些方法對(duì)母本材料要求高，用量大，還受到季節(jié)的限制，難以進(jìn)行規(guī)模化、標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)和優(yōu)良品種的大面積推廣。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]為解決現(xiàn)有技術(shù)難以對(duì)兜唇石斛進(jìn)行規(guī)模化、標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)，且培育周期長(zhǎng)等問(wèn)題， 本發(fā)明提供了一種兜唇石斛組培快速繁殖的方法，采用組培技術(shù)進(jìn)行兜唇石斛繁殖，通過(guò)原球莖的途徑進(jìn)行兜唇石斛的組織培養(yǎng)能獲得大量種苗，不僅能在短期內(nèi)培育大量性狀一致的兜唇石斛種苗，滿足市場(chǎng)需求，對(duì)兜唇石斛野外資源的保護(hù)也具有十分重要的意義。
[0005]本發(fā)明通過(guò)下列技術(shù)方案實(shí)現(xiàn):一種兜唇石斛組培快速繁殖的方法，其特征在于經(jīng)過(guò)下列步驟:
(1)將3?唇石斛自交開(kāi)裂的 成熟種子用3%的過(guò)氧化氫滅菌10~15min后，吸干表面液體，再將種子接種于下列原球莖誘導(dǎo)培養(yǎng)基中:
MS培養(yǎng)液
6-芐胺基嘌呤6-BA0.01~0.5mg/L
蔡乙酸 NAA0.05 ~0.5mg/L
鹿糖30000mg/L
瓊脂4500mg/L
香蕉50000mg/L
土豆25000mg/L
pH5.8 ~6.0,
在光照強(qiáng)度為1500~20001x、溫度為25±2°C、光照時(shí)間為10~12h/d的條件下，培養(yǎng)20~30天，得到膨大的原球莖，繼續(xù)培養(yǎng)50~60天，使原球莖分化成小苗；
(2)將步驟(1)所得小苗轉(zhuǎn)接到下列增殖培養(yǎng)基中:1/2MS培養(yǎng)液
6-芐胺基嘌呤6-BA0.01~0.5mg/L
蔡乙酸 NAA0.05 ~0.5mg/L
鹿糖30000mg/L
瓊脂4500mg/L
香蕉50000mg/L
土豆25000mg/L
pH5.8 ~6.0,
在與步驟(1)相同的培養(yǎng)條件下進(jìn)行繼代培養(yǎng)7~10次，每次培養(yǎng)周期為45~60d， 得到叢生芽；
(3)當(dāng)步驟(2)的增殖基數(shù)達(dá)到生產(chǎn)所需量時(shí)，將步驟(2)所得2cm以下的叢生芽返回步驟(2)繼續(xù)繼代培養(yǎng)，2cm以上的健壯叢生芽接種到下列培養(yǎng)基中:
1/2MS培養(yǎng)液
蔡乙酸 NAA0.1 ~0.5mg/L
吲哚丁酸 IBA0.1 ~0.5mg/L
鹿糖30000mg/L
瓊脂5000mg/L
香蕉50000mg/L
土豆25000mg/L
活性炭500~1000mg/L
pH5.8 ~6.0,
在光照強(qiáng)度為1500~20001x、溫度為25±2°C、光照時(shí)間為10~12h/d的條件下進(jìn)行生根培養(yǎng)45~60d，得到生根苗；
(4)將步驟(3)所得生根苗于室外散射光下進(jìn)行常規(guī)煉苗6~8d后，將生根苗經(jīng)常規(guī)洗凈其培養(yǎng)基，置于質(zhì)量濃度為5~10%的多菌靈溶液中消毒30min，再晾干水分后用細(xì)鋸木移栽種植于通風(fēng)溫室中，保持濕度為70~80%、溫度為15~28°C，即完成兜唇石斛組織培養(yǎng)快速繁殖。
[0006]所述步驟(2)和(3)中的1/2MS培養(yǎng)基是常規(guī)MS培養(yǎng)液中全量元素濃度減半的培養(yǎng)液。
[0007] 本發(fā)明具有下列優(yōu)點(diǎn)和效果:
(1)用組培繁殖技術(shù)在培養(yǎng)室內(nèi)即可實(shí)現(xiàn)周年生產(chǎn)，既節(jié)約了土地資源，又提高了經(jīng)濟(jì)效益，克服了種苗無(wú)法周年進(jìn)行生產(chǎn)的難點(diǎn)；
(2)用自然成熟自交開(kāi)裂的種子進(jìn)行組培，采用無(wú)菌培養(yǎng)，提高了種子組培繁殖的成活率；用過(guò)氧化氫代替?zhèn)鹘y(tǒng)的升汞進(jìn)行滅菌，減少了對(duì)環(huán)境的污染；
(3)繁殖速度快，45~60天為一個(gè)周期，繁殖倍數(shù)可達(dá)3~5，苗生長(zhǎng)健壯；
(4)對(duì)整個(gè)兜唇石斛種苗生產(chǎn)技術(shù)流程中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)進(jìn)行優(yōu)化整合，對(duì)培養(yǎng)基進(jìn)行改進(jìn)，分別采用全量元素減半的1/2MS培養(yǎng)液，減少藥品用量，節(jié)約成本，同步進(jìn)行芽誘導(dǎo)和增殖培養(yǎng)，簡(jiǎn)化了組培技術(shù)的培養(yǎng)程序，只需兩種配方的培養(yǎng)基，不經(jīng)過(guò)愈傷組織的形成， 直接長(zhǎng)成新芽，發(fā)根多，減少不定芽發(fā)生變異的機(jī)率，可有效控制變異株的產(chǎn)生，移栽成活率高，可達(dá)90%，有利于安排生產(chǎn)計(jì)劃。具有成本低，周期短，產(chǎn)出高等諸多優(yōu)勢(shì)。
【具體實(shí)施方式】
[0008]為了更好地說(shuō)明本發(fā)明，下面給出本發(fā)明的實(shí)施例，但本發(fā)明的內(nèi)容并不僅限于此。
[0009]實(shí)施例1
(1)將兜唇石斛自交開(kāi)裂的成熟種子用3%的過(guò)氧化氫滅菌IOmin后，吸干表面液體，再將種子接種于下列原球莖誘導(dǎo)培養(yǎng)基中:
MS培養(yǎng)液
6-芐胺基嘌呤6-BA0.2mg/L
蔡乙酸 NAA0.lmg/L
鹿糖30000mg/L
瓊脂4500mg/L
香蕉50000mg/L
土豆25000mg/L
pH5.8，`在光照強(qiáng)度為15001x、溫度為27°C、光照時(shí)間為10h/d的條件下，培養(yǎng)20天，得到膨大的原球莖，繼續(xù)培養(yǎng)55天，使原球莖分化成小苗；
(2)將步驟(1)所得小苗轉(zhuǎn)接到下列增殖培養(yǎng)基中:
1/2MS培養(yǎng)液
6-芐胺基嘌呤6-BA0.05mg/L
蔡乙酸 NAA0.2mg/L
鹿糖30000mg/L
瓊脂4500mg/L
香蕉50000mg/L
土豆25000mg/L
pH6.0，
在與步驟(1)相同的培養(yǎng)條件下進(jìn)行繼代培養(yǎng)7次，每次培養(yǎng)周期為60d，得到叢生
芽；
(3)當(dāng)步驟(2)的增殖基數(shù)達(dá)到生產(chǎn)所需量時(shí)，將步驟(2)所得2cm以下的叢生芽返回步驟(2)繼續(xù)繼代培養(yǎng)，2cm以上的健壯叢生芽接種到下列培養(yǎng)基中:
1/2MS培養(yǎng)液
蔡乙酸 NAA0.3mg/L
吲哚丁酸 IBA0.2mg/L
鹿糖30000mg/L
瓊脂5000mg/L
香蕉50000mg/L
土豆25000mg/L
活性炭500mg/LpH5.8，
在光照強(qiáng)度為20001x、溫度為27°C、光照時(shí)間為llh/d的條件下進(jìn)行生根培養(yǎng)50d，得到生根苗；
(4)將步驟(3)所得生根苗于室外散射光下進(jìn)行常規(guī)煉苗8d后，將生根苗經(jīng)常規(guī)洗凈其培養(yǎng)基，置于質(zhì)量濃度為8%的多菌靈溶液中消毒30min，再晾干水分后用細(xì)鋸木移栽種植于通風(fēng)溫室中，保持濕度為80%、溫度為25°C，即完成兜唇石斛組織培養(yǎng)快速繁殖。移栽成活率可達(dá)90%。
[0010]實(shí)施例2
(1)將兜唇石斛自交開(kāi)裂的成熟種子用3%的過(guò)氧化氫滅菌13min后，吸干表面液體，再將種子接種于下列原球莖誘導(dǎo)培養(yǎng)基中:
MS培養(yǎng)液
6-芐胺基嘌呤6-BA0.5mg/L
蔡乙酸 NAA0.05 ~0.5mg/L
鹿糖30000mg/L
瓊脂4500mg/L
香蕉50000mg/L
土豆25000mg/L
pH5.9
在光照強(qiáng)度為18001x、溫度為25°C、光照時(shí)間為llh/d的條件下，培養(yǎng)25天，得到膨大的原球莖，繼續(xù)培養(yǎng)50天，使原球莖分化成小苗；
(2)將步驟(1)所得小苗轉(zhuǎn)接到下列增殖培養(yǎng)基中:
1/2MS培養(yǎng)液
6-芐胺基嘌呤6-BA0.01mg/L
蔡乙酸 NAA0.5mg/L
鹿糖30000mg/L
瓊脂4500mg/L
香蕉50000mg/L
土豆25000mg/L
pH5.9，
在與步驟(1)相同的培養(yǎng)條件下進(jìn)行繼代培養(yǎng)9次，每次培養(yǎng)周期為50d，得到叢生
芽；
(3)當(dāng)步驟(2)的增殖基數(shù)達(dá)到生產(chǎn)所需量時(shí)，將步驟(2)所得2cm以下的叢生芽返回步驟(2)繼續(xù)繼代培養(yǎng)，2cm以上的健壯叢生芽接種到下列培養(yǎng)基中:
1/2MS培養(yǎng)液
蔡乙酸 NAA0.5mg/L
吲哚丁酸 IBA0.5mg/L
鹿糖30000mg/L
瓊脂5000mg/L
香蕉50000mg/L土豆25000mg/L
活性炭750mg/L
pH6.0，
在光照強(qiáng)度為15001x、溫度為23°C、光照時(shí)間為12h/d的條件下進(jìn)行生根培養(yǎng)60d，得到生根苗；
(4)將步驟(3)所得生根苗于室外散射光下進(jìn)行常規(guī)煉苗7d后，將生根苗經(jīng)常規(guī)洗凈其培養(yǎng)基，置于質(zhì)量濃度為5%的多菌靈溶液中消毒30min，再晾干水分后用細(xì)鋸木移栽種植于通風(fēng)溫室中，保持濕度為75%、溫度為15°C，即完成兜唇石斛組織培養(yǎng)快速繁殖。移栽成活率可達(dá)90%。
[0011] 實(shí)施例3
(1)將兜唇石斛自交開(kāi)裂的成熟種子用3%的過(guò)氧化氫滅菌15min后，吸干表面液體，再將種子接種于下列原球莖誘導(dǎo)培養(yǎng)基中:
MS培養(yǎng)液
6-芐胺基嘌呤6-BA0.01mg/L
蔡乙酸 NAA0.05mg/L
鹿糖30000mg/L
瓊脂4500mg/L
香蕉50000mg/L
土豆25000mg/L
pH6.0，
在光照強(qiáng)度為20001x、溫度為27°C、光照時(shí)間為12h/d的條件下，培養(yǎng)30天，得到膨大的原球莖，繼續(xù)培養(yǎng)60天，使原球莖分化成小苗；
(2)將步驟(1)所得小苗轉(zhuǎn)接到下列增殖培養(yǎng)基中:
1/2MS培養(yǎng)液
6-芐胺基嘌呤6-BA0.5mg/L
蔡乙酸 NAA0.05mg/L
鹿糖30000mg/L
瓊脂4500mg/L
香蕉50000mg/L
土豆25000mg/L
pH5.8，
在與步驟(1)相同的培養(yǎng)條件下進(jìn)行繼代培養(yǎng)10次，每次培養(yǎng)周期為45d，得到叢生
芽；
(3)當(dāng)步驟(2)的增殖基數(shù)達(dá)到生產(chǎn)所需量時(shí)，將步驟(2)所得2cm以下的叢生芽返回步驟(2)繼續(xù)繼代培養(yǎng)，2cm以上的健壯叢生芽接種到下列培養(yǎng)基中:
1/2MS培養(yǎng)液
蔡乙酸 NAA0.lmg/L
吲哚丁酸 IBA0.lmg/L
鹿糖 30000mg/L瓊脂5000mg/L
香蕉50000mg/L
土豆25000mg/L
活性炭1000mg/L
pH5.9，
在光照強(qiáng)度為18001x、溫度為25°C、光照時(shí)間為10h/d的條件下進(jìn)行生根培養(yǎng)45d，得到生根苗；
(4)將步驟(3)所得生根苗于室外散射光下進(jìn)行常規(guī)煉苗6d后，將生根苗經(jīng)常規(guī)洗凈其培養(yǎng)基，置于質(zhì)量濃度為10%的多菌靈溶液中消毒30min，再晾干水分后用細(xì)鋸木移栽種植于通風(fēng)溫室中，保持濕度為70%、溫度為28°C，即完成兜唇石斛組織培養(yǎng)快速繁殖。移栽 成活率可達(dá)90%。
【權(quán)利要求】
1.一種兜唇石斛組培快速繁殖的方法，其特征在于經(jīng)過(guò)下列步驟:(1)將3?唇石斛自交開(kāi)裂的成熟種子用3%的過(guò)氧化氫滅菌10~15min后，吸干表面液體，再將種子接種于下列原球莖誘導(dǎo)培養(yǎng)基中:MS培養(yǎng)液6-芐胺基嘌呤6-BA0.01~0.5mg/L蔡乙酸 NAA0.05 ~0.5mg/L鹿糖30000mg/L瓊脂4500mg/L香蕉50000mg/L土豆25000mg/LpH5.8 ~6.0,在光照強(qiáng)度為1500~20001x、溫度為25±2°C、光照時(shí)間為10~12h/d的條件下，培養(yǎng)20~30天，得到膨大的原球莖，繼續(xù)培養(yǎng)50~60天，使原球莖分化成小苗；(2)將步驟(1)所得小苗轉(zhuǎn)接到下列增殖培養(yǎng)基中:1/2MS培養(yǎng)液6-芐胺基嘌呤6-BA0.01~0.`5mg/L蔡乙酸 NAA0.05 ~0.5mg/L鹿糖30000mg/L瓊脂4500mg/L香蕉50000mg/L土豆25000mg/LpH5.8 ~6.0,在與步驟(1)相同的培養(yǎng)條件下進(jìn)行繼代培養(yǎng)7~10次，每次培養(yǎng)周期為45~60d， 得到叢生芽；(3)當(dāng)步驟(2)的增殖基數(shù)達(dá)到生產(chǎn)所需量時(shí)，將步驟(2)所得2cm以下的叢生芽返回步驟(2)繼續(xù)繼代培養(yǎng)，2cm以上的健壯叢生芽接種到下列培養(yǎng)基中:1/2MS培養(yǎng)液蔡乙酸 NAA0.1 ~0.5mg/L吲哚丁酸 IBA0.1 ~0.5mg/L鹿糖30000mg/L瓊脂5000mg/L香蕉50000mg/L土豆25000mg/L活性炭500~1000mg/LpH5.8 ~6.0,在光照強(qiáng)度為1500~20001x、溫度為25±2°C、光照時(shí)間為10~12h/d的條件下進(jìn)行生根培養(yǎng)45~60d，得到生根苗；(4)將步驟(3)所得生根苗于室外散射光下進(jìn)行常規(guī)煉苗6~8d后，將生根苗經(jīng)常規(guī)洗凈其培養(yǎng)基，置于質(zhì)量濃度為5~10%的多菌靈溶液中消毒30min，再晾干水分后用細(xì)鋸木移栽種植于通風(fēng)溫室中，保持濕度為70~80%、溫度為15~28°C，即完成兜唇石斛組織培養(yǎng)快速繁殖。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述兜唇石斛組培快速繁殖的方法，其特征在于:所述步驟(2)和(3)中的1/2MS培養(yǎng)基是常規(guī)MS培養(yǎng)液中全量元素濃度減半的培養(yǎng)液。
【文檔編號(hào)】A01H4/00GK103598101SQ201310630691
【公開(kāi)日】2014年2月26日 申請(qǐng)日期:2013年12月2日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月2日
【發(fā)明者】曹樺, 李紳崇, 楊春梅, 王繼華, 汪國(guó)鮮, 吳麗芳, 趙培飛, 單芹麗, 阮繼偉, 許鳳 申請(qǐng)人:云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院花卉研究所