一種黃梁木植株高效再生方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種黃梁木植株高效再生方法，在不同激素成份及濃度水平下，以DCR、MS為基本培養(yǎng)基，20d～25d無菌苗的子葉和下胚軸為外植體，經(jīng)不定芽誘導(dǎo)分化、芽增殖和生根培養(yǎng)，形成完整植株小苗，將小苗移栽到育苗基質(zhì)和種植到大田中，長大的植株與實生苗植株在形態(tài)上無明顯差異；本發(fā)明應(yīng)用生物技術(shù)方法克服種子幼苗高度參差不齊、個體分化大、育苗周期長等問題，提供一種高效、穩(wěn)定的黃梁木植株再生方法；該方法可進行規(guī)模化、工廠化快速育苗，生產(chǎn)出健壯、整齊一致的黃梁木幼苗，不僅可滿足市場對黃梁木種苗的需求，而且可以通過轉(zhuǎn)基因研究對黃梁木種質(zhì)資源進行改良和創(chuàng)新，為黃梁木種質(zhì)資源的可持續(xù)利用奠定基礎(chǔ)。
【專利說明】一種黃梁木植株高效再生方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于植物組織培養(yǎng)【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及黃梁木無菌苗子葉、下胚軸的組織培養(yǎng)和植株高效再生的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]黃梁木(Neolamarckia cadamba)屬菌草科(Rubiaceae)多用途、速生的高大喬木，原產(chǎn)中國云南、廣東、廣西以及越南、緬甸、馬來西亞等地，5年生以前為高生長旺期，年平均高生長量3.0m~3.5m ;其材質(zhì)好，木材淡黃色，紋理通直，順紋刨面光滑，干燥快，不易開裂變形，可作家具、建材、人造纖維、膠合板等原料；花是良好蜜源，果實可以食用，樹皮提取物可用做香料精及治療蛇咬傷、糖尿病、發(fā)燒、貧血、霍亂等多種疾??；枝葉可做家畜飼料；黃梁木全身是寶，被人們譽為“寶石之樹”和“奇跡樹”，是一種極具發(fā)展前景的鄉(xiāng)土闊葉樹種。
[0003]目前，人工栽培所需的幼苗大多通過種子播種經(jīng)自然繁殖的方式獲得，這種方式獲得的幼苗生長慢，高度參差不齊，個體分化大，育苗周期長；另外，黃梁木植株的嫩枝和頂芽對低溫較敏感，在12h的_2°C低溫下就產(chǎn)生凍害甚至死亡，嚴重影響植株生長和樹干的通直度，所以，黃梁木在國內(nèi)僅分布于有較短時間(或無)零下低溫的云南盈江、滄源、西雙版納、河口、文山等以南，廣西南寧的南部，海南省，廣東湛江至福建廈門沿海一帶以及江西省、臺灣省等地區(qū)；這些原因?qū)S梁木的人工栽培產(chǎn)生較大影響。
[0004]采用帶腋芽的莖段、萌芽條作為外植體，分別誘導(dǎo)出腋芽和頂芽，然后進行增殖、生根和移栽的試驗已有獲得成功的報道(林良科等，2007 ;林碧珍，2009 ;詹艷玲，2010);由于黃梁木莖段和萌芽條的髓部均為疏松的填充物，極易帶有病菌，很難徹底消毒，經(jīng)驗證，通過莖段和萌芽條外植體獲得無菌苗的機率極低，效率不高，技術(shù)很不穩(wěn)定。
[0005]所以，利用黃梁木無菌苗子葉、下胚軸為外植體，通過組織培養(yǎng)技術(shù)建立穩(wěn)定、可靠的植株高效再生技術(shù)體系，不僅能滿足市場對種苗需求，而且可以通過轉(zhuǎn)基因研究對黃梁木種質(zhì)資源進行改良和創(chuàng)新，為黃梁木種質(zhì)資源可持續(xù)利用奠定基礎(chǔ)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明針對目前黃梁木種子自然繁殖育苗生長慢，幼苗高度參差不齊，個體分化大，育苗周期長，影響人工栽培的問題，提供一種穩(wěn)定、可靠的黃梁木高效植株再生方法。
[0007]本發(fā)明技術(shù)方案如下，主要特點是:
[0008]A無菌苗的獲得:將種子置于40°C恒溫搖床上震蕩浸泡24h~48h ;在無菌超凈臺上，用10% NaClO溶液滅菌IOmin~15min，無菌水徹底沖洗5次，將種子播于不含任何激素的MS培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)基pH值為6.0，培養(yǎng)溫度25±2°C，光照強度25001x，光照時間12h。
[0009]B子葉和下胚軸外植體的獲得:種子培養(yǎng)20d~25d后，無菌苗高度約為1cm，切取帶子葉柄的I對子葉、下胚軸作為外植體。[0010]C不定芽的誘導(dǎo)分化:將外植體接種到添加TDZ1.0mg/L~5.0mg/L+NAA0.05mg/L+蔗糖30g/L+瓊脂6g/L的DCR培養(yǎng)基中培養(yǎng)；培養(yǎng)20d~30d后，將外植體轉(zhuǎn)移到添加6-BA3.0mg/L ~5.0mg/L+NAA0.05mg/L+ 蔗糖 30g/L+ 瓊脂 6g/L 的 DCR 培養(yǎng)基中培養(yǎng)；接種時，子葉的上表面朝上、下胚軸平行置于分化培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基PH值為6.0，培養(yǎng)條件為溫度25±2°C，光照強度25001x，光照時間12h。
[0011]D增殖培養(yǎng):在無菌超凈臺上，從分化出叢生芽的外植體中切取健壯的單芽，接種于添加6-BA1.0mg/L+IBA0.05mg/L+蔗糖30g/L+瓊脂6g/L的MS基本培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)基pH值為6.0，培養(yǎng)條件為溫度25 ±2°C，光照強度2500lx，光照時間12h。
[0012]E生根培養(yǎng):選取增殖培養(yǎng)得到的健壯單株幼苗，切取帶2-3個節(jié)的頂芽，接種于1/2MS+IBA0.lmg/L和NAA0.05mg/L+蔗糖30g/L+瓊脂6g/L的生根培養(yǎng)基進行誘導(dǎo)生根，培養(yǎng)基pH值為6.0，培養(yǎng)條件為溫度25±2°C，光照強度25001x，光照時間12h。
[0013]F煉苗與移栽:生根培養(yǎng)IOd后，將帶瓶的組培苗移到溫室中適應(yīng)外界環(huán)境ld，然后將組培瓶蓋從半開到全開煉苗，噴霧保持瓶內(nèi)濕度；3d后將組培苗小心取出，洗凈粘于根上的培養(yǎng)基，移栽到黃土和泥炭土混合比例為1:2的基質(zhì)上，在移栽一周內(nèi)，控制相對濕度75%~85%，溫度20°C~35°C ；10d后按生長需求澆水。
[0014]所述黃梁木植株高效再生方法的延伸技術(shù)方案包括:步驟A中涉及的種子浸泡、消毒方法和時間、步驟B中子葉和下胚軸外植體的取材方法以及步驟C、D和E中黃梁木組織培養(yǎng)和植物再生方法所述的培養(yǎng)基中涉及的植物生長激素，包括苯基噻二唑基脲(TDZ)、
6-芐基腺嘌呤(6-BA)、吲哚丁酸(IBA)和萘乙酸(NAA)中的一種或幾種。
[0015]所述黃梁木植株高效再 生方法的延伸技術(shù)方案包括:步驟A中涉及的將種子置于40°C恒溫搖床上震蕩浸泡24h~48h和種子消毒試劑10%的NaClO溶液滅菌IOmin~15min。
[0016]所述黃梁木植株高效再生方法的延伸技術(shù)方案包括:步驟B所涉及的子葉和下胚軸外植體取材方法。
[0017]所述黃梁木植株高效再生方法的延伸技術(shù)方案包括:步驟C所涉及的植物生長激素包括為 TDZ1.0mg/L ~5.0mg/L, 6-BA3.0mg/L ~5.0mg/L, NAA0.05mg/L。
[0018]所述黃梁木植株高效再生方法的延伸技術(shù)方案包括:步驟C所涉及的子葉和下胚軸在分化培養(yǎng)基上的放置方法。
[0019]所述黃梁木植株高效再生方法的延伸技術(shù)方案包括:步驟D中所涉及的植物生長激素為 6-BA1.0mg/L 和 ΙΒΑ0.05mg/L。
[0020]所述黃梁木植株高效再生方法的延伸技術(shù)方案包括:步驟E中所涉及的植物生長激素為 ΙΒΑ0.lmg/L 和 NAA0.05mg/L。
[0021]本發(fā)明的高效組織培養(yǎng)和植株再生方法，可擺脫外界條件的影響，規(guī)模化和工廠化生產(chǎn)出健壯、整齊一致的黃梁木組培幼苗；經(jīng)試驗，在大田種植2年的組培苗植株在形態(tài)上與實生苗植株無明顯差異；該方法不僅能滿足市場對種苗的需求，并且可以通過轉(zhuǎn)基因研究對黃梁木種質(zhì)資源進行遺傳改良和創(chuàng)新，為黃梁木種質(zhì)資源的可持續(xù)利用奠定基礎(chǔ)。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0022]圖1為25d種子無菌苗，用于切取子葉和下胚軸外植體(子葉已切下)。[0023]圖2為在含TDZ2.0mg/L+NAA0.05mg/L分化培養(yǎng)基上培養(yǎng)25d的子葉外植體。
[0024]圖3為在含TDZ2.0mg/L+NAA0.05mg/L分化培養(yǎng)基上培養(yǎng)25d的下胚軸外植體。
[0025]圖4為培養(yǎng)25d后的外植體在含6-BA4.0mg/L+NAA0.05mg/L分化培養(yǎng)基上的叢生芽。
[0026]圖5為在增殖培養(yǎng)基上生長的繼代苗。
[0027]圖6為在生根培養(yǎng)基中，根的誘導(dǎo)狀況。
[0028]圖7為移栽的黃梁木植株。
【具體實施方式】
[0029]結(jié)合實施例對本發(fā)明進行詳細說明。
[0030]實施例一黃梁木不定芽誘導(dǎo)
[0031]將種子置于40°C恒溫搖床上震蕩浸泡48h ;在無菌超凈臺上，用10% NaClO溶液滅菌15min，無菌水徹底沖洗5次，將種子播于不含任何激素的MS培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基pH值為
6.0,置于溫度25±2°C,光照強度25001x,光照時間12h的光照培養(yǎng)室培養(yǎng)。
[0032]培養(yǎng)25d后，切取帶子葉柄的子葉、下胚軸作為外植體，將子葉上表面朝上、下胚軸平行于培養(yǎng)基表面，放在添加TDZ2.0mg/L+NAA0.05mg/L的DCR分化培養(yǎng)培養(yǎng)基中，培養(yǎng)25d后，外植體的分化誘導(dǎo)率達100%，并有少量不定芽形成。
[0033]將培養(yǎng)的外植體轉(zhuǎn)接到添加6-BA4.0mg/L+NAA0.05mg/L+蔗糖30g/L+瓊脂6g/L的DCR分化培養(yǎng)基中，培養(yǎng)30d后，每個外植體分化出的不定芽大于30個。
[0034]實施例二黃梁木增殖、生根培養(yǎng)和移栽
[0035]從分化出叢生芽的外植體中切取健壯的單芽，，轉(zhuǎn)接到MS+6-BA1.0mg/L+IBA0.05mg/L+蔗糖30g/L+瓊脂6g/L的增殖培養(yǎng)基中培養(yǎng)，3周后，增殖系數(shù)和有效芽分別高達5.92和2.96個。
[0036]選取健壯的有效芽，轉(zhuǎn)接到1/2MS+IBA0.lmg/L+NAA0.05mg/L+蔗糖30g/L+瓊脂6g/L的生根誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)，15d后，不定根的誘導(dǎo)率為95.4%，平均生根6.04條，平均根長 0.89cm。
[0037]將生根培養(yǎng)IOd的組培苗帶瓶移至溫室中，適應(yīng)外界環(huán)境ld，然后逐步將組培瓶蓋從半開到全開煉苗，并噴霧保濕，3d后將組培苗小心取出并洗凈粘于根上的培養(yǎng)基，移栽到黃土和泥炭土混合比例為1:2的混合基質(zhì)上；移栽一周內(nèi)，保持相對濕度75%~85%，溫度20°C~35°C ;IOd后按生長需求澆水，該移栽成活率高于95%。
[0038]上述實例的組織培養(yǎng)和植株再生狀況見附圖。
[0039]以上結(jié)合附圖對本發(fā)明的【具體實施方式】作了說明，但這些說明不能被理解為限制了本發(fā)明的范圍，本發(fā)明的保護范圍由隨附的權(quán)利要求書限定，任何在本發(fā)明權(quán)利要求基礎(chǔ)上的改動都是本發(fā)明的保護范圍。
【權(quán)利要求】
1.本發(fā)明所述的一種黃梁木植株高效再生方法，其主要特征在于: A無菌苗的獲得:將種子置于40°C恒溫搖床上震蕩浸泡24h~48h ;在無菌超凈臺上，用10% NaClO溶液滅菌IOmin~15min，無菌水徹底沖洗5次，將種子播于不含任何激素的MS培養(yǎng)基中培養(yǎng)。 B子葉和不胚軸外植體的獲得:種子培養(yǎng)20d~25d后，切取無菌苗中帶子葉柄的子葉和下胚軸作為外植體。 C不定芽誘導(dǎo)分化:將外植體接種于添加TDH.0~5.0mg/L+NAA0.05mg/L的DCR培養(yǎng)基中；培養(yǎng)20d~30d后，將外植體轉(zhuǎn)移到添加6-BA3.0~5.0mg/L+NAA0.05mg/L的DCR培養(yǎng)基中培養(yǎng)。 D增殖培養(yǎng):在超凈臺上，從外植體叢生芽中剪取粗壯的單株芽，接種于添加6-BA1.0mg/L+IBA0.05mg/L 的 MS 培養(yǎng)基中培養(yǎng)。 E生根培養(yǎng):選取增殖培養(yǎng)得到的健壯幼苗，切掉腋芽和稍大的葉片，置于1/2MS+IBA0.lmg/L和ΝΑΑ0.05mg/L生根培養(yǎng)基誘導(dǎo)生根。 F煉苗與移栽:生根培養(yǎng)IOd后，將帶瓶的組培苗移到溫室中適應(yīng)外界環(huán)境ld，然后將組培瓶蓋從半開到全開煉苗，噴霧保持瓶內(nèi)濕度；3d后將組培苗小心取出，洗凈粘于根上的培養(yǎng)基，移栽到黃土和泥炭土混合比例為1:2的基質(zhì)上，在移栽一周內(nèi)，控制相對濕度75%~85%，溫度20°C~35°C ; IOd后按生長需求澆水。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的黃梁木植株高效再生方法，其特征在于步驟A中所涉及的種子浸泡、消毒方法和時間、步驟B中子葉和下胚軸外植體的取材方法以及步驟C、D和E中黃梁木組織培養(yǎng)和植物再生方法所述的培養(yǎng)基中涉及的植物生長激素，包括苯基噻二唑基脲(TDZ)、6_芐基腺嘌呤(6-BA)、吲哚丁酸(IBA)和萘乙酸(NAA)中的一種或幾種。`
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的黃梁木植株高效再生方法，其特征在于步驟A中所涉及的將種子置于40°C恒溫搖床上震蕩浸泡24h~48h和種子消毒試劑10%的NaClO溶液滅菌IOmin ~15min。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的黃梁木植株高效再生方法，其特征在于步驟B所涉及的子葉和下胚軸外植體取材方法。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的黃梁木植株高效再生方法，其特征在于步驟C所涉及的植物生長激素和濃度，包括 TDZ1.0mg/L ~5.0mg/L, 6-BA3.0mg/L ~5.0mg/L, NAA0.05mg/L。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的黃梁木植株高效再生方法，其特征在于步驟C所涉及的子葉上表面朝上、下胚軸平行置于分化培養(yǎng)基中的接種方法。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的黃梁木植株高效再生方法，其特征在于步驟D中所涉及的植物生長激素和濃度為6-BA1.0mg/L和ΙΒΑ0.05mg/L。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的黃梁木植株高效再生方法，其特征在于步驟E中所涉及的植物生長激素為 ΙΒΑ0.lmg/L 和 ΝΑΑ0.05mg/L。
【文檔編號】A01H4/00GK103782903SQ201310585131
【公開日】2014年5月14日 申請日期:2013年11月19日 優(yōu)先權(quán)日:2013年11月19日
【發(fā)明者】陳曉陽, 黃浩, 歐陽昆唏, 李俊成 申請人:華南農(nóng)業(yè)大學(xué)