一種生石花無菌播種及再生體系建立的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種生石花無菌播種及再生體系建立的方法，具體操作步驟如下：1）培養(yǎng)基的配制，包括基本培養(yǎng)基和組培各階段培養(yǎng)基的組分；2)種子消毒及接種；3）愈傷組織的誘導及分化；4）不定芽的增殖；5）壯苗培養(yǎng)。本發(fā)明有益的效果：本發(fā)明利用植物組織培養(yǎng)技術對生石花進行無菌播種及再生快繁，能夠在短時間內獲得大量遺傳性狀一致的優(yōu)質壯苗，克服了常規(guī)繁殖方法慢的缺點，對其規(guī)?；a和種質資源收集及保存都具有積極意義。
【專利說明】一種生石花無菌播種及再生體系建立的方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及植物組織培養(yǎng)技術、植物莖尖培養(yǎng)技術，主要是一種生石花無菌播種及再生體系建立的方法。
【背景技術】 [0002]生石花(Lithops pseudotruncatella)為番杏科生石花屬植物。因其形態(tài)獨特、色彩斑斕，是很受歡迎的小型觀賞多肉植物。其自然繁殖率低，且原產地不在我國，加之人類過度采掘和對其生境的破壞，目前數(shù)量較少、市售價格居高不下，使其推廣受到限制。因此，利用植物組織培養(yǎng)技術進行阿房宮壽的快速繁殖，對于保存優(yōu)良種質資源、繁殖名優(yōu)珍稀品種具有重要的意義，以實現(xiàn)其規(guī)模化生產以滿足國內外市場的需求。植物組織培養(yǎng)方法可以在短期內快使植物速繁殖，不僅繁殖速度塊，且因為是無性繁殖可以保持與母株的一致的遺傳性狀。但是，在此之前還沒有關于建立生石花組培再生體系的報道，更沒有成功的實例。

【發(fā)明內容】

[0003]本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術存在的不足，而提供一種生石花無菌播種及再生體系建立的方法。
[0004]本發(fā)明的目的是通過如下技術方案來完成的。這種生石花無菌播種及再生體系建立的方法，包括如下步驟:
[0005]I)、培養(yǎng)基的配制:
[0006](I)基本培養(yǎng)基:MS或1/2MS，其中蔗糖20~30g/L，瓊脂5~9g/L，pH=5.8;
[0007](2)誘導培養(yǎng)基:MS+6-BA0.1 ~0.5mg/L+NAA0.05 ~0.lmg/L;
[0008](3)分化培養(yǎng)基:MS+6_BA0 ~0.05mg/L ；
[0009](4)增殖培養(yǎng)基:MS+6-BA0.05 ~0.3mg/L+NAA0.05 ~0.lmg/L;
[0010]2)種子的消毒及接種:以生石花的種子為外植體材料，將消毒處理后的種子在無菌條件下接種于誘導培養(yǎng)基上培養(yǎng)；
[0011]3)愈傷組織的誘導及分化:將步驟2)種子萌發(fā)后誘導愈傷組織形成并進行不定芽的分化培養(yǎng)；
[0012]4)不定芽的增殖:將步驟3)的不定芽叢接種于增殖培養(yǎng)基上進行增殖培養(yǎng)；
[0013]5)壯苗培養(yǎng):將步驟4)不定芽分成單株后轉至基本培養(yǎng)基上進行壯苗培養(yǎng)。
[0014]進一步地，本發(fā)明在所述步驟I)中，所述的培養(yǎng)基包括基本培養(yǎng)基和組培各階段培養(yǎng)基的組分具體為:
[0015](I)基本培養(yǎng)基:MS培養(yǎng)基，其中蔗糖20~30g/L，瓊脂5~9g/L，pH=5.8;
[0016](2)誘導培養(yǎng)基:MS+6-BA0.1 ~0.5mg/L+NAA0.05 ~0.lmg/L;
[0017](3)分化培養(yǎng)基:MS+6_BA0 ~0.05mg/L ；
[0018](4)增殖培養(yǎng)基:MS+6-BA0.05 ~0.3mg/L+NAA0.05 ~0.lmg/L;[0019]進一步地，本發(fā)明在所述步驟2)中，以生石花的種子為外植體材料，將其置于
1.5ml或2ml的PE離心管中進行消毒處理,先用洗潔精溶液浸泡0.5h后再用自來水清洗，然后依次在體積比為70%的酒精溶液和有效氯濃度為1%的次氯酸鈉溶液中分別浸泡30s和6min,最后用無菌水沖洗3~5遍,每遍2min (移液槍操作)。
[0020]進一步地，本發(fā)明在所述步驟3)中，種子培養(yǎng)2~4周后陸續(xù)萌發(fā)，萌發(fā)后的生石花在誘導培養(yǎng)基上培養(yǎng)2~3周后有愈傷組織形成，挑取生長狀態(tài)較好的愈傷組織至于分化培養(yǎng)基上培養(yǎng)，約4周后愈傷組織開始分化不定芽。
[0021]進一步地，本發(fā)明在所述步驟5)中，不定芽分成單株后轉至基本培養(yǎng)基上進行壯苗培養(yǎng)(剝去皮蛻)，培養(yǎng)2~4周后成為具有根系的壯苗。 [0022]進一步地，本發(fā)明在所述步驟3)、4)、5)中，所述的培養(yǎng)條件是，培養(yǎng)溫度為23±2°C、光照強度為60~100μπιοΙ.m2.s'光照時間為10~16小時/天；
[0023]本發(fā)明的有益效果是:利用植物組織培養(yǎng)技術對生石花進行了播種及再生快繁培養(yǎng)，能夠在較短時間內獲得大量遺傳性狀一致的優(yōu)質壯苗，克服了常規(guī)繁殖方法慢的缺點，對其規(guī)?；a和種質資源保存都具有積極意義，同時本技術也為其遺傳轉化體系的建立奠定了堅實的實驗基礎。
【具體實施方式】
[0024]下面通過【具體實施方式】對本發(fā)明作進一步闡述，實施例將幫助更好地理解本發(fā)明，但本發(fā)明并不僅僅局限于下述實施例。
[0025]實施例1
[0026]本發(fā)明提供了一種生石花無菌播種及再生體系建立的方法，其步驟為:
[0027]I)、培養(yǎng)基的配制
[0028](I)基本培養(yǎng)基:MS培養(yǎng)基，其中蔗糖30g/L，瓊脂7.5g/L，pH=5.8;
[0029](2)誘導培養(yǎng)基:MS+6-BA0.1 ~0.5mg/L+NAA0.05 ~0.lmg/L;
[0030](3)分化培養(yǎng)基:MS+6_BA0 ~0.05mg/L ；
[0031](4)增殖培養(yǎng)基:MS+6-BA0.05 ~0.3mg/L+NAA0.05 ~0.lmg/L;
[0032]2)、種子的消毒及接種
[0033]以生石花的種子為外植體材料，將其置于1.5ml或2ml的PE離心管中進行消毒處理，先用洗潔精溶液浸泡0.5h后再用自來水清洗，然后依次在體積比為70%的酒精溶液和有效氯濃度為1%的次氯酸鈉溶液中分別浸泡30s和6min,最后用無菌水沖洗3~5遍,每遍2min (移液槍操作)。
[0034]3 )、愈傷組織的誘導及分化
[0035]種子培養(yǎng)2~4周后陸續(xù)萌發(fā)，萌發(fā)后的生石花在誘導培養(yǎng)基上培養(yǎng)2~3周后有愈傷組織形成，挑取生長狀態(tài)較好的愈傷組織至于分化培養(yǎng)基上培養(yǎng)，約4周后愈傷組織開始分化不定芽；培養(yǎng)溫度為23±2°C、光照強度為60~ΙΟΟμm.m_2.s'光照時間為10~16小時/天；
[0036]4)、不定芽的增殖
[0037]將生石花的不定芽叢接種于增殖培養(yǎng)基上進行增殖培養(yǎng)；培養(yǎng)溫度為23±2°C、光照強度為60~100 μ mol2.s'光照時間為10~16小時/天；[0038]5)、壯苗培養(yǎng)
[0039]將增殖芽叢在無菌條件下切割成單株后轉接到基本培養(yǎng)基上進行壯苗培養(yǎng)(適時剝去皮蛻)，培養(yǎng)30~50天后成為具有根系的壯苗；培養(yǎng)溫度為23±2°C、光照強度為60~100 μ mo I.m 2.s \光照時間為10~16小時/天。
[0040]實施例2
[0041]本發(fā)明提供了一種生石花無菌播種及再生體系建立的方法，其步驟為:
[0042]I)、培養(yǎng)基的配制
[0043](I)基本培養(yǎng)基:MS培養(yǎng)基，其中蔗糖20~30g/L，瓊脂5~9g/L，pH=5.8;
[0044](2)誘導培養(yǎng)基:MS+6-BA0.2mg/L+NAA0.05mg/L;
[0045](3 )分化培養(yǎng)基:MS+6-BA0.05mg/L ；
[0046](4 )增殖培養(yǎng)基:MS+6-BA0.lmg/L+NAA0.05mg/L;
[0047]2)、種子的消毒及接種
[0048]以生石花的種子為外植體材料，將其置于1.5ml或2ml的PE離心管中進行消毒處理，先用洗潔精溶液浸泡0.5h后再用自來水清洗，然后依次在體積比為70%的酒精溶液和有效氯濃度為1%的次氯酸鈉溶液中分別浸泡30s和6min,最后用無菌水沖洗3~5遍,每遍2min (移液槍操作)。
[0049]3)、愈傷組織的誘導及分化
[0050]種子培養(yǎng)2~4周后陸續(xù)萌發(fā)，萌發(fā)后的生石花在誘導培養(yǎng)基上培養(yǎng)2~3周后有愈傷組織形成，挑取生長狀態(tài)較好的愈傷組織至于分化培養(yǎng)基上培養(yǎng)，約4周后愈傷組織開始分化不定芽；培養(yǎng)溫度為23±2°C、光照強度為60~ΙΟΟμπιοΙ.m_2.s'光照時間為10~16小時/天；
[0051]4)、不定芽的增殖
[0052]將生石花的不定芽叢接種于增殖培養(yǎng)基上進行增殖培養(yǎng)；培養(yǎng)溫度為23±2°C、光照強度為60~100 μ mo I.M-2.s'光照時間為10~16小時/天；
[0053]5)、壯苗培養(yǎng)
[0054]將增殖芽叢在無菌條件下切割成單株后轉接到基本培養(yǎng)基上進行壯苗培養(yǎng)(適時剝去皮蛻)，培養(yǎng)30~50天后成為具有根系的壯苗；培養(yǎng)溫度為23±2°C、光照強度為60~100 μ mo I.m 2.s \光照時間為10~16小時/天。
[0055]最后需要說明的是，除本實施例外，本發(fā)明還可以有其它實施方式和變形，以上列舉的僅是本發(fā)明的具體實施例子。凡本領域的普通技術人員能從本發(fā)明公開的內容直接導出或聯(lián)想到的所有變形，均應認為是本發(fā)明的保護范圍。
【權利要求】
1.一種生石花無菌播種及再生體系建立的方法，其特征在于:該方法包括如下步驟: 1)、培養(yǎng)基的配制: (1)基本培養(yǎng)基=MS或1/2MS，其中蔗糖20~30g/L,瓊脂5~9g/L，pH=5.8; (2)誘導培養(yǎng)基:MS+6-BA0.1 ~0.5mg/L+NAA0.05 ~0.lmg/L; (3)分化培養(yǎng)基:MS+6-BA0~0.05mg/L ； (4)增殖培養(yǎng)基:MS+6-BA0.05 ~0.3mg/L+NAA0.05 ~0.lmg/L; 2)種子的消毒及接種:以生石花的種子為外植體材料，將消毒處理后的種子在無菌條件下接種于誘導培養(yǎng)基上培養(yǎng)； 3)愈傷組織的誘導及分化:將步驟2)種子萌發(fā)后誘導愈傷組織形成并進行不定芽的分化培養(yǎng)； 4)不定芽的增殖:將步驟3)的不定芽叢接種于增殖培養(yǎng)基上進行增殖培養(yǎng)； 5)壯苗培養(yǎng):將步驟4)不定芽分成單株后轉至基本培養(yǎng)基上進行壯苗培養(yǎng)。
2.根據(jù)權利要求1所述的生石花無菌播種及再生體系建立的方法，其特征在于:在所述步驟I)中，所述的培養(yǎng)基包括基本培養(yǎng)基和組培各階段培養(yǎng)基的組分具體為: (1)基本培 養(yǎng)基:MS培養(yǎng)基，其中蔗糖20~30g/L,瓊脂5~9g/L，pH=5.8; (2)誘導培養(yǎng)基:MS+6-BA0.1 ~0.5mg/L+NAA0.05 ~0.lmg/L; (3)分化培養(yǎng)基:MS+6-BA0~0.05mg/L ； (4)增殖培養(yǎng)基:MS+6-BA0.05 ~0.3mg/L+NAA0.05 ~0.lmg/L。
3.根據(jù)權利要求1所述的生石花無菌播種及再生體系建立的方法，其特征在于:在所述步驟2)中，以生石花的種子為外植體材料，將其置于1.5ml或2ml的PE離心管中進行消毒處理，先用洗潔精溶液浸泡0.5h后再用自來水清洗，然后依次在體積比為70%的酒精溶液和有效氯濃度為1%的次氯酸鈉溶液中分別浸泡30s和6min，最后用無菌水沖洗3~5遍，每遍2min。
4.根據(jù)權利要求1所述的生石花無菌播種及再生體系建立的方法，其特征在于:在所述步驟3)中，種子培養(yǎng)2~4周后陸續(xù)萌發(fā)，萌發(fā)后的生石花在誘導培養(yǎng)基上培養(yǎng)2~3周后有愈傷組織形成，挑取生長狀態(tài)較好的愈傷組織至于分化培養(yǎng)基上培養(yǎng)，4周后愈傷組織開始分化不定芽。
5.根據(jù)權利要求1所述的生石花無菌播種及再生體系建立的方法，其特征在于:在所述步驟5)中，不定芽分成單株后轉至基本培養(yǎng)基上進行壯苗培養(yǎng)，培養(yǎng)2~4周后成為具有根系的壯苗。
6.根據(jù)權利要求1所述的生石花無菌播種及再生體系建立的方法，其特征在于:在所述步驟3)、4)、5)中，所述的培養(yǎng)條件是，培養(yǎng)溫度為23±2°C、光照強度為60~·100 μ mo 1.m 2.s \光照時間為10~16小時/天。
【文檔編號】A01H4/00GK103583357SQ201310465211
【公開日】2014年2月19日 申請日期:2013年10月8日 優(yōu)先權日:2013年10月8日
【發(fā)明者】牟豪杰, 王燕, 陳劍平, 汪一婷, 呂永平, 陳志
申請人:浙江省農業(yè)科學院