根際有益細菌促進黨參種子萌發(fā)的方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種采用根際有益細菌促進黨參子種子萌發(fā)的處理方法。本發(fā)明利用根際促生微生物枯草芽孢桿菌(Bacillus?subtilis)一種菌株菌液浸泡黨參種子，顯著提高了黨參種子發(fā)芽勢和發(fā)芽率，從而提高黨參種子活力和出苗率，克服了生產(chǎn)上黨參種子小，發(fā)芽勢和發(fā)芽率低，出苗不整齊的問題，以減少黨參補苗及反復(fù)發(fā)芽造成的人力、物力等經(jīng)濟損失。同時，枯草芽孢桿菌具有對人畜無毒無害、不污染環(huán)境、非致病性和抗逆性強等特點，能夠產(chǎn)生多種生長激素類物質(zhì)和豐富的抗菌物質(zhì)，促進植物生長，改善植株生長發(fā)育。本發(fā)明種子處理方法簡單，可廣泛應(yīng)用于黨參的栽培，具有重要的社會、經(jīng)濟和生態(tài)經(jīng)濟價值。
【專利說明】根際有益細菌促進黨參種子萌發(fā)的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于微生物學(xué)和植物生理學(xué)領(lǐng)域，涉及利用根際有益細菌枯草芽孢桿菌 GB03菌株提高黨參種子發(fā)芽勢和發(fā)芽率，從而促進黨參種子萌發(fā)的方法，保證種子播種后田間出苗健壯、整體一致。
【背景技術(shù)】
[0002]枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)具有對人畜無毒無害、不污染環(huán)境、非致病性和抗逆性強等特點，它能夠產(chǎn)生多種生長激素類物質(zhì)和豐富的抗菌物質(zhì)，促進植物生長，改善植株生長發(fā)育，增加植物對鹽脅迫等逆境的抵御能力，從而提高植物的抗病性。
[0003]近年來，黨參在治療冠心病、高血脂癥、低血壓病等面取得了新的進展，使其用量速增(馬雪梅和吳朝峰2009)，但因黨參種子小，壽命短，直播育苗時發(fā)芽率低，栽培時播種量大，成本高，達不到生產(chǎn)要求。據(jù)調(diào)查，國內(nèi)每年黨參的需求量遠遠超過生產(chǎn)，從黨參作為商品在市場上交易以來，黨參的生產(chǎn)和銷售就經(jīng)常出現(xiàn)大起大落的現(xiàn)象，價格波動也很大。目前，全國黨參野生資源蘊藏量約為1.58萬噸，但是資源分散、產(chǎn)量呈現(xiàn)逐年下降的趨勢，所能提供的商品數(shù)量極其有限，黨參市場供求矛盾極為突出(劉德軍等2001)。從中藥黨參資源調(diào)查結(jié)果表明，目前市場上的黨參主產(chǎn)于山西、甘肅、陜西、四川和湖北等省，主要為栽培品，少量為野生，甘肅除了原產(chǎn)地外，近幾十年大面積發(fā)展黨參種植，同時擴大了素花黨參的生產(chǎn)規(guī)模，成為中藥黨參最大的產(chǎn)區(qū)(張向東等2013)。
[0004]目前，隨著中藥現(xiàn)代化的實施以及中國在世界經(jīng)濟中的地位越來越高，中藥材的生產(chǎn)和出口均穩(wěn)步的增長，據(jù)估計2007年我國黨參的出口已經(jīng)超過了 0.3萬噸，作為中藥制藥原料，黨參的用量也顯著增長。近年來，黨參的市場價格多次抬升，而且由于全國黨參總產(chǎn)量明顯下降，使其價格大幅度上調(diào)。黨參藥材供不應(yīng)求已經(jīng)成為中藥生產(chǎn)中的一大難題，因此，改善黨參生產(chǎn)土壤質(zhì)量，調(diào)控活性成分及代謝產(chǎn)物積累，提高黨參質(zhì)量已經(jīng)成為中藥材種植業(yè)的首選，也是黨參生產(chǎn)中亟待解決的問題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種根際有益細菌促進黨參種子萌發(fā)的方法。是利用根際有益細菌枯草芽孢桿菌GB03促進黨參種子的萌發(fā)，該方法操作簡單，成本低，高效，無毒并對環(huán)境友好無害。
[0006]為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案為:一種根際有益細菌促進黨參種子萌發(fā)的方法，其主要特點在于步驟為:
[0007](1)黨參種子消毒處理:籽粒飽滿無缺損、均勻一致的黨參種子，用75%的酒精浸泡8-lOs后，使用5%次氯酸鈉浸泡10-12min，用滅菌的蒸餾水沖洗7_8次，于2_4°C冰箱過夜；
[0008](2)枯草芽孢桿菌GB03菌液制備:先配制溶菌肉湯LB液體培養(yǎng)基:按照氯化鈉、 胰蛋白胨和酵母粉的比例為1:2:1配制，溶劑為蒸餾水；調(diào)pH到7.2，高溫為115-132°C滅菌，待冷卻溫度為20-35°C后，每IOOmL的LB液體培養(yǎng)基加入50-100 μ L的枯草芽孢桿菌GB03菌液，在轉(zhuǎn)速為180-250r/min下，溫度為25_30°C的恒溫培養(yǎng)搖床上培養(yǎng)過夜后，測定菌液濃度為OD6tltl為0.8-1.0時，取出備用；
[0009](3)種子菌液處理:將步驟(1)處理完成種子浸泡于枯草芽孢桿菌GB03菌液中5min-20min，然后將菌液倒出，處理完成的種子進行播種。
[0010]本發(fā)明的有益效果:本發(fā)明可顯著提高黨參種子發(fā)芽勢和發(fā)芽率，從而提高黨參種子活力和出苗率，保持較整齊的發(fā)芽率，克服了生產(chǎn)上黨參種子小，發(fā)芽勢和發(fā)芽率低，出苗不整齊的問題，以減少生產(chǎn)上黨參補苗及反復(fù)發(fā)芽造成的人力、物力等經(jīng)濟損失。同時，枯草芽孢桿菌具有對人畜無毒無害、不污染環(huán)境、非致病性和抗逆性強等特點，能夠產(chǎn)生多種生長激素類物質(zhì)和豐富的抗菌物質(zhì)，促進植物生長，改善植株生長發(fā)育。本發(fā)明種子處理方法簡單，可廣泛應(yīng)用于黨參的栽培，具有重要的社會、經(jīng)濟和生態(tài)經(jīng)濟價值。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0011]圖1:萌發(fā)3天后黨參種子發(fā)芽情況比較。圖中四個小圖分別表示對照、有益細菌菌液浸泡黨參種子5分鐘、10分鐘和20分鐘；
[0012]圖2:萌發(fā)3天后黨參種子萌發(fā)幼苗根系發(fā)育情況比較。左上圖為有益細菌菌液浸泡黨參種子5分鐘，左右圖為對照；下圖為放大的黨參萌發(fā)種子；
[0013]圖3:GB03菌液浸泡對黨參種子發(fā)芽勢的影響。圖中四個柱子分別表示對照、有益細菌菌液浸泡黨參種子5分鐘、10分鐘和20分鐘的黨參種子發(fā)芽勢；
[0014]圖4:GB03菌液浸泡對黨參種子發(fā)芽率的影響。圖中四個柱子分別表示對照、有益細菌菌液浸泡黨參種子5分鐘、10分鐘和20分鐘的黨參種子發(fā)芽率。`【具體實施方式】
[0015]以下對本發(fā)明的原理和特征進行描述，所舉實例只用于解釋本發(fā)明，并非用于限定本發(fā)明的范圍。所述【技術(shù)領(lǐng)域】的普通技術(shù)人員依據(jù)以上本發(fā)明公開的內(nèi)容和各參數(shù)所取范圍，均可實現(xiàn)本發(fā)明的目的。
[0016]實施例1:一種根際有益細菌促進黨參種子萌發(fā)的方法，其主要特點在于步驟為:
[0017](I)黨參種子消毒處理:籽粒飽滿無缺損、均勻一致的黨參種子，用75%的酒精浸泡8s后,使用5%次氯酸鈉浸泡IOmin,用滅菌的蒸懼水沖洗7_8次,于4°C冰箱過夜；
[0018](2)枯草芽孢桿菌GB03菌液制備:
[0019]先配制LB液體培養(yǎng)基:按照氯化鈉5g/L、胰蛋白胨10g/L和酵母粉5g/L的比例配制，用標準型PH計(PB-10，北京賽多利斯)調(diào)pH到6.8，使用立式壓力蒸汽滅菌鍋(LDZX-50KBS,上海申安)高溫118-125°C滅菌待冷卻后，每IOOmL的LB液體培養(yǎng)基加入50μ L的GB03菌液，在轉(zhuǎn)速為180r/min下，溫度為28°C的恒溫培養(yǎng)搖床(THZ-300，上海一恒科技)上培養(yǎng)過夜后，使用核酸檢測儀(NanoDix)P 1000，德國)測定菌液濃度為0D600 =0.9時取出備用，菌液為現(xiàn)配現(xiàn)用。
[0020](3)種子菌液處理:將步驟(1)處理完成種子浸泡于枯草芽孢桿菌GB03菌液中5min，然后將菌液倒出，處理完成的種子進行播種。
[0021]實施例2: —種根際有益細菌促進黨參種子萌發(fā)的方法，其主要特點在于步驟為:[0022](1)黨參種子消毒處理:籽粒飽滿無缺損、均勻一致的黨參種子，用75%的酒精浸泡9s后,使用5%次氯酸鈉浸泡Ilmin,用滅菌的蒸懼水沖洗7_8次,于2°C冰箱過夜；
[0023](2)枯草芽孢桿菌GB03菌液制備:
[0024]先配制溶菌肉湯LB液體培養(yǎng)基:按照氯化鈉、胰蛋白胨和酵母粉的比例為1:2:1 配制，溶劑為蒸餾水JMpH到7.2，高溫為115-118°c滅菌，待冷卻溫度為20°C后，每IOOmL 的LB液體培養(yǎng)基加入80 ii L的枯草芽孢桿菌GB03菌液，在轉(zhuǎn)速為180_250r/min下，溫度為25°C的恒溫培養(yǎng)搖床上培養(yǎng)過夜后，測定菌液濃度為OD6tltl為0.8-1.0時，取出備用。
[0025](3)種子菌液處理:將步驟(1)處理完成種子浸泡于枯草芽孢桿菌GB03菌液中 lOmin，然后將菌液倒出，處理完成的種子進行播種。
[0026]實施例3: —種根際有益細菌促進黨參種子萌發(fā)的方法，其主要特點在于步驟為:
[0027](I)黨參種子消毒處理:籽粒飽滿無缺損、均勻一致的黨參種子，用75%的酒精浸泡IOs后,使用5%次氯酸鈉浸泡12min,用滅菌的蒸懼水沖洗7_8次,于4°C冰箱過夜；
[0028](2)枯草芽孢桿菌GB03菌液制備:
[0029]先配制溶菌肉湯LB液體培養(yǎng)基:按照氯化鈉、胰蛋白胨和酵母粉的比例為1:2:1 配制，溶劑為蒸餾水JMpH到7.2，高溫為125-132°c滅菌，待冷卻溫度為35°C后，每IOOmL 的LB液體培養(yǎng)基加入100 u L的枯草芽孢桿菌GB03菌液，在轉(zhuǎn)速為180_250r/min下，溫度為30°C的恒溫培養(yǎng)搖床上培養(yǎng)過夜后，測定菌液濃度為OD6tltl為0.8-1.0時，取出備用；
[0030](3)種子菌液處理:將步驟(1)處理完成種子浸泡于枯草芽孢桿菌GB03菌液中 20min，然后將菌液倒出，處理完成的種子進行播種。
[0031]實驗例:根際有益細菌促進黨參種子萌發(fā)的方法
[0032]I材料與方法
[0033]1.1 材料
[0034]黨參種子于2011年10月采自甘肅岷縣中藥材技術(shù)指導(dǎo)站藥園，經(jīng)甘肅中醫(yī)學(xué)院王引權(quán)教授鑒定為桔梗科黨參屬植物黨參Codonopsispilosula(Franch.)Nannf.,種子保存于實驗室4°C冰箱?？莶菅挎邨U菌GB03菌株由美國德克薩斯州理工大學(xué)Paul W.Par6教授實驗室提供，保存于-80°C冰箱。75%酒精、次氯酸鈉、氯化鈉均為標準試劑。酵母粉、胰蛋白胨和瓊脂粉為英國進口試劑。
[0035]1.2實驗方法
[0036]1.2.1種子處理
[0037]挑選籽粒飽滿無缺損、均勻一致的黨參種子，于超凈工作臺用75%的酒精、5%次氯酸鈉中分別浸泡IOs和IOmin后，用滅菌的蒸餾水沖洗7-8次，于4°C冰箱過夜。
[0038]1.2.2枯草芽胞桿菌GB03菌液的制備
[0039]配制LB液體培養(yǎng)基:按照氯化鈉5g/L、胰蛋白胨10g/L和酵母粉5g/L的比例配制，用標準型PH計(PB-10，北京賽多利斯)調(diào)pH到7.2，使用立式壓力蒸汽滅菌鍋 (LDZX-50KBS,上海申安)高溫滅菌待冷卻后，每IOOmL的LB液體培養(yǎng)基加入100 y L的GB03 菌液，在轉(zhuǎn)速為180r/min下，溫度為28°C的恒溫培養(yǎng)搖床(THZ-300，上海一恒科技)上培養(yǎng)過夜后，使用核酸蛋白檢測儀(NanoDix)P 1000，德國)測定菌液濃度為0D_ = 0.9時取出備用，菌液為現(xiàn)配現(xiàn)用。
[0040]1.2.3菌液浸泡種子萌發(fā)的實驗[0041]在滅菌的離心管中加入培養(yǎng)好的GB03菌液，然后將消毒好的黨參種子浸泡在菌液中(無菌水作對照)，計時5min、10min和20min后,迅速取出種子,平鋪在已滅菌鋪有兩層濾紙的培養(yǎng)皿中，鋪種之前，在濾紙上滴入等量無菌水，至濾紙表面形成水膜為止，取出的種子均勻的鋪在濾紙上，每皿100粒，置于25°C黑暗條件培養(yǎng)，每天統(tǒng)計觀察發(fā)芽情況，培養(yǎng)IOd后統(tǒng)計發(fā)芽率，計算發(fā)芽勢。
[0042]1.3數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計分析方法
[0043]實驗中以胚根突破種皮，露白視為萌發(fā)，每天觀察黨參種子并記錄當(dāng)天萌發(fā)的種子數(shù)量，發(fā)芽率(GP) = (Gt/T)X100%，S* Gt為發(fā)芽終了全部發(fā)芽的種子數(shù)，T為種子的總數(shù)；發(fā)芽勢是指在種子發(fā)芽過程中日發(fā)芽種子數(shù)達到最高峰時，黨參發(fā)芽勢確定為發(fā)芽第3d，發(fā)芽的種子數(shù)占供測樣品種子數(shù)的百分率。發(fā)芽勢是判斷田間出苗率的指標(楊曉杰等2003;趙蘭枝等2004)。每處理設(shè)置至少6個重復(fù)，圖表中的數(shù)值為平均值土 SE ;采用Excel 2003和SPSS 13.0分別進行數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計分析，用One-way ANOVA檢驗各處理間差異的顯著水平。
[0044]2結(jié)果與分析
[0045]發(fā)芽勢是衡量種子萌發(fā)能力的重要標準，發(fā)芽勢高的種子，生命力強，在大田的播種發(fā)芽率較高，播種后幼苗出土正常。由圖1可以看出，萌發(fā)實驗第3天枯草芽孢桿菌菌株GB03菌液侵泡5min、IOmin和20min后的黨參種子萌發(fā)數(shù)量較多；從圖2可以看出侵泡5分鐘的黨參萌發(fā)種子胚根上根毛明顯多于對照。由圖3可以看出，GB03菌液浸泡黨參種子5min、10min和20min后，較對照均顯著(P〈0.05)提高了黨參種子發(fā)芽勢，提高幅度分別為2.1倍、1.9倍和1.5倍，其中5min效果最佳，對發(fā)芽勢的提高能力最強。從圖4可以看出，GB03菌液浸泡黨參種子5min、IOmin和20min后，較對照對黨參種子的發(fā)芽率均有提高，其中5min、IOmin浸泡提高黨參種子發(fā)芽率8.0%和2.0%，20min顯著(P〈0.05)提高發(fā)芽率
11.6%(P〈0.05)。本實驗結(jié)果`表明，菌液浸泡黨參種子5min對種子萌發(fā)的促進效果最佳，尤其是對發(fā)芽勢的提高最為顯著。
[0046]3 討論
[0047]發(fā)芽勢為發(fā)芽初期比較集中的發(fā)芽率，它決定著出苗的整齊程度，發(fā)芽勢高，則出苗整齊，苗生長一致，反之，苗參差不齊，在發(fā)芽率相同時，發(fā)芽勢高的種子生命力強，在場地的播種發(fā)芽率較高，播種后幼苗出土正常，所以，發(fā)芽勢是計算播種量的因子之一。
[0048]本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，枯草芽孢桿菌菌液GB03浸泡顯著提高了黨參種子發(fā)芽勢，從而提高了黨參種子活力。
[0049]綜上所述，枯草芽孢桿菌菌株GB03菌液浸泡顯著提高了黨參種子發(fā)芽勢，對發(fā)芽勢的促進作用較發(fā)芽率更為明顯，從而提高了黨參種子活力和出苗率，保持較整齊的發(fā)芽率，克服了生產(chǎn)上黨參種子小，發(fā)芽率低的問題，從而減少生產(chǎn)上黨參補苗及反復(fù)發(fā)芽造成的人力等經(jīng)濟損失。研究GB03對種子萌發(fā)的調(diào)控，可以更好為其在實際生產(chǎn)中的應(yīng)用提供理論依據(jù)與技術(shù)指導(dǎo)。
[0050]4 小結(jié)
[0051](I)枯草芽孢桿菌GB03菌液浸泡黨參種子5min、IOmin和20min后,較對照均顯著(P〈0.05)的提高了黨參種子的發(fā)芽勢，提高幅度分別為211.8%、192.5%和145.8%，其中5min效果最佳。[0052](2)枯草芽孢桿菌GB03菌液浸泡黨參種子5min、IOmin和20min后，較對照對黨參種子的發(fā)芽率均有提高，其中5min、IOmin浸泡提高黨參種子發(fā)芽率為8.0%和2.0%，20min 顯著(P〈0.05)提高了發(fā)芽率為11.6%。
[0053]以上所述僅為本發(fā)明的較佳實施例，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)所作的任何修改、等同替換、改進等，均應(yīng)包含在本發(fā)明`的保護范圍之內(nèi)。
【權(quán)利要求】
1.一種根際有益細菌促進黨參種子萌發(fā)的方法，其特征包括以下步驟: (1)黨參種子消毒處理:籽粒飽滿無缺損、均勻一致的黨參種子，用75%的酒精浸泡8-10s后，使用5%次氯酸鈉浸泡10-12min，用滅菌的蒸餾水沖洗7-8次，于2-4°C冰箱過夜； (2)枯草芽孢桿菌GB03菌液制備:配制溶菌肉湯LB液體培養(yǎng)基:按照氯化鈉、胰蛋白胨和酵母粉的比例為1:2:1配制，溶劑為蒸餾水JfpH到7.2，高溫為115-132°C滅菌，待冷卻溫度為20-35°C后，每IOOmL的LB液體培養(yǎng)基加入50-100 μ L的枯草芽孢桿菌GB03菌液，在轉(zhuǎn)速為180-250r/min下，溫度為25_30°C的恒溫培養(yǎng)搖床上培養(yǎng)過夜后，測定菌液濃度為OD6tltl為0.8-1.0時，取出備用； (3)種子菌液處理:將步驟(1)處理完成種子浸泡于枯草芽孢桿菌GB03菌液中5min-20min，然后將菌液倒出`，處理完成的種子進行播種。
【文檔編號】A01G7/06GK103548593SQ201310517934
【公開日】2014年2月5日 申請日期:2013年10月28日 優(yōu)先權(quán)日:2013年10月28日
【發(fā)明者】張金林, 吳永娜, 王鎖民, 呂昕培, 李靜, 韓慶慶, 包愛科 申請人:蘭州大學(xué)