多肋藻配子體克隆雜交育苗技術(shù)的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及多肋藻（Costaria?costata）配子體克隆雜交育苗技術(shù)，即克隆培養(yǎng)分離多肋藻雌、雄配子體并利用其進(jìn)行雜交育苗。步驟如下：1）清洗剪切多肋藻孢子體；2）陰干使其釋放游孢子；3）培養(yǎng)附著的游孢子；4）發(fā)育成配子體后刮下、打碎、培養(yǎng)；5）分離雌、雄配子體；6）打碎、克隆培養(yǎng)獲得大量雌、雄配子體；7）將雌、雄配子體雜交育出幼孢子體；8）轉(zhuǎn)移至海上暫養(yǎng)；9）一個(gè)月后，分苗，海上養(yǎng)殖，獲得成熟孢子體。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)為：通過(guò)分離高純度多肋藻雌、雄配子體，并進(jìn)行克隆培養(yǎng)，獲得大量用于育苗的雌、雄配子體種質(zhì)材料，育苗時(shí)間不受季節(jié)限制，可滿足未來(lái)對(duì)多肋藻的生產(chǎn)及科研需要。
【專利說(shuō)明】多肋藻配子體克隆雜交育苗技術(shù)
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及多肋藻配子體克隆雜交育苗技術(shù)，具體地說(shuō)就是建立一種有效的分離多肋藻雌、雄配子體、克隆培養(yǎng)雌、雄配子體以及通過(guò)雌、雄配子體雜交繁育出多肋藻種苗的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]多肋藻是一種具有較高經(jīng)濟(jì)價(jià)值的一年生大型褐藻，其富含碘以及多種人體必需的微量元素，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高，口感好，味道鮮美，為海藻中的上等營(yíng)養(yǎng)佳品。多肋藻還是海藻工業(yè)的重要原材料，多肋藻具有提取褐藻膠、甘露醇、鉀等化工原料以及制備褐藻淀粉的應(yīng)用潛力。另外，多肋藻產(chǎn)生的次級(jí)代謝物一褐藻多酚類化合物具有抗腫瘤、抑菌以及抗氧化活性。因此，多肋藻是一種具有廣闊應(yīng)用前景的經(jīng)濟(jì)褐藻。迄今為止，尚未有關(guān)于多肋藻配子體克隆雜交技術(shù)的報(bào)道及專利申請(qǐng)，為實(shí)現(xiàn)我國(guó)海藻養(yǎng)殖新品種多肋藻的人工養(yǎng)殖，促進(jìn)海藻養(yǎng)殖業(yè)多元化、生態(tài)化、規(guī)?；l(fā)展，我們開發(fā)出一種簡(jiǎn)單高效的多肋藻配子體克隆雜交育苗技術(shù)。
[0003]
【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的在于建立了多肋藻雌、雄配子體分離技術(shù)、克隆培養(yǎng)技術(shù)以及雜交技術(shù)進(jìn)行多肋藻種苗繁育的技術(shù)。
[0005]多肋藻配子體克隆雜交育苗技術(shù)，可按如下步驟操作，
O取帶孢子囊的多肋藻成熟孢子體，在無(wú)菌海水中清洗5次，并用消毒刀片剪切10X10 Cm組織塊；
2)將組織塊用脫脂棉擦干置于10°C、黑暗條件下陰干2 h后，放入盛有無(wú)菌海水培養(yǎng)液及載玻片的的燒杯中，轉(zhuǎn)移至光照培養(yǎng)箱中8 0C >5 μ mol.m_2.s_\光周期為12:12 h(L:D)附著 24 h ；
3)除去組織塊，顯微鏡下觀察到游孢子附著在載玻片后，取出載玻片放入新的盛有無(wú)菌海水的燒杯中，在10 0C>20 μπιο?.π 2 ?s—1，光周期為12:12 h (L:D)條件下培養(yǎng)15 d，每周換一次無(wú)菌海水培養(yǎng)液；
4)待游孢子發(fā)育成配子體時(shí)，用滅菌的解剖刀輕輕刮下配子體，用攪拌器(JYD-P11S81，九陽(yáng))打碎10 S，倒入錐形瓶中進(jìn)行懸浮培養(yǎng)10 d，培養(yǎng)條件為10 °C >20μ mol.m2.s'光周期為 12:12 h (L:D)；
5)顯微鏡下可以區(qū)分雌、雄配子體后，用將配子體搖勻，取少量在培養(yǎng)皿中用無(wú)菌海水培養(yǎng)液稀釋至密度為2個(gè)配子體/視野(10X10)，顯微鏡下用毛細(xì)管分離雌、雄配子體并分別放置到裝有無(wú)菌海水培養(yǎng)液的錐形瓶中；
6)在10°C >20 μ mol.m_2.s_\光周期為12:12 h (L:D)培養(yǎng)條件下,每周換一次無(wú)菌海水培養(yǎng)液克隆培養(yǎng)雌、雄配子21 d，形成肉眼可見的絨毛狀配子體，用攪拌器打碎10S，倒入錐形瓶中，在相同條件下懸浮培養(yǎng)31 d，獲得大量雌、雄配子體種質(zhì)材料；
7)取雌、雄配子體按1:1混合，倒入放有直徑3mm棕繩的燒杯中在15 °C >40μ mol.m-2.s-1,光周期為12:12 h (L:D)條件下培養(yǎng)28 d,每周換一次無(wú)菌海水培養(yǎng)液；
8)當(dāng)棕繩上長(zhǎng)出肉眼可見的幼孢子體(長(zhǎng)度0.5-lcm)時(shí)，可將其轉(zhuǎn)移至海上暫養(yǎng)；
9)暫養(yǎng)一個(gè)月后，分苗，海上養(yǎng)殖5-6個(gè)月，獲得成熟的多肋藻孢子體。
[0006]所述無(wú)菌海水培養(yǎng)液組成為200 μ mol.L^1KNO3, 20 μ mol.L4KH2PO4的無(wú)菌海水。
本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)
. 1.建立了多肋藻雌、雄配子體的分離方法，并通過(guò)克隆培養(yǎng)，獲得大量的雌、雄配子體種質(zhì)材料，可滿足多肋藻種質(zhì)保存、育苗以及各種科學(xué)研究及生產(chǎn)的需求。
[0007]2.多肋藻配子體克隆雜交育苗技術(shù)，是一種高效成熟的多肋藻育苗技術(shù)，填補(bǔ)了目前多肋藻育苗方面的空白。
[0008]3.多肋藻配子體克隆育苗技術(shù)的費(fèi)用低，在育苗過(guò)程中不需要復(fù)雜的設(shè)備和貴重藥品。
[0009]4.育種方式方便靈活，絕大多數(shù)步驟可在實(shí)驗(yàn)室完成，避免占用大面積空間，不需要大量人力物力。
[0010]5.育苗不受季節(jié)的限制。可以在任何時(shí)間和季節(jié)進(jìn)行育苗。
【具體實(shí)施方式】
[0011]應(yīng)用實(shí)例I
多肋藻雌、雄配子體的分離
2011年7月6日，取帶孢子囊的多肋藻成熟孢子體，在無(wú)菌海水中清洗5次，并用消毒刀片剪切10X10 cm組織塊；將組織塊用脫脂棉擦干置于10 °C、黑暗條件下陰干2 h，放置到盛有無(wú)菌海水培養(yǎng)液及9片載玻片的3 L燒杯中置于光照培養(yǎng)箱中附著培養(yǎng)24 h，附著培養(yǎng)條件為8 °C>5 μ mol.m-2.s-1'光周期為12:12 h (L:D);除去組織塊,顯微鏡下觀察到游孢子附著在載玻片上，取出載玻片放入新的盛有無(wú)菌海水的3L燒杯中，在10 0C >20μ mol.m-2.s-1，光周期為12:12 h (L:D)條件下培養(yǎng)15 d，每周換一次無(wú)菌海水培養(yǎng)液；待游孢子發(fā)育成配子體時(shí)，用滅菌的解剖刀輕輕刮下配子體，并用攪拌器(JYD-P11S81，九陽(yáng))打碎10 S，倒入錐形瓶中進(jìn)行懸浮培養(yǎng)10 d，培養(yǎng)條件為10 0C>20 μmolm-2.s-1，光周期為12:12 h (L:D);顯微鏡下可以區(qū)分雌、雄配子體后，將配子體搖勻，取少量在培養(yǎng)皿中用無(wú)菌海水培養(yǎng)液稀釋至密度為2個(gè)配子體/視野(10X10)，顯微鏡下用毛細(xì)管將雌、雄配子體分離并放置到裝有無(wú)菌海水培養(yǎng)液的500 ml錐形瓶；分別在10 0C >20 μ mol.m-2.s-1，光周期為12:12 h (L:D)條件下克隆培養(yǎng)雌、雄配子21 d，每周換一次無(wú)菌海水培養(yǎng)液，形成肉眼可見的絨毛狀配子體，用攪拌器打碎10 S，倒入I L錐形瓶中，在相同條件下懸浮培養(yǎng)31 d，獲得大量雌、雄配子體種質(zhì)材料。
[0012]應(yīng)用實(shí)例2 育苗及海上養(yǎng)殖
取雌、雄配子體濕重各15 mg混合,置于含有300 mL無(wú)菌海水以及直徑3 mm棕繩的燒杯中，15 °C >40 μ mol.m-2.s-1,光周期為12:12 h (L:D)條件下培養(yǎng)28 d,每周換一次無(wú)菌海水培養(yǎng)；2011年10月20日棕繩上長(zhǎng)出肉眼可見的小孢子體(長(zhǎng)度0.5-lcm)，將棕繩轉(zhuǎn)移至自然條件下暫 養(yǎng)；一個(gè)月后分苗，海上養(yǎng)殖5-6個(gè)月，獲得成熟的多肋藻孢子體。
【權(quán)利要求】
1.多肋藻配子體克隆雜交育苗技術(shù)，其特征在于:可按如下步驟操作， 1)用無(wú)菌海水清洗帶有孢子囊的多肋藻孢子體5次，剪切IOX10 Cm的組織塊； 2)將組織塊陰干處理2h后，放入盛有無(wú)菌海水及載玻片的燒杯中，待其釋放游孢子； 3)顯微鏡下觀察到游孢子附著在載玻片后，取出載玻片放入新的盛有無(wú)菌海水的燒杯中，在適宜條件下培養(yǎng)； 4)待游孢子發(fā)育成配子體時(shí)，將其從載玻片上輕輕刮下并打碎，倒入錐形瓶中懸浮培養(yǎng); 5)顯微鏡下可以區(qū)分雌、雄配子體后，利用毛細(xì)管分離出雌、雄配子體； 6)分別培養(yǎng)雌、雄配子體，形成肉眼可見的絨毛狀，打碎、再次進(jìn)行懸浮培養(yǎng)以獲得大量雌、雄配子體； 7)取雌、雄配子體按1:1比例混合，倒入放有棕繩的燒杯中培養(yǎng)； 8)當(dāng)棕繩上長(zhǎng)出肉眼可見的小孢子體(長(zhǎng)度約0.5-lcm)時(shí)，轉(zhuǎn)移到海上暫養(yǎng)； 9)暫養(yǎng)一個(gè)月后，分苗，海上養(yǎng)殖5-6個(gè)月，獲得成熟的多肋藻孢子體。
2.按照權(quán)力I所述多肋藻配子體克隆雜交育苗技術(shù)，其特征在于:陰干處理?xiàng)l件為10°C黑暗條件下2 h。
3.按照權(quán)力I所述多肋藻配子體克隆雜交育苗技術(shù)，其特征在于:無(wú)菌海水培養(yǎng)液的組成為 200 μ mo I.L—1 KNO3, 20 μ mo I.T1KH2PO4 的無(wú)菌海水。
4.按照權(quán)力I所述多肋藻配子體克隆雜交育苗技術(shù)，其特征在于:游孢子在培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)附著條件為8 °C >5 μ mo I.m_2.s_\光周期為12:12 h (L:D)。
5.按照權(quán)力I所述多肋藻配子體克隆雜交育苗技術(shù)，其特征在于:附著游孢子的培養(yǎng)條件為 10 0C>20 μ--ο?.m_2.S—1，光周期為 12:12 h (L:D)。
6.按照權(quán)力I所述多肋藻配子體克隆雜交育苗技術(shù)，其特征在于:配子體懸浮培養(yǎng)條件為 10 °C、20 μπιο?.m_2.s—1，光周期為 12:12 h (L:D)。
7.按照權(quán)力I所述多肋藻配子體克隆雜交育苗技術(shù)，其特征在于:取雌、雄配子體濕重各15 mg混合放入加有300 mL無(wú)菌海水和棕繩的燒杯中，培養(yǎng)條件為15 °C>40μ mol.m 2.s S 光周期為 12:12 h (L:D)。
【文檔編號(hào)】A01G33/00GK103704121SQ201310630579
【公開日】2014年4月9日 申請(qǐng)日期:2013年12月2日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月2日
【發(fā)明者】王高歌, 路博鈞, 帥麗玫, 李丹丹, 張蕊, 魏曉嬌 申請(qǐng)人:中國(guó)海洋大學(xué)