高產(chǎn)吩嗪-1-羧酸和吩嗪-1-酰胺的根際假單胞菌的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種高產(chǎn)吩嗪-1-羧酸和吩嗪-1-酰胺的根際假單胞菌；所述根際假單胞菌為銅綠假單胞菌(Pseudomonas?aeruginosa)PA1201CCTCC?N0：M2013441。本發(fā)明菌株P(guān)A1201是在重慶市郊區(qū)水稻大田中采集根系土壤樣品時，分離純化得到的一株野生型環(huán)境微生物；該菌株能穩(wěn)定且高效生產(chǎn)殺菌劑吩嗪-1-羧酸和新型殺菌化合物吩嗪-1-酰胺，有效抑制水稻病害：水稻紋枯病菌(Rhizoctonia?solani)和水稻白葉枯病菌(Xanthomonas?oryzae?pv.oryzae)的生長；可利用該菌株的發(fā)酵次生代謝產(chǎn)物制備能夠有效控制植物真菌性和細(xì)菌性病害的微生物源農(nóng)藥。
【專利說明】高產(chǎn)吩嗪-1-羧酸和吩嗪-1-酰胺的根際假單胞菌
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于微生物【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一株高產(chǎn)吩嗪-1-羧酸和吩嗪-1-酰胺的根際假單胞菌。
【背景技術(shù)】[0002]世界人口在近半個世紀(jì)以來急劇增長，而全球耕地面積卻逐年減少，因此全球糧食需求總量不斷提高。當(dāng)代農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，農(nóng)藥的應(yīng)用極大程度地保障了糧食產(chǎn)量。特別是近些年逐漸崛起的生物農(nóng)藥，在不以污染環(huán)境為代價的基礎(chǔ)上，對農(nóng)作物病蟲害進(jìn)行防治，為提高糧食產(chǎn)量和品質(zhì)做出了巨大的貢獻(xiàn)。生物農(nóng)藥是指利用生物活體(包括動物、植物、微生物)或其代謝產(chǎn)物殺滅或抑制農(nóng)業(yè)有害生物(包括害蟲、致病細(xì)菌和致病真菌)的農(nóng)藥制劑。由于源于自然，生物農(nóng)藥通常具有高效、廣譜及與環(huán)境相容性好等特點(diǎn)，已成為當(dāng)代農(nóng)業(yè)發(fā)展的必然趨勢。
[0003]植物根際促生菌(plantgrowth promoting rhizobacteria, PGPR)是指存在于植物根系周圍的一類可促進(jìn)植物生長或加強(qiáng)其對礦質(zhì)營養(yǎng)的吸收和利用，并能抑制有害生物的有益菌類；PGPR亦是自然界饋贈于人類社會的資源寶庫，眾多生物農(nóng)藥均源于PGPR及其代謝產(chǎn)物。歷經(jīng)長期大量的基礎(chǔ)及應(yīng)用研究，國內(nèi)外已有越來越多源于PGPR的生物農(nóng)藥被發(fā)現(xiàn)并被應(yīng)用于生物防治之中，例如:枯草芽孢桿菌QST713制劑可用于防治櫻桃、瓜類蔬菜、葡萄番茄等作物由真菌和細(xì)菌引起的瘡痂病、白粉病、褐斑病、早疫病、細(xì)菌性斑點(diǎn)病等多種病害；熒光假單胞菌PF — A22UL菌株可有效防治黃瓜白粉病；銅綠假單胞菌菌株63—28用于防治觀賞植物由真菌侵染引起的植物根部枯萎??；井同霉素是由水鏈霉菌井岡變種產(chǎn)生的一種多組分氨基糖苷類抗生素，被大量應(yīng)用于水稻紋枯病的生物防治。
[0004]井R霉素于上個世紀(jì)70年代開始使用，目前已成為我國使用量最大的農(nóng)用抗生素；然而，在經(jīng)歷了近40年的使用期后，部分水稻紋枯病菌對井R霉素已產(chǎn)生了一定的抗藥性。申嗪霉素源于具有我國自主知識產(chǎn)權(quán)的熒光假單胞菌M18，是新一代的綠色生物農(nóng)藥，其主要成分是由M18菌株發(fā)酵生產(chǎn)的一種次生代謝產(chǎn)物吩嗪-1-羧酸可用于防治水稻紋枯病、西瓜枯萎病和甜椒疫病等真菌性根腐和莖腐病害。申嗪霉素的大田試驗(yàn)表明:申嗪霉素、井R霉素和進(jìn)口農(nóng)藥“滿穗”都能有效防治水稻紋枯病，申嗪霉素的實(shí)際使用量為I克/畝田，為井R霉素的五分之一左右，是“滿穗”的三分之一。但是在一般條件下，申嗪霉素在野生型菌株M18中的發(fā)酵效價約為0.05~0.1克/升(葛宜和等，假單胞菌gacA插入突變對藤黃綠膿菌素和吩嗪-1-羧酸合成代謝的差異性調(diào)控；微生物學(xué)報，第44卷第6期，2004)，不利于生產(chǎn)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的在于克服上述現(xiàn)有技術(shù)存在的缺陷，提供一種高產(chǎn)吩嗪-1-羧酸和吩嗪-1-酰胺的植物根際促生假單胞菌，根際銅綠假單胞菌PA1201 ;所述吩嗪-1-酰胺為新型抑菌化合物，利用本發(fā)明菌株的發(fā)酵次生代謝產(chǎn)物可制備能夠有效控制植物真菌性病害和細(xì)菌性病害的微生物源農(nóng)藥。
[0006]本發(fā)明菌株是在重慶市郊區(qū)水稻大田中采集根系土壤樣品時，分離純化得到的一種野生型環(huán)境微生物。經(jīng)16s rDNA序列分析和MIDI SHERLOCK微生物自動鑒定系統(tǒng)分析，該菌株被鑒定為銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa),并被命名為PA1201。本發(fā)明的菌株銅綠假單胞菌PA1201, Pseudomonas aeruginosa PA1201已于2013年9月23日在中國典型培養(yǎng)物保藏中心(地址:中國武漢，武漢大學(xué)，郵編:430072)保藏，分類命名為銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa),保藏號為 CCTCC NO:M2013441。
[0007]本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)的:
[0008]第一方面，本發(fā)明涉及一株高產(chǎn)吩嗪-1-羧酸和吩嗪-1-酰胺的根際假單胞菌，所述根際假單胞菌為銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa) PA1201CCTCC M2013441。
[0009]第二方面，本發(fā)明涉及一種用前述的根際假單胞菌制備吩嗪-1-羧酸和吩嗪-1-酰胺的方法，所述方法具體包括如下步驟:
[0010]A、菌株發(fā)酵；
[0011]B、調(diào)節(jié)發(fā)酵液pH值為3.0~4.0，加入氯仿對發(fā)酵液進(jìn)行萃取，即得所述吩嗪-1-羧酸和吩嗪-1-酰胺。
[0012]優(yōu)選地，所述菌株發(fā)酵具體為:接種所述菌株P(guān)A1201于LB平板上，在25~37°C下活化生長18~28小時，然后挑取所述PA1201單克隆接種于LB培養(yǎng)液，在25~30°C的搖床中震蕩培養(yǎng)16~24小時，搖床轉(zhuǎn)速為180~220轉(zhuǎn)/分，得種子液；將所述種子液以I~5%的接種量接種于黃豆粉發(fā)酵培養(yǎng)液中進(jìn)行放大發(fā)酵培養(yǎng)，在25~30°C的搖床中震蕩發(fā)酵培養(yǎng)36~48小時，搖床轉(zhuǎn)速為180~220轉(zhuǎn)/分。
[0013]優(yōu)選地，所述LB培養(yǎng)液具體`為，每IL培養(yǎng)液的制備方法包括如下步驟:取去離子水I升、胰蛋白胨10克、酵母提取物5克、氯化鈉10克，混合，pH調(diào)節(jié)為7.0~7.4，121 °C高壓滅菌15分鐘后，即得。
[0014]優(yōu)選地，所述黃豆粉發(fā)酵培養(yǎng)液具體為，每IL發(fā)酵培養(yǎng)液的制備方法包括如下步驟:取去離子水978毫升、黃豆粉65克、玉米漿16克、葡萄糖12克、無水乙醇22毫升，混合，pH調(diào)節(jié)為6.8~7.2，121°C高壓滅菌15分鐘后，即得。
[0015]優(yōu)選地，所述調(diào)節(jié)發(fā)酵液pH值采用的是5~7M的鹽酸。
[0016]優(yōu)選地，所述氯仿與發(fā)酵液的體積比為3:1~4:1。
[0017]第三方面，本發(fā)明涉及一種前述的根際假單胞菌在制備防治水稻白葉枯病農(nóng)藥中的用途。
[0018]本發(fā)明具有如下有益效果:
[0019]1.本發(fā)明菌株P(guān)A1201能穩(wěn)定且高效生產(chǎn)吩嗪_1_羧酸:
[0020]從甜瓜根際分離得到的生物拮抗菌株M18中吩嗪-1-羧酸的發(fā)酵效價較低，一般為0.05~0.1克/升發(fā)酵液(葛宜和等，假單胞菌gacA插入突變對藤黃綠膿菌素和吩嗪-1-羧酸合成代謝的差異性調(diào)控；微生物學(xué)報，第44卷第6期，2004)，與之相比，本發(fā)明菌株P(guān)A1201高產(chǎn)吩嗪-1-羧酸，每升發(fā)酵液中的含量可達(dá)0.8~1.0克。因此，與M18原始菌株相比，PA1201的發(fā)酵效價提高近10倍。
[0021]2.本發(fā)明菌株P(guān)A1201能產(chǎn)生新型殺菌化合物吩嗪_1_酰胺:
[0022]在國際上，生防細(xì)菌綠針假單胞菌PCL1391 (Pseudomonas chlororaphisPCL1391)的次生代謝產(chǎn)物吩嗪-1-酰胺(PCN)，可有效抑制一系列植物病原真菌，包括尖孢鐮刀菌、水稻紋枯病菌、灰霉病菌、終極腐霉菌、黑白輪枝菌及胡蘿卜鏈格孢菌，且PCN在中性和喊性條件下的抑菌活性是PCA的5—10倍(Chin—A一Woeng et al., Biocontrol byPhenazine-1-carboxamide—Producing Pseudomonas chjororaphis PCL1391of TomatoRoot Rot Caused by Fusarium oxysporum f.sp.radicis-lycopersic1.Molecularplant-microbe interactions，1998，11:1069—1077.)。然而，該菌株 PCL1391 的 PCN 產(chǎn)量較低，即使經(jīng)多重發(fā)酵優(yōu)化后，其發(fā)酵效價僅達(dá)到150毫克/升(Chin— A— Woeng etal., Introduction of thephzH gene of Pseudomonas chjororaphis PCL1391extendsthe range of biocontrol ability of phenazine—l—carboxylic acid—producingPseudomonas spp.strains.Molecular plant—microbelnteractions, 2001.14:1006—1015.)。本發(fā)明菌株P(guān)A1201的吩嗪-1-酰胺的發(fā)酵效價可達(dá)350~450毫克/升發(fā)酵液，是原有技術(shù)的2~3倍左右。
[0023]3.本發(fā)明菌株P(guān)A1201能有效抑制水稻白葉枯病菌(Xanthomonas oryzaepv.0ryzae)菌株 PX099A 的生長:
[0024]水稻白葉枯病是世界性細(xì)菌性病害，在中國是僅次于稻瘟病的第二大病，對水稻生產(chǎn)危害極大(章琦，水稻白葉枯病抗性的遺傳及改良。北京:科學(xué)出版社，2007，xiii—xvi1.)。由于植物病原細(xì)菌繁殖速度快、侵染途徑多、遠(yuǎn)距離傳播與近距離擴(kuò)散相輔相成，因而較難進(jìn)行防治(彭煒，植物細(xì)菌性病害研究初探。摘自《植物病理學(xué)研究進(jìn)展》(王琦，姜道宏主編)。北京:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)技術(shù)出版社，2007，72— 76)。常用于防治白葉枯的農(nóng)藥有葉枯寧、葉枯凈，葉枯靈等(蔡祝南等，水稻病蟲害防治。北京:金盾出版社，2006，5—23)。其中，農(nóng)藥葉枯凈的主要成分為5-氧吩嗪，其工業(yè)生產(chǎn)通常通過化學(xué)方法合成，例如:以苯為溶劑，氫氧化鈉為催化劑，由苯胺和硝基苯合成制備。然而，以該方法合成5-氧吩嗪，會產(chǎn)生大量工業(yè)三廢，污染環(huán)境，給生態(tài)環(huán)境造成眾多隱患。本發(fā)明菌株P(guān)A1201能同時高效產(chǎn)生抑菌化合物吩嗪-1-羧酸和吩嗪-1-酰胺，它們的化學(xué)結(jié)構(gòu)與葉枯凈相似(見圖5)，且在平板抑菌實(shí)驗(yàn)中PA1201可有效抑制水稻白葉枯病菌的生長。因此，本發(fā)明菌株P(guān)A1201及其代謝產(chǎn)物(吩嗪-1-羧酸和吩嗪-1-酰胺)可用于生物防治水稻白葉枯病菌，響應(yīng)了我國生物農(nóng)藥防治細(xì)菌性病害的強(qiáng)烈需求，并可有效避免通過化學(xué)方法合成5-氧吩嗪(葉枯凈)所帶來的生態(tài)環(huán)境污染問題，有利于現(xiàn)代農(nóng)業(yè)的健康發(fā)展。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0025]通過閱讀參照以下附圖對非限制性實(shí)施例所作的詳細(xì)描述，本發(fā)明的其它特征、目的和優(yōu)點(diǎn)將會變得更明顯:
[0026]圖1為銅綠假單胞菌PA1201的單細(xì)胞形態(tài)示意圖；
[0027]圖2為PA1201有效抑制水稻紋枯病菌菌絲生長的示意圖；
[0028]圖3為PA1201有效抑制水稻白葉枯病菌生長的不意圖；
[0029]圖4為細(xì)菌侵染A549細(xì)胞5小時后，A549的細(xì)胞存活率的比較示意圖；
[0030]圖5為吩嗪-1-羧酸、吩嗪-1-酰胺和5-氧吩嗪的化學(xué)結(jié)構(gòu)示意圖。
【具體實(shí)施方式】[0031]下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說明。以下實(shí)施例將有助于本領(lǐng)域的技術(shù)人員進(jìn)一步理解本發(fā)明，但不以任何形式限制本發(fā)明。應(yīng)當(dāng)指出的是，對本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若干調(diào)整和改進(jìn)。這些都屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，或按照制造廠商所建議的條件。
[0032]實(shí)施例
[0033]本發(fā)明菌株是在重慶市郊區(qū)水稻大田中采集根系土壤樣品時，分離純化得到的一株野生型環(huán)境微生物。經(jīng)16s rDNA序列分析和MIDI SHERLOCK微生物自動鑒定系統(tǒng)分析，該菌株被鑒定為銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa) PA1201。
[0034]一、本發(fā)明菌株培養(yǎng)及適宜的生長條件:
[0035]本菌株生長溫度范圍是20~42°C，最適宜溫度為25~30°C，可在以下三種培養(yǎng)基中生長。
[0036]1.基礎(chǔ)培養(yǎng)基為無機(jī)鹽培養(yǎng)基。所述無機(jī)鹽培養(yǎng)基具體為，每IL培養(yǎng)基的制備方法包括如下步驟:取去離子水I升、磷酸二氫鉀4.5克、磷酸氫二鉀10.5克、甘露醇2克、硫酸銨2克、七水合硫酸鎂0.16克、七水合硫酸亞鐵5毫克、二水合氯化鈣11毫克、四水合氯化錳2毫克、瓊脂15克，混合，pH調(diào)節(jié)為6.8~7.2，121攝氏度高壓滅菌15分鐘后，即得。
[0037]2.常規(guī)培養(yǎng)基為溶菌肉湯(LB)培養(yǎng)基。所述LB培養(yǎng)基具體為，每IL培養(yǎng)基的制備方法包括如下步驟:取去離子水I升、胰蛋白胨10克、酵母提取物5克、氯化鈉10克、瓊脂15克，混合，pH調(diào)節(jié)為7.0~7.4，121攝氏度高壓滅菌15分鐘后，即得。
[0038]3.發(fā)酵培養(yǎng)液為黃豆粉發(fā)酵培養(yǎng)液。所述黃豆粉發(fā)酵培養(yǎng)液具體為，每IL培養(yǎng)液的制備方法包括如下步驟:取去離子水978毫升、黃豆粉65克、玉米漿16克、葡萄糖12克、無水乙醇22毫升，混合，pH調(diào)節(jié)為6.8~7.2，121攝氏度高壓滅菌15分鐘后，即得。
[0039]二、本發(fā)明菌株具有如下微生物學(xué)特征:
[0040]1.細(xì)胞形態(tài)特征:桿狀，(I~3) μ mX (0.5~I) μ m，極性單生鞭毛(如圖1所示)；
[0041]2.在溶菌肉湯(LB)平板上的單克隆形態(tài)(30°C，36h):
[0042]菌落性狀:圓形；
[0043]菌落表面隆起:平滑、有光澤、菌落粘稠，邊緣整齊；
[0044]菌落大小:2~3_ ；
[0045]色調(diào):淺黃。
[0046]3.抗生素最低抑菌濃度(Minimal Inhibition Concentration, MIC)
[0047]將本發(fā)明菌株P(guān)A1201接種于含有不同濃度抗生素(包括:卡那霉素、羧芐青霉素、慶大霉素、四環(huán)素和壯觀霉素)的LB培養(yǎng)液中進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為28~30°C，搖床轉(zhuǎn)速為180轉(zhuǎn)/分。在培養(yǎng)過程中，通過測量發(fā)酵液在600nm時的吸光值，實(shí)時監(jiān)測發(fā)酵液的細(xì)胞密度。培養(yǎng)48小時后，繪制PA1201在各個條件下的生長曲線，確定測試抗生素可抑制該菌株生長的最低濃度(表1)。我們發(fā)現(xiàn):本發(fā)明菌株P(guān)A1201能抗較高濃度的卡那霉素和壯觀霉素，但對四環(huán)素和慶大霉素敏感。所述LB培養(yǎng)液具體為，每IL培養(yǎng)液的制備方法包括如下步驟:取去離子水I升、胰蛋白胨10克、酵母提取物5克、氯化鈉10克，混合，pH調(diào)節(jié)為7.0~7.4，121攝氏度高壓滅菌15分鐘后，即得。[0048]表1抗生素對PA1201的最低抑菌濃度
【權(quán)利要求】
1.一株高產(chǎn)吩嗪-1-羧酸和吩嗪-1-酰胺的根際假單胞菌，其特征在于，所述根際假單胞菌為銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa) PA1201CCTCC NO:M2013441 ?
2.一種用如權(quán)利要求1所述的根際假單胞菌制備吩嗪-1-羧酸和吩嗪-1-酰胺的方法，其特征在于，所述方法具體包括如下步驟: A、菌株發(fā)酵； B、調(diào)節(jié)發(fā)酵液pH值為3.0~4.0，加入氯仿對發(fā)酵液進(jìn)行萃取，即得所述吩嗪-1-羧酸和吩嗪-1-酰胺混合物。
3.如權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于，所述菌株發(fā)酵具體為:接種所述菌株P(guān)A1201于LB平板上，在25~37°C下活化生長18~28小時，然后挑取所述PA1201單克隆接種于LB培養(yǎng)液，在25~30°C的搖床中震蕩培養(yǎng)16~24小時，搖床轉(zhuǎn)速為180~220轉(zhuǎn)/分，得種子液；將所述種子液以1~5%的接種量接種于黃豆粉發(fā)酵培養(yǎng)液中進(jìn)行放大發(fā)酵培養(yǎng)，在25~30°C的搖床中震蕩發(fā)酵培養(yǎng)36~48小時，搖床轉(zhuǎn)速為180~220轉(zhuǎn)/分。
4.如權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征在于，所述LB培養(yǎng)液具體為，每IL培養(yǎng)液的制備方法包括如下步驟:取去離子水I升、胰蛋白胨10克、酵母提取物5克、氯化鈉10克，混合，pH調(diào)節(jié)為7.0~7.4，121°C高壓滅菌15分鐘后，即得。
5.如權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征在于，所述黃豆粉發(fā)酵培養(yǎng)液具體為，每IL發(fā)酵培養(yǎng)液的制備方法包括如下步驟:取去離子水978毫升、黃豆粉65克、玉米漿16克、葡萄糖12克、無水乙醇22毫升，混合，pH調(diào)節(jié)為6.8~7.2，121°C高壓滅菌15分鐘后，即得。
6.如權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于，所述調(diào)節(jié)發(fā)酵液pH值采用的是5~7M的鹽酸溶液。
7.如權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于，所述氯仿與發(fā)酵液的體積比為3:1~4: 1.
8.—種如權(quán)利要求1所述的根際假單胞菌在制備防治水稻白葉枯病農(nóng)藥中的用途。
【文檔編號】A01P1/00GK103834585SQ201310511796
【公開日】2014年6月4日 申請日期:2013年10月24日 優(yōu)先權(quán)日:2013年10月24日
【發(fā)明者】周蓮, 何亞文 申請人:上海交通大學(xué)