一種水稻抗除草劑轉(zhuǎn)基因逃逸導(dǎo)致環(huán)境風(fēng)險的檢測評價方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于轉(zhuǎn)基因環(huán)境生物安全檢測分析【技術(shù)領(lǐng)域】，具體為一種水稻抗除草劑轉(zhuǎn)基因逃逸導(dǎo)致環(huán)境風(fēng)險的檢測評價方法。本發(fā)明利用人工修飾EPSP合成酶抗除草劑轉(zhuǎn)基因水稻和非轉(zhuǎn)基因水稻及其野生稻近緣種群體為分析材料，進行人工雜交，建立含有epsps轉(zhuǎn)基因和不含該轉(zhuǎn)基因的雜種F1群體以及含該轉(zhuǎn)基因和不含該轉(zhuǎn)基因的F2分離代實驗群體；將這些實驗群體分別在有草甘膦和無草甘膦的環(huán)境下進行不同方式種植，并對5個適合度相關(guān)性狀進行測量。通過計算轉(zhuǎn)基因?qū)θ后w帶來的復(fù)合適合度指數(shù)，檢測抗除草劑轉(zhuǎn)基因逃逸對野生近緣種帶來的環(huán)境風(fēng)險。本發(fā)明檢測結(jié)果準(zhǔn)確，效率高，對于抗除草劑轉(zhuǎn)基因水稻生產(chǎn)的環(huán)境安全保證具有良好的應(yīng)用前景。
【專利說明】一種水稻抗除草劑轉(zhuǎn)基因逃逸導(dǎo)致環(huán)境風(fēng)險的檢測評價方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于環(huán)境生物安全檢測分析【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及水稻抗除草劑轉(zhuǎn)基因Cepsps)逃逸導(dǎo)致的環(huán)境風(fēng)險檢測評價方法。
【背景技術(shù)】
[0002]轉(zhuǎn)基因技術(shù)的迅速發(fā)展，極大地推動了轉(zhuǎn)基因植物的培育和種植，轉(zhuǎn)基因作物的商品化應(yīng)用，為農(nóng)作物產(chǎn)量的提高、減少農(nóng)藥的施用、改善農(nóng)業(yè)生態(tài)環(huán)境以及糧食安全問題帶來了新的機遇。然而，轉(zhuǎn)基因作物商品化種植面臨的一個巨大瓶頸就是環(huán)境生物安全的檢測和評價，特別是作物轉(zhuǎn)基因的逃逸及其可能帶來的環(huán)境風(fēng)險，即轉(zhuǎn)基因通過基因漂移逃逸到作物的野生近緣種之后，可能帶來嚴(yán)重的雜草問題和野生近緣種群體的局部瀕危和滅絕等一系列后果。這種環(huán)境風(fēng)險的存在嚴(yán)重地制約了轉(zhuǎn)基因作物商品化種植的決策。因此，在商品化種植之前必須對轉(zhuǎn)基因逃逸可能帶來的潛在環(huán)境風(fēng)險進行檢測和評估，以確保轉(zhuǎn)基因作物的安全和可持續(xù)利用。
[0003]抗除草劑轉(zhuǎn)基因作物通過改變作物的抗除草劑性能和除草方式來提高生產(chǎn)效率，是目前種植面積最大的轉(zhuǎn)基因作物類型。但是對抗除草劑轉(zhuǎn)基因逃逸到作物的野生近緣種中是否會導(dǎo)致生態(tài)風(fēng)險，至今尚無有效的檢測和評價工具。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的是提供一種檢測評價抗除草劑轉(zhuǎn)基因逃逸后是否導(dǎo)致環(huán)境風(fēng)險的方法。
[0005]抗除草劑轉(zhuǎn)基因逃逸是否會帶來環(huán)境風(fēng)險，這在很大程度上取決于該轉(zhuǎn)基因逃逸到作物的野生近緣種后是否會導(dǎo)致作物野生近緣種適合度(指在一定條件環(huán)境下，生物體能夠生存并傳遞其基因給后代的能力)發(fā)生較大程度的改變，當(dāng)適合度有較大程度的增加(適合度利益)或降低(適合度成本)均可能導(dǎo)致不同的環(huán)境風(fēng)險。本發(fā)明利用抗除草劑轉(zhuǎn)基因i印sps)在人工受控的實驗條件下對水稻的野生近緣種群體帶來適合度“利益”和“成本”變化的關(guān)鍵性狀進行分析，對轉(zhuǎn)基因逃逸是否導(dǎo)致環(huán)境風(fēng)險以及風(fēng)險的程度進行檢測，以達到抗除草劑轉(zhuǎn)基因作物安全種植的目的。
[0006]本發(fā)明提出的抗除草劑轉(zhuǎn)基因逃逸導(dǎo)致的環(huán)境風(fēng)險的檢測評價方法，具體步驟包括:
(1)構(gòu)建含有人工修飾EPSP合成酶(印sps)抗除草劑轉(zhuǎn)基因和不含該轉(zhuǎn)基因的水稻野生近緣種實驗群體；
(2)設(shè)計用于轉(zhuǎn)基因逃逸導(dǎo)致環(huán)境風(fēng)險檢測的田間種植實驗；
(3)建立轉(zhuǎn)基因逃逸導(dǎo)致環(huán)境風(fēng)險的檢測和評價標(biāo)準(zhǔn)。
[0007]其中:步驟(1)所述構(gòu)建含有該人工修飾抗除草劑轉(zhuǎn)基因和不含該轉(zhuǎn)基因水稻野生近緣種實驗群體，是按照一定的組合方式，利用人工雜交的方法，獲得目標(biāo)轉(zhuǎn)基因水稻和野生近緣種的雜種F1代和自交分離F2代實驗群體來實現(xiàn)，具體步驟為:
選擇印sps抗除草劑轉(zhuǎn)基因水稻及其非轉(zhuǎn)基因親本品種，分別與野生近緣種的個體進行雜交，獲得含抗除草劑轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)基因水稻與其野生近緣種(包括雜草稻)的雜種F1群體CA),以及不含轉(zhuǎn)基因的水稻親本品種與野生近緣種的雜種F1群體(B);通過對含轉(zhuǎn)基因的雜種Fl群體(A)進行套袋自交，獲得F2代分離群體；同時利用目標(biāo)轉(zhuǎn)基因(印印^ DNA序列設(shè)計的引物，對F2代分離群體進行PCR擴增和檢測，鑒定含有轉(zhuǎn)基因的F2群體(C)和不含轉(zhuǎn)基因的F2群體(D);建立含有抗除草劑轉(zhuǎn)基因和不含轉(zhuǎn)基因的F2代實驗分離群體。
[0008]所獲得的含有抗除草劑轉(zhuǎn)基因的雜種F1群體(Α)、不含轉(zhuǎn)基因的雜種F1群體(B)，含有轉(zhuǎn)基因的自交F2分離群體(C)和不含轉(zhuǎn)基因的自交F2分離群體(D)，用于進行受控實驗條件下的適合度分析實驗。
[0009]步驟(2)所述設(shè)計用于轉(zhuǎn)基因逃逸導(dǎo)致環(huán)境風(fēng)險檢測的田間種植實驗，是將獲得的A、B、C、D實驗群體分別按20cm X 20cm (雜草稻)或40cm X 40cm (普通野生稻)的種植株間距離和行間距離，將含轉(zhuǎn)基因和不含轉(zhuǎn)基因的A和B群體或C和D群體在一個小區(qū)內(nèi)進行單一種植和相間混合種植(見圖1-3);即分為3種不同種植模式:(I)轉(zhuǎn)基因植株的單一種植模式，(2)非轉(zhuǎn)基因植株的單一種植模式，(3)轉(zhuǎn)基因植株和非轉(zhuǎn)基因植株的相間混合種植模式。
[0010]將受控的實驗環(huán)境分別設(shè)計為有除草劑選擇壓(草甘膦在水稻田中除草的正常使用量的1/4劑量)的環(huán)境和無除草劑選擇壓的環(huán)境，將上述實驗群體分別重復(fù)種植于有除草劑選擇壓的環(huán)境和無除草劑選擇壓的環(huán)境，并對實驗群體所有植株生活史各生長階段的適合度相關(guān)性狀分別進行測量。
[0011]步驟(3)所述建立抗除草劑轉(zhuǎn)基因逃逸之后導(dǎo)致環(huán)境風(fēng)險的檢測和評價標(biāo)準(zhǔn)，即建立復(fù)合適合度指數(shù)，來評價轉(zhuǎn)基因逃逸后帶來的環(huán)境風(fēng)險的程度，用％表示:· 各形態(tài)性狀的適合度指數(shù)(％)=(含轉(zhuǎn)基因植株的測量值-不含轉(zhuǎn)基因植株的測量值)/不含轉(zhuǎn)基因植株的測量值X 100% ；
復(fù)合適合度指數(shù)為5個形態(tài)性狀，即:株高，單株分蘗數(shù)，單株穗數(shù)，單株種子產(chǎn)量和結(jié)實率適合度指數(shù)的平均數(shù)。
[0012]通過復(fù)合適合度指數(shù)的值，評價轉(zhuǎn)基因逃逸之后導(dǎo)致的環(huán)境風(fēng)險(％)。復(fù)合適合度指數(shù)的絕對值即為環(huán)境風(fēng)險的評價值。復(fù)合適合度指數(shù)的絕對值越接近于0，環(huán)境風(fēng)險越低，反之風(fēng)險越高。
[0013]評價轉(zhuǎn)基因逃逸后導(dǎo)致的環(huán)境風(fēng)險程度，主要以F2群體的復(fù)合適合度指數(shù)為依據(jù)(因為含轉(zhuǎn)基因和不含轉(zhuǎn)基因F2分離群體的遺傳背景一致)，以F1群體的復(fù)合適合度指數(shù)為輔助參考。
[0014]本發(fā)明中，所述按照一定的組合方式，利用人工雜交獲得目標(biāo)轉(zhuǎn)基因水稻和野生近緣種的雜種F1代和自交分離F2代實驗群體，具體步驟為:
(1)確定雜交組合:
A.抗除草劑轉(zhuǎn)基因水稻X水稻野生近緣種；
B.非轉(zhuǎn)基因水稻X水稻野生近緣種；
(2)通過人工雜交，分別獲得含抗除草劑轉(zhuǎn)基因雜交組合A，以及不含轉(zhuǎn)基因組合B的雜種F1群體；(3)對組合A的雜種F1群體進行套袋自交和抗除草劑轉(zhuǎn)基因的分子檢測，鑒定F2分離群體中包含轉(zhuǎn)基因的個體和不包含轉(zhuǎn)基因的個體；
(4)基于鑒定結(jié)果，分別建立含抗除草劑轉(zhuǎn)基因的F2分離群體(+)和不含轉(zhuǎn)基因的F2分離群體(一)。
[0015]本發(fā)明中，所述適合度相關(guān)性狀的選擇和測量方法如下:
(1)株高(Cm):從植株的地面到最長莖、葉或穗頂端的高度；
(2)單株分蘗數(shù)(個):每一單個植株的所有分蘗數(shù)總合；
(3)單株穗數(shù)(個):每一單個植株所有的穗數(shù)總合；
(4)單株種子產(chǎn)量(粒):每一單個植株的所有飽滿種子數(shù)總合；
(5)結(jié)實率(％):單株飽滿種子數(shù)/單株總小花數(shù)X100%ο
[0016]本發(fā)明中，具體選擇如下適合度相關(guān)性狀數(shù)據(jù)進行測量和分析:
根據(jù)受控實驗中各處理含有轉(zhuǎn)基因的實驗群體和不含轉(zhuǎn)基因?qū)嶒炄后w所測量的數(shù)據(jù)的比較分析，來檢測轉(zhuǎn)基因?qū)σ吧壏N帶來的適合度利益或適合度成本，并以此為依據(jù)確定轉(zhuǎn)基因逃逸導(dǎo)致的環(huán)境風(fēng)險；如轉(zhuǎn)基因?qū)嶒炄后w帶來的適合度變化程度越高則轉(zhuǎn)基因逃逸的環(huán)境風(fēng)險越高，反之則風(fēng)險低或無風(fēng)險；
適合度利益或適合度成本的指數(shù)值(r )計算公式為: w =(含轉(zhuǎn)基因植株的測量值-不含轉(zhuǎn)基因植株的測量值)/不含轉(zhuǎn)基因植株的測
量值 X 100%........................................................................(I)
w的值變化在一c?~+ c?之間，當(dāng)r值為正值，表示存在適合度利益，當(dāng)r值為負(fù)值，表示存在適合度成本，當(dāng)r值為ο或接近于0，表示沒有適合度變化。
[0017]復(fù)合適合度指數(shù)(r_p)為各性狀適合度的平均值，計算公式為:
【權(quán)利要求】
1.一種水稻抗除草劑轉(zhuǎn)基因逃逸導(dǎo)致環(huán)境風(fēng)險的檢測評價方法，其特征在于具體步驟為: (1)構(gòu)建含有人工修飾EPSP合成酶(e/zs/zs)抗除草劑轉(zhuǎn)基因和不含該轉(zhuǎn)基因的水稻野生近緣種實驗群體； (2)設(shè)計用于轉(zhuǎn)基因逃逸導(dǎo)致環(huán)境風(fēng)險檢測的田間種植實驗； (3)建立轉(zhuǎn)基因逃逸導(dǎo)致環(huán)境風(fēng)險的檢測和評價標(biāo)準(zhǔn)； 其中: 步驟(1)所述構(gòu)建含有人工修飾抗除草劑轉(zhuǎn)基因和不含該轉(zhuǎn)基因水稻野生近緣種實驗群體，是按照一定的組合方式，利用人工雜交的方法，獲得目標(biāo)轉(zhuǎn)基因水稻和野生近緣種的雜種F1代和自交分離F2代實驗群體來實現(xiàn)，具體步驟為: 選擇印sps抗除草劑轉(zhuǎn)基因水稻及其非轉(zhuǎn)基因親本品種，分別與野生近緣種的個體進行雜交，獲得含抗除草劑轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)基因水稻與其野生近緣種的雜種F1群體，記為A，以及不含轉(zhuǎn)基因的水稻親本品種與野生近緣種的雜種F1群體，記為B ;通過對含轉(zhuǎn)基因的雜種F1群體進行套袋自交，獲得F2代分離群體；同時利用目標(biāo)轉(zhuǎn)基因(印5/zs)DNA序列設(shè)計的引物，對F2代分離群體進行PCR擴增和檢測，鑒定含有轉(zhuǎn)基因的F2群體，記為C，以及不含轉(zhuǎn)基因的F2群體，記為D ;以此建立含有抗除草劑轉(zhuǎn)基因和不含轉(zhuǎn)基因的F2代實驗分離群體；所獲得的含有抗除草劑轉(zhuǎn)基因的雜種F1群體、不含轉(zhuǎn)基因的雜種F1群體，含有轉(zhuǎn)基因的自交F2分離群體和不含轉(zhuǎn)基因的自交F2分離群體，用于進行受控實驗條件下的適合度分析實驗； 步驟(2)所述設(shè)計用于轉(zhuǎn)基因逃逸導(dǎo)致環(huán)境風(fēng)險檢測的田間種植實驗，是將獲得的A、B、C、D實驗群體分別按雜草稻為20cm X 20cm或普通野生稻為40cm X 40cm的種植株間距離和行間距離，將含轉(zhuǎn)基因和不含轉(zhuǎn)基因的A和B群體或C和D群體在一個小區(qū)內(nèi)進行單一種植和相間混合種植；即分為3種不同種植模式:I)轉(zhuǎn)基因植株的單一種植模式，2)非轉(zhuǎn)基因植株的單一種植模式，3)轉(zhuǎn)基因植株和非轉(zhuǎn)基因植株的相間混合種植模式； 將受控的實驗環(huán)境分別設(shè)計為有除草劑選擇壓的環(huán)境和無除草劑選擇壓的環(huán)境，將上述實驗群體分別重復(fù)種植于有除草劑選擇壓的環(huán)境和無除草劑選擇壓的環(huán)境，并對實驗群體所有植株生活史各生長階段的適合度相關(guān)性狀分別進行測量； 步驟(3)所述建立抗除草劑轉(zhuǎn)基因逃逸之后導(dǎo)致環(huán)境風(fēng)險的檢測和評價標(biāo)準(zhǔn)，即建立復(fù)合適合度指數(shù)，來評價轉(zhuǎn)基因逃逸后帶來的環(huán)境風(fēng)險的程度，用％表示: 各形態(tài)性狀的適合度指數(shù)(％)=(含轉(zhuǎn)基因植株的測量值-不含轉(zhuǎn)基因植株的測量值)/不含轉(zhuǎn)基因植株的測量值X 100% ； 復(fù)合適合度指數(shù)為5個形態(tài)性狀，即:株高，單株分蘗數(shù)，單株穗數(shù)，單株種子產(chǎn)量和結(jié)實率適合度指數(shù)的平均數(shù)； 通過復(fù)合適合度指數(shù)的值，評價轉(zhuǎn)基因逃逸之后導(dǎo)致的環(huán)境風(fēng)險(％)，復(fù)合適合度指數(shù)的絕對值即為環(huán)境風(fēng)險的評價值；復(fù)合適合度指數(shù)的絕對值越接近于0，環(huán)境風(fēng)險越低，反之風(fēng)險越聞； 評價轉(zhuǎn)基因逃逸后導(dǎo)致的環(huán)境風(fēng)險程度，主要以F2群體的復(fù)合適合度指數(shù)為依據(jù)，以F1群體的復(fù)合適合度指數(shù)為輔助參考。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的水稻抗除草劑轉(zhuǎn)基因逃逸導(dǎo)致環(huán)境風(fēng)險的檢測評價方法，其特征在于所述按照一定的組合方式，利用人工雜交獲得目標(biāo)轉(zhuǎn)基因水稻和野生近緣種的雜種F1代和自交分離F2代實驗群體，具體步驟為: (1)確定雜交組合如下: (a)抗除草劑轉(zhuǎn)基因水稻X水稻野生近緣種； (b)非轉(zhuǎn)基因水稻X水稻野生近緣種； (2)通過人工雜交，分別獲得含抗除草劑轉(zhuǎn)基因雜交組合a，以及不含轉(zhuǎn)基因組合b的雜種F1群體； (3)對組合a的雜種F1群體進行套袋自交和抗除草劑轉(zhuǎn)基因的分子檢測，鑒定F2分離群體中包含轉(zhuǎn)基因的個體和不包含轉(zhuǎn)基因的個體； (4)基于鑒定結(jié)果，分別建立含抗除草劑轉(zhuǎn)基因的F2分離群體(+)和不含轉(zhuǎn)基因的F2分離群體(一)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的水稻抗除草劑轉(zhuǎn)基因逃逸導(dǎo)致環(huán)境風(fēng)險的檢測評價方法，其特征在于所述適合度相關(guān)性狀的選擇和測量方法如下: (1)株高，單位cm:從植株的地面到最長莖、葉或穗頂端的高度； (2)單株分蘗數(shù):每一單個植株的所有分蘗數(shù)總和； (3)單株穗數(shù):每一單個植株所有的穗數(shù)總和； (4)單株種子產(chǎn)量:每一單個植株的所有飽滿種子粒數(shù)總和； (5)結(jié)實率:單株飽滿種子數(shù)/單株總小花數(shù)X100%。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的水稻抗除草劑轉(zhuǎn)基因逃逸導(dǎo)致環(huán)境風(fēng)險的檢測評價方法，其特征在于具體選擇如下適合度相關(guān)性狀數(shù)據(jù)進行測量和分析: 根據(jù)受控實驗中各處理含有轉(zhuǎn)基因的實驗群體和不含轉(zhuǎn)基因?qū)嶒炄后w所測量的數(shù)據(jù)的比較分析，來檢測轉(zhuǎn)基因?qū)σ吧壏N帶來的適合度利益或適合度成本，并以此為依據(jù)確定轉(zhuǎn)基因逃逸導(dǎo)致的環(huán)境風(fēng)險；如轉(zhuǎn)基因?qū)嶒炄后w帶來的適合度變化程度越高則轉(zhuǎn)基因逃逸的環(huán)境風(fēng)險越高，反之則風(fēng)險低或無風(fēng)險； 適合度利益或適合度成本的指數(shù)值r計算公式為: r =(含轉(zhuǎn)基因植株的測量值-不含轉(zhuǎn)基因植株的測量值)/不含轉(zhuǎn)基因植株的測量值 X 100%(I) w的值變化在一c?~+c?之間，當(dāng)r值為正值，表示存在適合度利益，當(dāng)r值為負(fù)值，表示存在適合度成本，當(dāng)r值為ο或接近于0，表示沒有適合度變化； 復(fù)合適合度指數(shù)rramp為各性狀適合度的平均值，計算公式為: K- = Σ W1- / 5(2) 其中，i為第i個不同的適合度相關(guān)性狀?’當(dāng)K-的值為O時，表明轉(zhuǎn)基因逃逸后不會導(dǎo)致環(huán)境風(fēng)險，當(dāng)?shù)闹敌∮?%時，表明轉(zhuǎn)基因逃逸后導(dǎo)致的環(huán)境風(fēng)險較小，而當(dāng)?shù)闹荡笥?%時，表明轉(zhuǎn)基因逃逸后導(dǎo)致的環(huán)境風(fēng)險較大。
【文檔編號】A01H1/04GK103563739SQ201310590335
【公開日】2014年2月12日 申請日期:2013年11月22日 優(yōu)先權(quán)日:2013年11月22日
【發(fā)明者】盧寶榮, 蔡星星, 汪魏, 楊簫 申請人:復(fù)旦大學(xué)