果蠅腸道免疫相關(guān)基因的篩選方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種初步篩選果蠅腸道免疫相關(guān)基因的方法，本發(fā)明通過給基因突變體果蠅喂食不同種類的微生物、過氧化物、高鹽離子以及具有高毒性的化學(xué)物質(zhì)后，觀察突變體果蠅生存率，并檢測生存率較低的果蠅腸道形態(tài)變化及細(xì)胞凋亡情況，同時(shí)利用real-time?PCR方法檢測突變體果蠅腸道中一些已知參與腸道免疫的信號通路的激活情況，從而能夠系統(tǒng)、簡便、快速的初步篩選出與果蠅腸道免疫相關(guān)的基因，不但有利于研究者更好的理解復(fù)雜的腸道免疫調(diào)節(jié)機(jī)制，同時(shí)也為治療腸道疾病提供新的思路。
【專利說明】果蠅腸道免疫相關(guān)基因的篩選方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于果蠅天然免疫領(lǐng)域，本發(fā)明涉及一種篩選果蠅腸道免疫相關(guān)基因的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]腸道粘膜除具有消化吸收功能外，還是內(nèi)部與外部環(huán)境之間的一種屏障，能夠保護(hù)宿主免受病原微生物的入侵，同時(shí)也是菌群與宿主免疫系統(tǒng)的調(diào)節(jié)者。當(dāng)受到外界環(huán)境的不斷地刺激時(shí)，腸道上皮細(xì)胞會對內(nèi)部和外部因子作出應(yīng)答進(jìn)而確保它們自身的生存及適當(dāng)?shù)哪c道內(nèi)環(huán)境。近年來，越來越多的人受到腸道炎癥疾病的困擾，而且長時(shí)間的炎癥及組織損傷將導(dǎo)致腸道的癌變及腫瘤的形成。雖然人體可通過天然和獲得性免疫來抵抗腫瘤，但現(xiàn)實(shí)條件下由于廣泛的免疫逃逸機(jī)制的存在，腫瘤極少能自然消退。因此，闡明腸道上皮細(xì)胞與多種微生物之間的相互作用及共生菌群參與宿主胞內(nèi)信號通路的調(diào)節(jié)機(jī)制對于腸道疾病的治療具有重要的指導(dǎo)意義。
[0003]果蠅作為一個(gè)經(jīng)典的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ鸵阎饾u地應(yīng)用于腸道免疫的研究，一些重要的影響腸道免疫的信號通路已經(jīng)建立，近幾年的研究熱點(diǎn)主要集中在ROS(活性氧)及局部AMPs(抗菌肽)的產(chǎn)生，這兩種重要的互補(bǔ)效應(yīng)機(jī)制控制著腸道微生物的感染。在果蠅腸道中，NADPH氧化酶DUOX參與產(chǎn)生的ROS為抵抗微生物的入侵提供了有效的保護(hù)屏障，而MD(Immunedeficiency)信號通路誘導(dǎo)的局部AMPs的表達(dá)在腸道免疫中也發(fā)揮了重要的作用。同時(shí)為避免長時(shí)間過度的免疫反應(yīng)，果蠅腸道會通過多種調(diào)節(jié)機(jī)制來限制IMD通路的活性及ROS的產(chǎn)生，這些保護(hù)機(jī)制也是維持共生菌及非病原菌生長所需要的條件。此外，腸道干細(xì)胞(ISCs)能通過增殖和分化來修復(fù)由微生物感染引起的腸道上皮細(xì)胞的損傷，而調(diào)節(jié)果蠅腸道干細(xì)胞分化的調(diào)節(jié)機(jī)制也正逐漸被闡明。已知腸道干細(xì)胞的分化受多種信號通路的調(diào)節(jié)，主要包括:Notch、Wnt、BMP (Bone Morphogenic Protein) > MAPK (Mitogen-ActivatedProtein Kinase)、JAK-STAT (Janus Kinase and Signal Transducer and Activator ofTranscription)等信號途徑。有研究發(fā)現(xiàn)，損傷的腸細(xì)胞能分泌細(xì)胞因子Upd3,它能夠激活JAK-STAT信號通路，進(jìn)而促進(jìn)腸道干細(xì)胞增殖及上皮細(xì)胞再生，同時(shí)發(fā)現(xiàn)JNK (c-JunN-terminal Kinases)途徑也能對微生物感染引起的腸道損傷作出免疫應(yīng)答。而Hippo信號通路能通過抑制JAK-STAT和EGFR (Epidermal Growth Factor Receptor)信號通路的激活因子來負(fù)調(diào)控腸道干細(xì)胞的分化。
[0004]果蠅與人類的腸道具有相似的結(jié)構(gòu)和功能，腸道干細(xì)胞的分化機(jī)制也十分相似，同時(shí)癌基因與腫瘤基因在果蠅與人類之間也是高度保守的，因此闡明果蠅腸道免疫調(diào)節(jié)機(jī)制及腸道干細(xì)胞分化機(jī)制對揭示人類腸道相關(guān)疾病的發(fā)病機(jī)制具有重要的指導(dǎo)作用。然而，盡管近年來果蠅模型已為腸道免 疫的研究提供了大量的信息，但一些重要的問題仍有待解決，例如，腸道上皮細(xì)胞區(qū)分共生菌群與病原菌群的機(jī)制還未被闡明，共生菌群誘導(dǎo)的NF-kB活性與ROS的基礎(chǔ)性表達(dá)對宿主的意義也尚不清楚，一些重要信號通路的調(diào)控因子還未被發(fā)現(xiàn)。因此，本領(lǐng)域有必要開發(fā)一種系統(tǒng)且高效的篩選果蠅腸道免疫基因的方法，從而有利于研究者更好的理解復(fù)雜的腸道免疫調(diào)節(jié)機(jī)制，同時(shí)也為治療腸道疾病提供新的思路。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的在于提供一種初步篩選果蠅腸道免疫相關(guān)基因的方法，該方法通過給基因突變體果妮喂食不同種類的微生物(Micrococcus Iuteus和Beauveria bassiana孢子)、過氧化物(H202)、高鹽離子(NaCl)以及表面活性劑(SDS)后，觀察突變體果蠅生存率，腸道的形態(tài)變化及細(xì)胞凋亡，從而能夠簡便、快速的初步篩選出與果蠅腸道免疫相關(guān)的基因。
[0006]本發(fā)明所采用的技術(shù)方案包括如下步驟:
[0007]( I)突變體果蠅的獲得
[0008]在果蠅保種中心網(wǎng)站上查找并購買所感興趣的基因突變體果蠅
[0009](2)生存率實(shí)驗(yàn)中喂食果蠅所需菌液及化學(xué)試劑溶液的配制方法:
[0010]I) Micrococcus Iuteus 菌菌液的配制:將保種 Micrococcus Iuteus 菌菌液按I: 100比例接種于LB液體培養(yǎng)基中，37°C振蕩過夜培養(yǎng)后測其OD6tltl值，離心后收集菌體沉淀，在菌體沉淀中加入鹿糖并用去離子水定容，使Micrococcus Iuteus菌菌液終濃度達(dá)到0D6Q(I=150，蔗糖的終濃度為5%。
[0011]2)Beauveria bassiana抱子菌液的配制:將 B.bassiana bassiana 菌液涂布到 LB固體培養(yǎng)基上，25°C靜置培養(yǎng)7天，用PBS溶解并收集平板上的孢子，用裝有玻璃棉的注射器過濾除去孢子溶液中的殘`留的LB固體培養(yǎng)基，測其OD6tltl值，離心后收集菌體沉淀，在菌體沉淀中加入鹿糖并用去離子水定容，使Beauveria bassiana孢子終濃度達(dá)到0D_=2,鹿糖的終濃度為5%。
[0012]3) H2O2溶液的配制:在30%的H2O2原溶液中加入蔗糖并用去離子水定容，配制成H2O2的終濃度為1%，蔗糖的終濃度為5%的混合液。
[0013](3)生存率實(shí)驗(yàn)中果蠅培養(yǎng)基的配制方法:
[0014]I)標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基:每200mL去離子水中加入玉米粉14.2g、瓊脂1.lg、酵母粉3.3g、大豆粉1.9g、白糖17g和丙酸0.94mL。
[0015]2) SDS及NaCl培養(yǎng)基:在標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基凝固之前，按比例加入10%的SDS溶液或4MNaCl的溶液使其在培養(yǎng)基中的終濃度分別為0.5%及0.4M，并攪拌均勻。
[0016](4)生存率實(shí)驗(yàn)中微生物及化學(xué)試劑的喂食方法:
[0017]收集在標(biāo)準(zhǔn)果蠅培養(yǎng)基中培養(yǎng)并羽化3-4天的野生型及突變體果蠅，每種品系的果蠅均以30只為一組，其中雌雄各15只，將每組果蠅轉(zhuǎn)移到空果蠅管中進(jìn)行饑餓處理兩小時(shí)，轉(zhuǎn)移到配制好的SDS及NaCl培養(yǎng)基中，每兩天換一次培養(yǎng)基且每天記錄死亡果蠅數(shù)目；或?qū)囸I處理后的果蠅轉(zhuǎn)移到放有5層濾紙的果蠅管中，濾紙預(yù)先加入420 μ L的預(yù)先配制好的菌液或H2O2溶液將其充分浸潤，將浸潤濾紙后多余的液體吸出，每24h更換一次濾紙并記錄死亡果蠅數(shù)目。
[0018](5)果蠅腸道清除微生物能力的檢測方法:
[0019]將Alexa Fluor488 突光素(Invitrogen, Carlsbad, CA)加入到如步驟(2)所述預(yù)先配制好的Micrococcus Iuteus菌菌液中，30°C,孵育結(jié)合30min。[0020]收集羽化3-4天的野生型及突變體雌果蠅，分別以10-15只為一組進(jìn)行饑餓處理,2h后轉(zhuǎn)移到放有5層濾紙的果蠅管中，濾紙預(yù)先用420 μ L AlexaFluor488 (Invitrogen, Carlsbad, CA)標(biāo)記的 Μ.luteus 菌菌液充分浸潤，2h 后用Axioskop2plus microscope (Zeiss)突光顯微鏡對部分果蜆腹部突光信號進(jìn)行照相,剩余的果蠅轉(zhuǎn)移到用5%蔗糖浸潤5層濾紙的果蠅管中，喂食6h后用熒光顯微鏡對果蠅腹部熒光信號進(jìn)行照相。通過熒光信號強(qiáng)度比較腸道對微生物的清除能力，6h后的信號越強(qiáng)表明沒被清除的微生物越多，即腸道對微生物的清除能力就越弱。
[0021](6)檢測腸道死亡細(xì)胞的免疫熒光染色方法:
[0022]取連續(xù)喂食微生物或化學(xué)試劑3-4天的果蠅，在解剖鏡下對果蠅腹部進(jìn)行解剖，分離出完整的腸道置于PBS中，加入7-AAD染色30min，再用40g/L的多聚甲醛固定lOmin，DAPI染色I(xiàn)Omin,封片后在Zeiss突光顯微鏡下觀察并拍照。
[0023](7)腸道免疫相關(guān)信號通路激活情況的檢測方法:
[0024]給果蠅喂食微生物或化學(xué)試劑，并選取不同時(shí)間點(diǎn)分離果蠅腸道，提取腸道RNA并反轉(zhuǎn)錄成cDNA，用real-time PCR方法檢測腸道免疫相關(guān)信號通路靶基因的轉(zhuǎn)錄情況。
[0025]以下通過發(fā)明人給出的【具體實(shí)施方式】及附圖來對本發(fā)明作詳細(xì)說明。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0026]圖1為喂食B.bassiana孢子，M.1uteus及H2O2對野生型及突變體果蠅生存率的影響；
[0027]圖2為突變體果蠅腸道對M.1uteus清除能力的檢測；
`[0028]圖3為喂食M.1uteus后，觀察果蠅腸道形態(tài)變化及細(xì)胞死亡情況；
[0029]圖4為喂食SDS及NaCl對野生型及突變體果蠅生存率的影響；
[0030]圖5為喂食SDS對果蠅腸道形態(tài)及細(xì)胞死亡情況的影響；
[0031]圖6為喂食SDS對果蠅腸道dro3及upd3基因表達(dá)的影響。
【具體實(shí)施方式】
[0032]為進(jìn)一步說明本發(fā)明初步篩選果蠅腸道免疫相關(guān)基因的方法，特舉以下較佳實(shí)例加以說明，應(yīng)理解，本發(fā)明并不限于這些具體實(shí)例。
[0033]實(shí)施例一篩選影響果蠅腸道抗微生物感染的基因
[0034]發(fā)明人在前期的實(shí)驗(yàn)中篩選了 15種對真菌感染引起的天然免疫應(yīng)答具有重要調(diào)節(jié)作用的基因，且這些基因在果蠅腸道免疫中的功能還尚未報(bào)道，本研究主要以這15種抗真菌感染基因?yàn)檠芯繉ο?，詳?xì)基因名稱及其P因子插入缺失突變體如表1所示。本實(shí)驗(yàn)以野生型果蠅W1118為對照組(WT)。
[0035]表1:P因子插入基因缺失突變體
[0036]
【權(quán)利要求】
1.一種篩選果蠅腸道免疫相關(guān)基因的方法，其特征在于： (1)Wflybase網(wǎng)站上查找感興趣的基因，并從國內(nèi)外著名的果蠅保種中心購買所要篩選的基因突變體果蠅。 (2)對突變體果蠅喂食微生物，觀察突變體果蠅的生存率、腸道對微生物的清除能力，及喂食微生物后突變體果蠅腸道的形態(tài)變化、腸道細(xì)胞的凋亡情況。 (3)對突變體果蠅喂食能夠引起腸道炎癥及腸道應(yīng)激反應(yīng)的化學(xué)試劑，觀察突變體果蠅的生存率、腸道的形態(tài)變化、腸道細(xì)胞的凋亡情況。 (4)喂食微生物及化學(xué)試劑后檢測與果蠅腸道免疫、腸道炎癥及應(yīng)激反應(yīng)相關(guān)的信號通路的活化情況。
2.權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，基因突變體果蠅均購自GenExel果蠅保種中心，且均為P因子插入突變體。
3.權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述喂食的微生物為昆蟲致病性真菌Beauveria bassiana 及非致病性細(xì)菌 Micrococcus Iuteus0
4.權(quán)利要求1或3所述的方法,其特征在于,喂食Beauveriabassiana的孢子濃度為OD600=2, Micrococcus Iuteus濃度為0D6(I(I=150,觀察突變體果蠅的生存率。
5.權(quán)利要求1或3所述的方法，其特征在于，喂食連接AlexaFluor488熒光的Micrococcus Iuteus和Beauveria bassiana的抱子2h后喂食5%鹿糖6h,觀察突變體果蠅腸道對這兩種微生物的清除能力。
6.權(quán)利要求1或3所述的方法，其特征在于，喂食0D_值為150的Micrococcusluteus, 72h后觀察腸道的形態(tài)變化，用7-AAD染色后，觀察腸道細(xì)胞的死亡情況。
7.權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述喂食能夠引起腸道炎癥及腸道應(yīng)激反應(yīng)的化學(xué)試劑為過氧化物（H2O2)、高鹽離子（NaCl)以及表面活性劑（SDS )。
8.權(quán)利要求1或7所述的方法，其特征在于，喂食H2O2的濃度為1%，SDS的濃度為O.5%，NaCl的濃度為O. 4M，觀察突變體果蠅的生存率。
9.權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，喂食O.5%的SDS，96h后觀察突變體腸道的形態(tài)變化，144h后觀察腸道細(xì)胞的死亡情況。
10.權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，給果蠅喂食微生物或化學(xué)試劑后，選取多個(gè)不同時(shí)間點(diǎn)分離果蠅腸道，并用real-time PCR方法檢測腸道免疫相關(guān)信號通路靶基因的轉(zhuǎn)錄情況。
【文檔編號】A01K67/033GK103598147SQ201310479061
【公開日】2014年2月26日 申請日期:2013年10月15日 優(yōu)先權(quán)日:2013年10月15日
【發(fā)明者】金麗華, 郝陽光, 劉強(qiáng) 申請人:東北林業(yè)大學(xué), 金麗華