生防枯草芽孢桿菌株sh7的發(fā)酵培養(yǎng)方法及使用該方法培養(yǎng)所得生防枯草芽孢桿菌sh7的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】，涉及生防枯草芽孢桿菌株SH7的發(fā)酵培養(yǎng)方法及使用該方法培養(yǎng)所得生防枯草芽孢桿菌SH7，本發(fā)明方法按順序包括如下步驟：（1）種子準(zhǔn)備：將枯草芽孢桿菌SH7菌株接種于牛肉汁液體種子培養(yǎng)基中，滅菌，37℃過夜搖菌得種子菌液，所述牛肉汁液體種子培養(yǎng)基包含酵母粉、葡萄糖、蛋白胨、牛肉膏；（2）發(fā)酵培養(yǎng)：于發(fā)酵培養(yǎng)基中接種步驟（1）的種子菌液，搖菌36h后取發(fā)酵完畢的菌液，離心5分鐘，倒掉上清液，冷凍干燥后，稱重。本發(fā)明所篩選出的芽孢桿菌SH7對(duì)煙草青枯病菌表現(xiàn)出了良好的拮抗性，溫室藥效試驗(yàn)達(dá)到了較高的水平，前景廣闊，本發(fā)明方法為枯草芽孢桿菌的生產(chǎn)應(yīng)用打下了良好的基礎(chǔ)。
【專利說明】生防枯草芽孢桿菌株SH7的發(fā)酵培養(yǎng)方法及使用該方法培養(yǎng)所得生防枯草芽孢桿菌SH7
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】，涉及生防枯草芽孢桿菌株SH7的發(fā)酵培養(yǎng)方法及使用該方法培養(yǎng)所得生防枯草芽孢桿菌SH7。
【背景技術(shù)】
[0002]煙草細(xì)菌性青枯病是由青枯雷爾氏菌(Ralstonia solanacearum)引起的一種典型的維管束病害，最顯著的癥狀是枯萎，且枯萎的速度很快，一旦發(fā)病即可造成全株死亡，是煙草上一大毀滅性病害。目前在我國長江流域及其以南煙區(qū)普遍發(fā)生；在多發(fā)病區(qū)旱地?zé)熖锏陌l(fā)病率為30%-50%，特別是旱地重茬連作煙田的發(fā)病率為50%以上；尤以華南煙區(qū)為害嚴(yán)重，個(gè)別年份暴發(fā)流行。近幾年來，該病的發(fā)病和為害范圍有向北方煙區(qū)擴(kuò)展的趨勢(shì)，在山東、河南、陜西及遼寧等省都有發(fā)生，局部地區(qū)為害較重。目前該病造成的損失已居各類病害的第四位，必須重視該病的防治工作。尤其近年以來由根結(jié)線蟲造成的傷口引起的青枯病、黑脛病復(fù)合侵染的危害呈上升趨勢(shì)，造成煙田嚴(yán)重減產(chǎn)。鑒于化學(xué)防治對(duì)環(huán)境的污染和生態(tài)平衡的破壞，因此煙草青枯病的生物防治越來越被重視。
[0003]煙草是我國重要的經(jīng)濟(jì)作物，中國烤煙的主要產(chǎn)區(qū)分布在云南、貴州、四川、湖北、湖南、陜西、河南、安徽、山東、遼寧、吉林、黑龍江等20多個(gè)省區(qū)的近900個(gè)縣市。其中，云南省是我國煙草種植面積最大的省。中國煙葉的質(zhì)量在不斷提高，全國良種化面積達(dá)到90%以上，是世界上最大的煙草生產(chǎn)國。
[0004]在煙草生產(chǎn)上病害是嚴(yán)重影響產(chǎn)量和質(zhì)量的重要因素。煙草細(xì)菌性青枯病又稱“煙痕”，是由Ralstonia solanacearum引起的一種維管束病害，主要侵染煙草根部和莖，也可侵染葉片；在苗床和大田均能發(fā)生，常造成煙株大片枯萎死亡，是一種毀滅性的土傳病害。1864年印度尼西亞首先報(bào)道在煙草上引起毀滅性的損失；在美國，1880年首次發(fā)現(xiàn)此病，1910年大面積流行，隨后美國一些農(nóng)場被迫停止種煙。此病廣泛分布于世界熱帶、亞熱帶及溫帶等濕熱地區(qū)；我國煙草青枯病菌的地理分布長江以南發(fā)生居多，依發(fā)病高低可劃分為4個(gè)區(qū)，多發(fā)病區(qū)包括廣東、江西、福建、湖南、四川、浙江、安徽等省區(qū)；次發(fā)病區(qū)包括貴卅、湖北；偶發(fā)病區(qū)包括云南、河南、山東、陜西、遼寧；其余為無病區(qū)，各區(qū)的劃分是相對(duì)的，區(qū)間存在過渡帶；呈現(xiàn)由西向東、由北向南逐漸增加的趨勢(shì)。
[0005]煙草細(xì)菌性青枯病菌的寄主范圍很廣，可侵染50多個(gè)科200余種植物，是番茄、馬鈴薯、煙草、花生、甘薯、茄子、生姜、香蕉以及一些貴重藥品和花卉等植物生產(chǎn)的重要限制因素。大多數(shù)禾本科植物及棉花、甘薯和麻類作物不受侵染。病菌主要在土壤和堆肥中越冬，也可以潛伏在種子、根際或生長著的寄主體內(nèi)越冬；一般條件下，是從根部傷口侵入，不能從氣孔侵入。青枯病的主要初次侵染來源是土壤、病殘組織和肥料中的病菌，這些病原菌靠雨水、排灌水、病土、帶菌苗、疫苗、人畜、生產(chǎn)工具及昆蟲進(jìn)行擴(kuò)散遠(yuǎn)距離傳播。
[0006]煙草青枯病在苗床和大田均能發(fā)生。主要侵染煙株根、莖，也可侵染葉片，染病葉片初期仍為綠色懸掛在莖上，故稱“青枯病”;天氣炎熱時(shí)，病株的葉片呈不規(guī)則的灼傷，葉片變干，邊緣脫落。病株的莖呈直立狀，莖上垂著死亡的葉片。土壤濕度大時(shí)，根軟腐發(fā)粘，致使全株枯死。
[0007]利用有益微生物防治植物病害，已成為一個(gè)十分活躍并開始顯示良好應(yīng)用前景的領(lǐng)域。許多論著報(bào)道(Cook, K.J.and Baker K.F.The nature and practice of biologicalcontrol of plant pathogens.1984, APS press USA)認(rèn)為生物防治在未來農(nóng)業(yè)中具有重要地位。大量的研究表明，生防細(xì)菌在其生長發(fā)育中產(chǎn)生多種拮抗性或競爭性的代謝產(chǎn)物，通過直接或間接作用，達(dá)到阻礙或殺死病原菌的效果。無論是自然發(fā)生的生物防治現(xiàn)象還是人們用于生物防治的生物類型中，細(xì)菌的作用是非常明顯的。其主要優(yōu)勢(shì)在于:1)細(xì)菌的種類和數(shù)量眾多，在植物根際和地上部大量存在；2)細(xì)菌對(duì)病原菌的作用方式較廣，可以通過競爭、拮抗和誘導(dǎo)植物產(chǎn)生抗性等方式對(duì)病原菌產(chǎn)生影響；3)具有驚人的繁殖速度；4)許多細(xì)菌存在于植物根際和地上部，對(duì)植物的生態(tài)比較適宜；5)細(xì)菌大多可以人工培養(yǎng)，便于控制，在實(shí)踐中易于操作；6)有些細(xì)菌不僅能防治病害而且可以增加作物產(chǎn)量(程亮等，拮抗細(xì)菌的研究進(jìn)展[J].江西農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2003，25(5):732~736)。表現(xiàn)出或被認(rèn)為有生防潛力的有益細(xì)菌種類眾多(Dviad M.Biological Control of Soilbrone PlantPathogens in the Rizhosphere with Bacteria.Ann.Rev.Phytopathol.1988, 26:379 ~407);包括了許多屬的細(xì)菌，目前成功應(yīng)用的植物病害生防細(xì)菌有Agrobacterium、Bacillus、Pseudomonas> Erwinia、Xanthomonas 等屬的一些菌株。
[0008]煙草青枯病是煙草生產(chǎn)中最嚴(yán)重的病害之一，每年都造成煙葉產(chǎn)量的嚴(yán)重?fù)p失和品質(zhì)下降，是煙草生產(chǎn)中一個(gè)很重要的制約因素。而作物青枯病生防枯草芽孢桿菌株SH7能有效地防治和減輕煙草青枯病的危害，但是現(xiàn)有技術(shù)中發(fā)酵培養(yǎng)該菌株產(chǎn)量低，不適合大量發(fā)酵用。
【發(fā)明內(nèi)容】

[0009]根據(jù)上述領(lǐng)域的需求和不足，本發(fā)明提供一種作物青枯病生防枯草芽孢桿菌株SH7的發(fā)酵培養(yǎng)方法。該方法為作物青枯病生防枯草芽孢桿菌株SH7的生產(chǎn)應(yīng)用打下了良好的基礎(chǔ)。
[0010]本發(fā)明的技術(shù)方案如下:
[0011]生防枯草芽孢桿菌株SH7的發(fā)酵培養(yǎng)方法，其特征在于，按順序包括如下步驟:
[0012](I)種子準(zhǔn)備:將生防枯草芽孢桿菌SH7菌株接種于牛肉汁液體種子培養(yǎng)基中，滅菌，37°C過夜搖菌得種子菌液，所述牛肉汁液體種子培養(yǎng)基包含酵母粉、葡萄糖、蛋白胨、牛肉膏；
[0013](2)發(fā)酵培養(yǎng):于發(fā)酵培養(yǎng)基中接種步驟(1)的種子菌液,搖菌36h后取發(fā)酵完畢的菌液，離心5分鐘,倒掉上清液,冷凍干燥后，稱重。
[0014]所述發(fā)酵培養(yǎng)基包含牛肉膏、蛋白胨、葡萄糖、氯化鈉、淀粉、30.8mg/L的硫酸錳溶液。
[0015]所述發(fā)酵培養(yǎng)基中含有牛肉膏0.3份、蛋白胨1份、葡萄糖1份、氯化鈉0.5份。
[0016]所述發(fā)酵培養(yǎng)基各成分重量份配比為牛肉膏0.3份、蛋白胨1份、葡萄糖1份、氯化鈉0.5份、淀粉0.3份、30.8mg/L的硫酸錳溶液0.1份。
[0017]步驟(2)中，發(fā)酵培養(yǎng)基的pH值為7.9-8.2 ;300ml的三角瓶的裝瓶量為40_80ml ；接種量4%-8% ;培養(yǎng)溫度為28-31 °C;培養(yǎng)轉(zhuǎn)速為150r/min-240r/min ;發(fā)酵時(shí)間為24h_60h。
[0018]發(fā)酵培養(yǎng)基的pH值為8.2 ；300ml的三角瓶的裝瓶量為60ml ;接種量8% ;培養(yǎng)溫度為31°C ;培養(yǎng)轉(zhuǎn)速為150r/min ;發(fā)酵時(shí)間為48h。
[0019]所述牛肉汁液體種子培養(yǎng)基按如下方法配制:將酵母粉0.5g、葡萄糖10g、蛋白胨5g、牛肉膏3g、加入容器定容至1L。
[0020]上述的發(fā)酵培養(yǎng)方法在培養(yǎng)作物青枯病生防枯草芽孢桿菌株SH7中的應(yīng)用。
[0021]上述的發(fā)酵培養(yǎng)方法直接培養(yǎng)的生防枯草芽孢桿菌SH7。
[0022]本發(fā)明發(fā)明人通過對(duì)該菌培養(yǎng)基配方和培養(yǎng)條件的優(yōu)化選擇以及正交試驗(yàn)，確定最適宜SH7菌株生長的培養(yǎng)基配方及培養(yǎng)條件如下:0.9%牛肉膏+2%蛋白胨+2%葡萄糖+1.l%NaCl ;發(fā)酵起始pH值為8.2,300ml的三角瓶裝瓶量為60ml、接種量為8%、溫度為31°C、轉(zhuǎn)速為150r/min，發(fā)酵時(shí)間為48h。
[0023]眾所周知，煙草業(yè)在國民經(jīng)濟(jì)中的占有重要地位，目前青枯病的化學(xué)防治和生防都不甚理想，一定程度上制約了我國的煙草生產(chǎn)和出口。本發(fā)明發(fā)明人所篩選出的芽孢桿菌SH7對(duì)煙草青枯病菌表現(xiàn)出了良好的拮抗性，溫室藥效試驗(yàn)達(dá)到了較高的水平，前景廣闊。本試驗(yàn)篩選出了適合該菌的發(fā)酵配方并優(yōu)化了發(fā)酵條件，為該菌的生產(chǎn)應(yīng)用打下了良好的基礎(chǔ)。
[0024]菌種保藏信息:
[0025]菌種名稱:芽孢桿菌屬、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)
[0026]保藏機(jī)構(gòu):中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心
[0027]保藏日期:2006年6月7日
[0028]保藏編號(hào):CGMCC1732
【專利附圖】

【附圖說明】
[0029]圖1為pH篩選結(jié)果；
[0030]圖2為裝瓶量篩選結(jié)果；
[0031]圖3為接種量篩選結(jié)果；
[0032]圖4為溫度篩選結(jié)果；
[0033]圖5為轉(zhuǎn)速結(jié)果篩選；
[0034]圖6為發(fā)酵時(shí)間篩選結(jié)果；
[0035]圖7為5升發(fā)酵實(shí)驗(yàn)SH生長曲線圖；
[0036]圖8為50升發(fā)酵實(shí)驗(yàn)SH生長曲線圖；
[0037]圖9為發(fā)酵液抑制青枯菌的結(jié)果。
【具體實(shí)施方式】
[0038]提供下述實(shí)施例是為了更好地進(jìn)一步理解本發(fā)明，并不局限于所述實(shí)施方式，不對(duì)本發(fā)明的內(nèi)容和保護(hù)范圍構(gòu)成限制，任何人在本發(fā)明的啟示下或是將本發(fā)明與其他現(xiàn)有技術(shù)的特征進(jìn)行組合而得出的任何與本發(fā)明相同或相近似的產(chǎn)品，均落在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
[0039]實(shí)施例中未注明具體實(shí)驗(yàn)步驟或條件者，按照本領(lǐng)域內(nèi)的文獻(xiàn)所描述的常規(guī)實(shí)驗(yàn)步驟的操作或條件即可進(jìn)行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為可以通過市購獲得的常規(guī)試劑產(chǎn)品。
[0040]本發(fā)明使用的枯草芽孢桿菌SH7菌株為由本室篩選并保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心的枯草芽孢桿菌SH7菌株，其保藏編號(hào)為=CGMCC 1732。
[0041]實(shí)施例1.生防菌株SH7的搖瓶發(fā)酵條件的篩選
[0042]I材料與方法
[0043]1.1供試菌株和培養(yǎng)基
[0044]保藏號(hào)為CGMCC1732的枯草芽孢桿菌SH7菌株由本室篩選、保存。
[0045]種子培養(yǎng)基:牛肉汁液體培養(yǎng)基(酵母粉0.5g、葡萄糖10g、蛋白胨5g、牛肉膏3g、ρΗ7.0，定容至 1L)。
[0046]待測(cè)培養(yǎng)基的配制:
[0047]①號(hào)培養(yǎng)基:淀粉0.15%、葡萄糖0.5%、尿素0.1%、磷酸氫二鉀0.3%、磷酸二氫鉀
0.15%、硫酸鎂0.05%、酵母膏0.02%、氯化鐵0.01%、碳酸鈣0.01%、豆柏1% ；
[0048]②號(hào)培養(yǎng)基:淀粉0.15%、葡萄糖0.5%、尿素0.1%、磷酸氫二鉀0.3%、磷酸二氫鉀
0.15%、硫酸鎂0.05%、酵母膏0.02%、氯化鐵0.01%、碳酸鈣0.01%、豆柏1%、30.8mg/L的硫酸錳溶液0.1% ；
[0049]③號(hào)培養(yǎng)基:牛肉膏0.3%、蛋白胨1%、葡萄糖1%、氯化鈉0.5% ；
[0050]④號(hào)培養(yǎng)基:牛肉膏0.3%、蛋白胨1%、葡萄糖1%、氯化鈉0.5%、淀粉0.3%,30.8mg/L的硫酸錳溶液0.1%。
[0051]將4種不同培養(yǎng)基pH值均調(diào)為7.2 — 7.3，裝液量為60ml/300ml。121°C滅菌20min,備用。
[0052]1.2 方法
[0053]1.2.1種子準(zhǔn)備牛肉汁液體培養(yǎng)基，pH為7.0，裝瓶量為100ml/300ml三角瓶，1211:滅菌201^11。將牛肉汁液體培養(yǎng)基接菌后37°C過夜搖菌。
[0054]1.2.2培養(yǎng)基配方篩選上述4種培養(yǎng)基中接種種子菌液1.5ml，在31°C條件下，搖菌36h后取5ml發(fā)酵完畢的菌液，在12000r/min下離心5分鐘，倒掉上清，冷凍干燥沉淀18h后,稱重量。
[0055]1.2.3發(fā)酵培養(yǎng)條件優(yōu)化每次只改變測(cè)定的一個(gè)發(fā)酵條件，其它方法同1.2.2。
[0056]2 結(jié)果
[0057]2.1培養(yǎng)基配方篩選結(jié)果
[0058]從表1可以看出，3次重復(fù)中5ml培養(yǎng)液中菌體干重的平均值大小依次為④號(hào)(0.0094g) >③號(hào)(0.0089g) >①號(hào)(0.0059g) >②號(hào)(0.0054g),因此④號(hào)培養(yǎng)基較適合該菌的發(fā)酵。
[0059]表1 :培養(yǎng)基配方篩選結(jié)果
[0060]
【權(quán)利要求】
1.生防枯草芽孢桿菌株SH7的發(fā)酵培養(yǎng)方法，其特征在于，按順序包括如下步驟: (1)種子準(zhǔn)備:將生防枯草芽孢桿菌SH7菌株接種于牛肉汁液體種子培養(yǎng)基中，滅菌，37°C過夜搖菌得種子菌液，所述牛肉汁液體種子培養(yǎng)基包含酵母粉、葡萄糖、蛋白胨、牛肉膏； (2)發(fā)酵培養(yǎng):于發(fā)酵培養(yǎng)基中接種步驟(1)的種子菌液,搖菌36h后取發(fā)酵完畢的菌液，離心5分鐘,倒掉上清液,冷凍干燥后，稱重。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的發(fā)酵培養(yǎng)方法，其特征在于，所述發(fā)酵培養(yǎng)基包含牛肉膏、蛋白胨、葡萄糖、氯化鈉、淀粉、30.8mg/L的硫酸猛溶液。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的發(fā)酵培養(yǎng)方法，其特征在于，所述發(fā)酵培養(yǎng)基中含有牛肉膏0.3份、蛋白胨1份、葡萄糖1份、氯化鈉0.5份。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的發(fā)酵培養(yǎng)方法，其特征在于，所述發(fā)酵培養(yǎng)基各成分重量份配比為牛肉膏0.3份、蛋白胨1份、葡萄糖1份、氯化鈉0.5份、淀粉0.3份、30.8mg/L的硫酸錳溶液0.1份。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4任一所述的發(fā)酵培養(yǎng)方法，其特征在于，步驟(2)中，發(fā)酵培養(yǎng)基的PH值為7.9-8.2 ；300ml的三角瓶的裝瓶量為40_80ml ;接種量4%_8% ;培養(yǎng)溫度為28-3TC ;培養(yǎng)轉(zhuǎn)速為 150r/min-240r/min ;發(fā)酵時(shí)間為 24h_60h。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的發(fā)酵培養(yǎng)方法,其特征在于，發(fā)酵培養(yǎng)基的pH值為8.2 ；300ml的三角瓶的裝瓶量為60ml ;接種量8% ;培養(yǎng)溫度為31 °C;培養(yǎng)轉(zhuǎn)速為150r/min ;發(fā)酵時(shí)間為48h。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的發(fā)酵培養(yǎng)方法，其特征在于，所述牛肉汁液體種子培養(yǎng)基按如下方法配制:將酵母粉0.5g、葡萄糖10g、蛋白胨5g、牛肉膏3g、加入容器定容至1L。
8.權(quán)利要求1-7任一所述的發(fā)酵培養(yǎng)方法在培養(yǎng)作物青枯病生防枯草芽孢桿菌株SH7中的應(yīng)用。
9.由權(quán)利要求1-7任一所述的發(fā)酵培養(yǎng)方法直接培養(yǎng)的生防枯草芽孢桿菌SH7。
【文檔編號(hào)】A01P1/00GK103642715SQ201310573461
【公開日】2014年3月19日 申請(qǐng)日期:2013年11月13日 優(yōu)先權(quán)日:2013年11月13日
【發(fā)明者】趙廷昌, 王靜, 楊玉文, 王鐵霖, 孔凡玉 申請(qǐng)人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所