一種生產(chǎn)可變色光誘導(dǎo)熒光觀(guān)賞魚(yú)的方法【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明利用能在全身普遍啟動(dòng)表達(dá)的啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)可變色光誘導(dǎo)熒光的表達(dá)，從而提供了一種能夠全身表達(dá)可變色光誘導(dǎo)熒光觀(guān)賞魚(yú)的方法及其由此獲得的可變色光誘導(dǎo)熒光觀(guān)賞魚(yú)，并進(jìn)一步提供了一種針對(duì)體表色素較多的魚(yú)種進(jìn)行基因改造，將其轉(zhuǎn)化為一種能夠全身表達(dá)可變色光誘導(dǎo)熒光的觀(guān)賞魚(yú)的方法以及由此獲得的產(chǎn)品，同時(shí)為了保證生物安全性，對(duì)該觀(guān)賞魚(yú)實(shí)現(xiàn)了絕育。本發(fā)明同時(shí)還提供了針對(duì)其他水生生物，如蝦、水母構(gòu)建全身發(fā)可變色光誘導(dǎo)熒光的觀(guān)賞品種的方法。因此，本發(fā)明實(shí)現(xiàn)了通過(guò)人工改變激發(fā)波長(zhǎng)，讓魚(yú)在數(shù)秒內(nèi)從一個(gè)顏色變成另一個(gè)顏色，產(chǎn)生有趣的觀(guān)賞效果，擴(kuò)展傳統(tǒng)的觀(guān)賞魚(yú)市場(chǎng)的格局?！緦?zhuān)利說(shuō)明】一種生產(chǎn)可變色光誘導(dǎo)熒光觀(guān)賞魚(yú)的方法【
技術(shù)領(lǐng)域：
】[0001]本發(fā)明涉及生產(chǎn)熒光觀(guān)賞魚(yú)的方法，特別是涉及生產(chǎn)可變色光誘導(dǎo)熒光觀(guān)賞魚(yú)的方法。【
背景技術(shù)：
】[0002]觀(guān)賞魚(yú)是一個(gè)有全球市場(chǎng)的魚(yú)類(lèi)產(chǎn)業(yè)，而熒光魚(yú)由于可以獲得區(qū)別于傳統(tǒng)魚(yú)的引人注目的色彩、尤其在光線(xiàn)較暗的情況下有奇特的裝飾效果，因此極大的改變了觀(guān)賞魚(yú)市場(chǎng)的格局。目前利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)可以在短時(shí)間內(nèi)獲得具有特定性狀的魚(yú)，而不需要通過(guò)傳統(tǒng)的雜交技術(shù)來(lái)緩慢改變魚(yú)的特性。利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)獲得熒光觀(guān)賞魚(yú)已經(jīng)取得了巨大的商業(yè)價(jià)值。[0003]現(xiàn)有技術(shù)中已存在多種將外源基因置入魚(yú)中的技術(shù)，包括微注射、病毒介導(dǎo)的基因整合基因重組、基因敲除、以及轉(zhuǎn)座子等技術(shù)。目前，已有一些利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)構(gòu)建熒光觀(guān)賞魚(yú)的報(bào)道，如臺(tái)灣邰港公司將熒光蛋白連接啟動(dòng)子轉(zhuǎn)入魚(yú)內(nèi)基因組中，獲得了多個(gè)觀(guān)賞魚(yú)種；新加坡國(guó)立大學(xué)將四種特異性的啟動(dòng)子連接單一熒光，在熒光魚(yú)的特定部位表達(dá)突光基團(tuán)。美國(guó)YorktownTechnology公司也通過(guò)特異性啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)藍(lán)色蛋白在魚(yú)體內(nèi)的表達(dá)。[0004]熒光觀(guān)賞魚(yú)的現(xiàn)有技術(shù)(例如CN1590548A、CN1647625A、US7135613、US8232450、US7700825等)均存在以下弊端。首先，現(xiàn)有的熒光觀(guān)賞魚(yú)構(gòu)建技術(shù)中實(shí)現(xiàn)的均是熒光蛋白的組織特異性表達(dá)，即僅在魚(yú)的特定組織出現(xiàn)熒光，由此構(gòu)建的熒光魚(yú)從視覺(jué)角度缺乏一定的觀(guān)賞性。其次，實(shí)現(xiàn)的均是單色熒光的表達(dá)，不能在外界的刺激下改變顏色，由此獲得的熒光觀(guān)賞魚(yú)缺乏一定的互動(dòng)性或趣味性。此外，一些魚(yú)體自身體表色素沉淀較多，導(dǎo)致魚(yú)體表面透明度降低，這不但屏蔽了激發(fā)光對(duì)熒光基團(tuán)的激發(fā)，導(dǎo)致熒光基團(tuán)發(fā)光效率低，而且遮阻了熒光基團(tuán)的發(fā)射光到達(dá)體外，從而進(jìn)一步降低了觀(guān)賞性。上述專(zhuān)利為了在一定程度上挽救這個(gè)缺點(diǎn)，不得不用很強(qiáng)的啟動(dòng)子來(lái)驅(qū)動(dòng)熒光基團(tuán)的表達(dá)，但代價(jià)卻是熒光基團(tuán)的光毒性造成魚(yú)的健康受到影響，使得魚(yú)的壽命大大縮短。[0005]此外，現(xiàn)有技術(shù)中所獲得的熒光魚(yú)均未實(shí)現(xiàn)絕育化，這樣的轉(zhuǎn)基因魚(yú)種一旦進(jìn)入自然環(huán)境，可能對(duì)自然界物種造成不可預(yù)知的潛在危害?！?br/>發(fā)明內(nèi)容】[0006]本發(fā)明的目的是要克服現(xiàn)有技術(shù)中的至少一個(gè)缺陷，提供一種生產(chǎn)熒光蛋白能夠全身表達(dá)并且在光刺激下熒光顏色可變的觀(guān)賞魚(yú)的生產(chǎn)方法。在本發(fā)明中，將這種新的魚(yú)種稱(chēng)為“可變色光誘導(dǎo)熒光觀(guān)賞魚(yú)”。[0007]進(jìn)一步地，本發(fā)明還提供了生產(chǎn)可變色光誘導(dǎo)熒光觀(guān)賞魚(yú)的純合體的方法，生產(chǎn)可變色光誘導(dǎo)熒光觀(guān)賞魚(yú)的絕育體的方法以及針對(duì)體表色素較多的魚(yú)種進(jìn)行基因改造使其適于用來(lái)生產(chǎn)可變色光誘導(dǎo)熒光觀(guān)賞魚(yú)或使得所生產(chǎn)的可變色光誘導(dǎo)熒光觀(guān)賞魚(yú)能夠更佳地全身表達(dá)可變色光誘導(dǎo)熒光。[0008]本發(fā)明揭示的原理還可適用于其他水生生物(例如蝦、水母等)，構(gòu)建全身發(fā)可變色光誘導(dǎo)熒光的其他觀(guān)賞性水生生物。[0009]本發(fā)明的生產(chǎn)可變色光誘導(dǎo)熒光觀(guān)賞魚(yú)的方法，包括以下步驟:[0010]步驟A:構(gòu)建可變色光誘導(dǎo)熒光蛋白的重組轉(zhuǎn)座載體，其中所述可變色光誘導(dǎo)熒光蛋白選自PA-GFP、PA-RFP-1、PS-CFP2、Kaede,KiKGR,MonomericEos、Dendra-2,FP595、Dronpa、Padron及其衍生物，優(yōu)選為Kaede；[0011]步驟B:將重組轉(zhuǎn)座載體和Tol2mRNA共同注射入待處理魚(yú)種的單細(xì)胞期受精卵中，實(shí)現(xiàn)目的基因整合入基因組；[0012]步驟C:篩選并鑒定出能夠穩(wěn)定表達(dá)可變色光誘導(dǎo)熒光蛋白的魚(yú)種，以獲得可變色光誘導(dǎo)熒光觀(guān)賞魚(yú)。[0013]進(jìn)一步地，所述重組轉(zhuǎn)座載體中的啟動(dòng)子為能在魚(yú)全發(fā)育期以及全身穩(wěn)定驅(qū)動(dòng)表達(dá)的啟動(dòng)子，優(yōu)選為Ubiquitin啟動(dòng)子。[0014]進(jìn)一步地,所述重組轉(zhuǎn)座載體為Ubiquitin啟動(dòng)子-Kaede-miniTol2載體,其序列結(jié)構(gòu)如SEQIDNO:1所示。[0015]進(jìn)一步地，在所述步驟C之后還包括如下獲得所述可變色光誘導(dǎo)熒光魚(yú)的純合體F3的步驟:[0016]將所述步驟C中獲得的所述可變色光誘導(dǎo)熒光觀(guān)賞魚(yú)與野生型魚(yú)雜交，產(chǎn)生所述可變色光誘導(dǎo)熒光觀(guān)賞魚(yú)的雜合體F1，從所述雜合體Fl中篩選出全身表達(dá)可變色光誘導(dǎo)熒光蛋白的雜合體Fl；[0017]選取單只全身表達(dá)可變色光誘導(dǎo)熒光蛋白的雜合體Fl與野生型魚(yú)雜交，產(chǎn)生所述可變色光誘導(dǎo)熒光觀(guān)賞魚(yú)的雜合體F2，從所述雜合體F2中篩選出全身表達(dá)可變色光誘導(dǎo)熒光蛋白的雌魚(yú)和雄魚(yú)；[0018]將篩選出的所述雌魚(yú)和所述雄魚(yú)進(jìn)行交配，得到所述可變色光誘導(dǎo)熒光觀(guān)賞魚(yú)的純合體F3從所述純合體F3中篩選出含有可變色光誘導(dǎo)熒光蛋白的純合可變色光誘導(dǎo)熒光觀(guān)賞魚(yú)。[0019]進(jìn)一步地，本發(fā)明的生產(chǎn)可變色光誘導(dǎo)熒光觀(guān)賞魚(yú)的方法還包括如下絕育步驟:[0020]通過(guò)溫度物理絕育處理法、靜水壓物理絕育處理法、電休克物理絕育處理法、細(xì)胞松弛素B化學(xué)絕育處理法、秋水仙素化學(xué)絕育處理法、聚乙二醇化學(xué)絕育處理法、或6-二甲基氨基嘌呤化學(xué)絕育處理法對(duì)所述純合可變色光誘導(dǎo)熒光觀(guān)賞魚(yú)的單細(xì)胞期受精卵進(jìn)行處理，以獲得所述純合可變色光誘導(dǎo)熒光觀(guān)賞魚(yú)的四倍體；[0021]將所述純合可變色光誘導(dǎo)熒光觀(guān)賞魚(yú)的二倍體和所述純合可變色光誘導(dǎo)熒光觀(guān)賞魚(yú)的四倍體進(jìn)行雜交，以獲得所述純合可變色光誘導(dǎo)熒光觀(guān)賞魚(yú)的絕育的三倍體。[0022]進(jìn)一步地，所述溫度物理絕育處理法包括:將所述純合可變色光誘導(dǎo)熒光觀(guān)賞魚(yú)的單細(xì)胞期受精卵置于42°C的養(yǎng)魚(yú)水中，熱激10分鐘。[0023]進(jìn)一步地，本發(fā)明的生產(chǎn)可變色光誘導(dǎo)熒光觀(guān)賞魚(yú)的方法還包括如下色素基因敲除步驟之一:[0024]在所述步驟A之前，通過(guò)基因敲除技術(shù)對(duì)所述待處理魚(yú)種進(jìn)行處理，敲除其中的魚(yú)體色素基因；或者[0025]在獲得所述可變色光誘導(dǎo)熒光觀(guān)賞魚(yú)之后，通過(guò)基因敲除技術(shù)對(duì)所述可變色光誘導(dǎo)熒光觀(guān)賞魚(yú)進(jìn)行處理，敲除其中的魚(yú)體色素基因。[0026]進(jìn)一步地，所述待處理魚(yú)種為斑馬魚(yú)，被敲除的所述魚(yú)體色素基因是斑馬魚(yú)golden基因。[0027]進(jìn)一步地，所述色素基因敲除步驟包括:[0028]在所述斑馬魚(yú)或所述可變色光誘導(dǎo)熒光觀(guān)賞魚(yú)的golden基因組外顯子區(qū)域中，尋找NGG的特征序列，其中緊鄰NGG之前20bp序列即為候選的目標(biāo)序列；[0029]將所述目標(biāo)序列構(gòu)建入pT7gRNA載體；[0030]將含有所述目標(biāo)序列的pT7gRNA載體與Cas9mRNA共同注射入所述斑馬魚(yú)的單細(xì)胞期受精卵或所述可變色光誘導(dǎo)熒光觀(guān)賞魚(yú)的單細(xì)胞期受精卵中，并將其培養(yǎng)成幼魚(yú)；[0031]根據(jù)所述幼魚(yú)的魚(yú)體顏色的深淺篩選出色素基因敲除成功的幼魚(yú)作為之后繁殖的種魚(yú)，以制備出敲除了魚(yú)體色素基因的待處理魚(yú)種或生產(chǎn)出敲除了魚(yú)體色素基因的可變色光誘導(dǎo)熒光觀(guān)賞魚(yú)。[0032]本發(fā)明利用能在全身普遍表達(dá)的啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)可變色光誘導(dǎo)熒光蛋白的表達(dá)，實(shí)現(xiàn)了通過(guò)人工改變激發(fā)波長(zhǎng)，讓魚(yú)在數(shù)秒內(nèi)從一個(gè)顏色變成另一個(gè)顏色的有趣的觀(guān)賞效果；或者還可以讓魚(yú)體在某一種特定激發(fā)波長(zhǎng)下，顏色還可以變回原來(lái)的顏色。這種加入了人為控制元素的熒光魚(yú)能夠更有效地裝點(diǎn)所在的環(huán)境，增加人魚(yú)互動(dòng)，提高趣味性，極大地?cái)U(kuò)展了觀(guān)賞魚(yú)市場(chǎng)的格局。[0033]根據(jù)下文結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明具體實(shí)施例的詳細(xì)描述，本領(lǐng)域技術(shù)人員將會(huì)更加明了本發(fā)明的上述以及其他目的、優(yōu)點(diǎn)和特征。【專(zhuān)利附圖】【附圖說(shuō)明】[0034]后文將參照附圖以示例性而非限制性的方式詳細(xì)描述本發(fā)明的一些具體實(shí)施例，附圖中:[0035]圖1是在根據(jù)本發(fā)明一個(gè)實(shí)施例的生產(chǎn)可變色光誘導(dǎo)熒光觀(guān)賞魚(yú)的方法中構(gòu)建的Ubiquitin啟動(dòng)子-Kaede-miniTol2載體的結(jié)構(gòu)圖。[0036]圖2是根據(jù)本發(fā)明一個(gè)實(shí)施例生產(chǎn)的可變色光誘導(dǎo)熒光觀(guān)賞魚(yú)的嵌合體H)的PCR驗(yàn)證圖，其中水平箭頭所標(biāo)示的條帶在600bp左右，此為目的條帶；豎直箭頭所標(biāo)示的是沒(méi)有條帶的組，這樣的組是本發(fā)明所不期望的。[0037]圖3A和圖3B是根據(jù)本發(fā)明一個(gè)實(shí)施例生產(chǎn)的可變色光誘導(dǎo)熒光觀(guān)賞魚(yú)在激發(fā)光處理前后的熒光圖，圖中例示出的可變色光誘導(dǎo)熒光觀(guān)賞魚(yú)是同一條純合子斑馬魚(yú)，其中圖3A是沒(méi)有發(fā)生光轉(zhuǎn)換時(shí)，斑馬魚(yú)在450nm-550nm的激發(fā)光下的顏色，釋放出綠色的發(fā)射光；圖3B是用390nm左右的光照射斑馬魚(yú)Imin后，斑馬魚(yú)體內(nèi)的Kaede蛋白發(fā)生構(gòu)像變化,在550nm-600nm的激發(fā)光照射下,釋放出橘黃色的發(fā)射光。[0038]圖4是利用Realtime-PCR技術(shù)(實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù))鑒定純合子和雜合子的結(jié)果圖。A組的兩條線(xiàn)是雜合子和純合子內(nèi)參GAPDH的曲線(xiàn)，B組的三條線(xiàn)是實(shí)施例1步驟4中獲得的純合子Kaede的線(xiàn)，C組的三條線(xiàn)為實(shí)施例1步驟3中獲得的雜合子Kaede曲線(xiàn)。A組的兩條曲線(xiàn)起來(lái)的循環(huán)數(shù)都在10.5左右，說(shuō)明內(nèi)參GAPDH的表達(dá)量一致。B組比C組早起來(lái)一個(gè)循環(huán)左右，這說(shuō)明B組Kaede的表達(dá)量高一倍。通過(guò)觀(guān)察曲線(xiàn)起來(lái)數(shù)值的高低，可以判斷純合子B和雜合子C。[0039]圖5A、圖5B和圖5C是通過(guò)流式細(xì)胞儀(FACS)檢測(cè)魚(yú)的紅細(xì)胞相對(duì)DNA含量來(lái)鑒定和區(qū)分多倍體魚(yú)的鑒定結(jié)果圖，其中圖5A是二倍體魚(yú)的鑒定結(jié)果圖，B圖是三倍體魚(yú)的鑒定結(jié)果圖，C圖是四倍體魚(yú)的鑒定結(jié)果圖。[0040]圖6是golden基因敲除的分子生物學(xué)驗(yàn)證圖。M表示標(biāo)記(marker),Gl和G2分別是色素敲除的純合子和雜合子魚(yú)的部分組織提出的基因組DNA，經(jīng)過(guò)基因型鑒定PCR，退火并T7E1酶處理后的產(chǎn)物。NC是野生型斑馬魚(yú)的魚(yú)的部分組織提出的基因組DNA，經(jīng)過(guò)基因型鑒定PCR，退火并T7E1酶處理后的產(chǎn)物。Gl-Gl表示Gl自己和自己退火，Gl-NC是純合子和野生型退火。由于純合子golden靶標(biāo)區(qū)域被切割，所以Gl-NC退火后，可以形成錯(cuò)配，受到專(zhuān)門(mén)切割雙鏈錯(cuò)配的酶T7E1切割，形成橫向箭頭所指部分的兩條帶。而純合子本身不會(huì)形成錯(cuò)配，因此箭頭所指區(qū)域沒(méi)有帶出現(xiàn)。G2-G2表示自己和自己退火，G2-NC是雜合子和野生型退火。由于雜合子本身既有被切割的golden靶標(biāo)區(qū)域，也有未切割的靶標(biāo)區(qū)域，所以可以形成錯(cuò)配，受到專(zhuān)門(mén)切割雙鏈錯(cuò)配的酶T7E1切割，形成橫向箭頭所指部分的兩條帶。同理，G2-NC也出現(xiàn)切割的兩條帶。[0041]圖7A和圖7B是在本發(fā)明的實(shí)施例2中進(jìn)行色素基因敲除步驟前后后的魚(yú)體顏色的比較圖，其中圖7A示出的是正常的斑馬魚(yú)，圖7B示出的是敲除了golden基因后的斑馬魚(yú)。圖7B所示斑馬魚(yú)的體色明顯變淺，體表相對(duì)而言較為透明?！揪唧w實(shí)施方式】[0042]為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點(diǎn)更加清楚，下面將首先描述本發(fā)明中采用的主要技術(shù)，然后結(jié)合附圖和具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)描述。[0043]一.可變色光誘導(dǎo)熒光蛋白的選擇[0044]區(qū)別于普通的熒光蛋白(例如GFP，eGFP,RFP,DsRed等)，可變色光誘導(dǎo)熒光蛋白在特定激發(fā)波長(zhǎng)的刺激下，可以更改自身的顏色。目前已有的可變色光誘導(dǎo)熒光蛋白分為以下三類(lèi):不可逆光激活突光蛋白(Irreversiblephotoactivatablefluorescentproteins),光變換突光蛋白(Photoshiftablefluorescentproteins)和可逆光激活突光蛋白(Reversiblephotoactivatablefluorescentproteins)。這三類(lèi)光誘導(dǎo)變色蛋白的代表分別是PA-GFP、Kaede和Dronpa。[0045]在本發(fā)明的一些實(shí)施例中，主要采用Kaede可變色光誘導(dǎo)熒光蛋白來(lái)實(shí)現(xiàn)可變色光誘導(dǎo)突光觀(guān)賞魚(yú)的構(gòu)建。Kaede是一種從腦珊瑚(Trachyphylliageoffroyi)中克隆出來(lái)的、能夠在紫外線(xiàn)350-400nm的激發(fā)下快速?gòu)木G色變成橘黃色的熒光蛋白。Kaede所包含的His-Tyr-Gly三肽是變色的核心區(qū)域。在紫外線(xiàn)的照射下，綠色熒光蛋白會(huì)以一種漸變的方式變成橘黃色熒光蛋白，橘黃色/綠色熒光強(qiáng)度比率增強(qiáng)2000倍以上。被紫外激發(fā)為橘黃色的熒光蛋白可以在正常的細(xì)胞有氧狀態(tài)下穩(wěn)定存在。同時(shí)，實(shí)驗(yàn)表明這種蛋白可以自由分布在整個(gè)細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，因此其最初是被用來(lái)標(biāo)記細(xì)胞。[0046]此外，其他一些光誘導(dǎo)熒光蛋白，例如PA-GFP、Dronpa，也可作為可變色光誘導(dǎo)熒光蛋白應(yīng)用于本發(fā)明的具體實(shí)施例中。[0047]二.質(zhì)粒構(gòu)建相關(guān)元件的選擇[0048]本發(fā)明中實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因的技術(shù)包括病毒侵染法，Tol2技術(shù)和同源重組技術(shù)。上述轉(zhuǎn)基因技術(shù)均可應(yīng)用于本發(fā)明的具體實(shí)施例中。在本發(fā)明的實(shí)施例中，是將可變色光誘導(dǎo)熒光蛋白加入轉(zhuǎn)座質(zhì)粒，從而將特定的基因插入待處理魚(yú)種例如斑馬魚(yú)的基因組中，實(shí)現(xiàn)穩(wěn)定表達(dá)。[0049]此外，本發(fā)明所選取的啟動(dòng)子是可以在魚(yú)種以及其他水生物品種的全發(fā)育時(shí)期、全身穩(wěn)定普遍啟動(dòng)表達(dá)的啟動(dòng)子，由此來(lái)驅(qū)動(dòng)可變色光誘導(dǎo)熒光蛋白在宿主中的表達(dá)，本發(fā)明所用的啟動(dòng)子被特別地優(yōu)選為Ubiquitin啟動(dòng)子。將啟動(dòng)子和后續(xù)的可變色光誘導(dǎo)熒光蛋白編碼基因連接在一起，整合入魚(yú)及其他水生物基因組中。[0050]三.基因整合的方法及鑒定[0051]把不含內(nèi)毒素的大提后的質(zhì)粒，通過(guò)顯微注射打入待處理魚(yú)種的受精卵中，等待這些受精卵發(fā)育成幼魚(yú)。魚(yú)體透明，目的序列整合入基因組的魚(yú)，會(huì)顯示特定的變色熒光。將這些魚(yú)收集并培育養(yǎng)大，得到可變色光誘導(dǎo)熒光觀(guān)賞魚(yú)(更具體地，此時(shí)得到的是可變色光誘導(dǎo)熒光觀(guān)賞魚(yú)的嵌合體H))。[0052]四.獲得穩(wěn)定表達(dá)的子代[0053]選擇生殖細(xì)胞中表達(dá)熒光的嵌合體H)和野生型進(jìn)行雜交，后代中如果仍然有可變色光誘導(dǎo)熒光的個(gè)體，屬于雜合體Fl。將這些發(fā)熒光的雜合體Fl的單個(gè)個(gè)體和野生型再次進(jìn)行雜交，它們的后代仍然有熒光的是雜合體F2。由于雜合體F2來(lái)源于同一個(gè)父母(雜合體Fl和野生型)，因此插入的熒光片段在基因組的位置是一樣的。將雜合體F2內(nèi)的雌魚(yú)和雄魚(yú)雜交，在雜交獲得的后代中，有1/4概率得到可變色光誘導(dǎo)熒光觀(guān)賞魚(yú)的純合體F3。純合體由于帶有兩倍于雜合體的基因，因此熒光亮度高于后者，可以通過(guò)熒光強(qiáng)度的辦法來(lái)區(qū)分開(kāi)。為了進(jìn)一步驗(yàn)證，在不傷害魚(yú)的生存能力前提下，將候選的熒光魚(yú)剪去部分組織，通過(guò)Realtime-PCR技術(shù)進(jìn)行鑒定，可將純合體與各代雜合體及嵌合體區(qū)分開(kāi)。[0054]五.種魚(yú)的多倍體化進(jìn)行絕育[0055]對(duì)可變色光誘導(dǎo)熒光魚(yú)純合體的單細(xì)胞期受精卵進(jìn)行42°C熱激處理10分鐘，誘導(dǎo)產(chǎn)生多倍體(其中包括三倍體和四倍體)的可變色光誘導(dǎo)熒光魚(yú)純合體。通過(guò)將二倍體的可變色光誘導(dǎo)熒光魚(yú)純合體和四倍體的可變色光誘導(dǎo)熒光魚(yú)純合體雜交產(chǎn)生三倍體的可變色光誘導(dǎo)熒光魚(yú)純合體，由于三倍體的可變色光誘導(dǎo)熒光魚(yú)純合體是不可育的。所以這種三倍體的可變色光誘導(dǎo)熒光魚(yú)純合體不會(huì)和野生魚(yú)種進(jìn)行生殖，不會(huì)對(duì)自然界造成影響。[0056]優(yōu)選地，通過(guò)將生產(chǎn)出的可變色光誘導(dǎo)熒光魚(yú)成魚(yú)的尾巴減掉一些組織，從中提取相應(yīng)基因，然后通過(guò)流式細(xì)胞儀(FACS)檢測(cè)相對(duì)DNA含量，檢測(cè)該基因的表達(dá)量，可以區(qū)分開(kāi)二倍體、三倍體和四倍體。[0057]保存四倍體的純合體種魚(yú)，將四倍體的純合體種魚(yú)和普通的魚(yú)雜交產(chǎn)生三倍體后代。由于三倍體無(wú)法和二倍體產(chǎn)生可育后代，由此獲得的三倍體可變色光誘導(dǎo)熒光觀(guān)賞魚(yú)是不可育的，不會(huì)對(duì)自然界產(chǎn)生物種方面的危害。[0058]六.色素的清除[0059]一些魚(yú)種體表色素沉淀比較多，如前所述，熒光效果大打折扣。因此，需要對(duì)這些魚(yú)體進(jìn)行改造。本發(fā)明采用基因敲除技術(shù)，優(yōu)選Cas9系統(tǒng)，通過(guò)對(duì)特定序列的色素基因——如斑馬魚(yú)中的golden基因，nacre基因和roy基因-進(jìn)行切割敲除，從而可以達(dá)到去除魚(yú)體色素的目的。由于本技術(shù)很強(qiáng)的普遍適用性和應(yīng)用價(jià)值，因此理論上，它可以廣泛適用于任何一種體表有色素沉積不透明影響熒光效果的水生生物。[0060]具體地，在本發(fā)明中，可以在獲得在可變色光誘導(dǎo)熒光觀(guān)賞魚(yú)之前，通過(guò)基因敲除技術(shù)對(duì)待處理魚(yú)種進(jìn)行處理，敲除其中的魚(yú)體色素基因；或者也可以在獲得所述可變色光誘導(dǎo)熒光觀(guān)賞魚(yú)之后，通過(guò)基因敲除技術(shù)對(duì)所述可變色光誘導(dǎo)熒光觀(guān)賞魚(yú)進(jìn)行處理，敲除其中的魚(yú)體色素基因。[0061]七.魚(yú)種的選擇[0062]本發(fā)明優(yōu)選采用Tol2轉(zhuǎn)座技術(shù)。根據(jù)目前的文獻(xiàn)報(bào)道和實(shí)驗(yàn)證據(jù)，該轉(zhuǎn)座技術(shù)可以廣泛地適用于魚(yú)、兩棲類(lèi)動(dòng)物以及雞等多種動(dòng)物，甚至在哺乳動(dòng)物例如老鼠的細(xì)胞中也具有很高的轉(zhuǎn)座效率。因此，本發(fā)明可以廣泛地應(yīng)用在各個(gè)魚(yú)種，甚至在一些低等動(dòng)物中也有潛在的應(yīng)用價(jià)值。[0063]本發(fā)明適用于幾乎所有的魚(yú)種，包括斑馬魚(yú)、鏘魚(yú)、鯰魚(yú)、慈稠、斗魚(yú)、鯉科和加拉辛科等。慈稠包括非洲慈稠、南美慈稠、短稠、神仙魚(yú)和七彩神仙魚(yú)。斗魚(yú)包括斗魚(yú)和彩兔。It魚(yú)包括鼠魚(yú)、琵琶魚(yú)或者翼甲It(Pterygoplichthys)。加拉辛科包括燈魚(yú)和斧頭魚(yú)。鯉科包括錦鯉和金魚(yú)。鏘魚(yú)包括青鏘魚(yú)、卵生鏘魚(yú)或卵胎生鏘魚(yú)。[0064]同時(shí)，本發(fā)明還可適用于其它水生生物，包括蝦，水母，烏賊，魷魚(yú)等。蝦包括青蝦、河蝦、草蝦、小龍蝦、對(duì)蝦、明蝦、基圍蝦、琵琶蝦、龍蝦等。水母包括、缽水母綱和立方水母綱的200多種生物，也包含廣義的具水母型(鐘形或碟形)的刺胞動(dòng)物，如水螅水母、管水母(包括僧帽水母)，不屬缽水母綱的櫛水母和海樽等。[0065]實(shí)施例1可變色光誘導(dǎo)熒光觀(guān)賞魚(yú)的構(gòu)建[0066]步驟1:構(gòu)建Ubiquitin啟動(dòng)子-Kaede-miniTol2載體[0067](I)目的片段的擴(kuò)增和獲取[0068]PCR擴(kuò)增目的片段:用以下引物PCR出目的片段Kaede(52°C，30個(gè)循環(huán)):[0069]Kaede-F-Spe1:GGACTAGTATGAGTCTGATTAAAC；[0070]Kaede-R-Eag1:ATCGGCCGTTACTTGACGTTGTCC。[0071]配方如表1所示。[0072]表1[0073]【權(quán)利要求】1.一種生產(chǎn)可變色光誘導(dǎo)熒光觀(guān)賞魚(yú)的方法，包括以下步驟:步驟A:構(gòu)建可變色光誘導(dǎo)熒光蛋白的重組轉(zhuǎn)座載體，其中所述可變色光誘導(dǎo)熒光蛋白選自PA-GFP、PA-RFP-UPS-CFP2、Kaede,KiKGR,MonomericEos、Dendra-2、FP595、Dronpa、Padron及其衍生物，優(yōu)選為Kaede；步驟B:將重組轉(zhuǎn)座載體和Tol2mRNA共同注射入待處理魚(yú)種的單細(xì)胞期受精卵中，實(shí)現(xiàn)目的基因整合入基因組；步驟C:篩選并鑒定出能夠穩(wěn)定表達(dá)可變色光誘導(dǎo)熒光蛋白的魚(yú)種，以獲得可變色光誘導(dǎo)突光觀(guān)賞魚(yú)。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述重組轉(zhuǎn)座載體中的啟動(dòng)子為能在魚(yú)全發(fā)育期以及全身穩(wěn)定驅(qū)動(dòng)表達(dá)的啟動(dòng)子，優(yōu)選為Ubiquitin啟動(dòng)子。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述重組轉(zhuǎn)座載體為Ubiquitin啟動(dòng)子-KaedeniniTol2載體，其序列結(jié)構(gòu)如SEQIDNO:1所示。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，在所述步驟C之后還包括如下獲得所述可變色光誘導(dǎo)熒光魚(yú)的純合體F3的步驟:將所述步驟C中獲得的所述可變色光誘導(dǎo)熒光觀(guān)賞魚(yú)與野生型魚(yú)雜交，產(chǎn)生所述可變色光誘導(dǎo)熒光觀(guān)賞魚(yú)的雜合體F1，從所述雜合體Fl中篩選出全身表達(dá)可變色光誘導(dǎo)熒光蛋白的雜合體Fl；選取單只全身表達(dá)可變色光誘導(dǎo)熒光蛋白的雜合體Fl與野生型魚(yú)雜交，產(chǎn)生所述可變色光誘導(dǎo)熒光觀(guān)賞魚(yú)的雜合體F2，從所述雜合體F2中篩選出全身表達(dá)可變色光誘導(dǎo)熒光蛋白的雌魚(yú)和雄魚(yú)；將篩選出的所述雌魚(yú)和所述雄魚(yú)進(jìn)行交配，得到所述可變色光誘導(dǎo)熒光觀(guān)賞魚(yú)的純合體F3從所述純合體F3中篩選出含有可變色光誘導(dǎo)熒光蛋白的純合可變色光誘導(dǎo)熒光觀(guān)賞魚(yú)。5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，還包括如下絕育步驟:通過(guò)溫度物理絕育處理法、靜水壓物理絕育處理法、電休克物理絕育處理法、細(xì)胞松弛素B化學(xué)絕育處理法、秋水仙素化學(xué)絕育處理法、聚乙二醇化學(xué)絕育處理法、或6-二甲基氨基嘌呤化學(xué)絕育處理法對(duì)所述純合可變色光誘導(dǎo)熒光觀(guān)賞魚(yú)的單細(xì)胞期受精卵進(jìn)行處理，以獲得所述純合可變色光誘導(dǎo)熒光觀(guān)賞魚(yú)的四倍體；將所述純合可變色光誘導(dǎo)熒光觀(guān)賞魚(yú)的二倍體和所述純合可變色光誘導(dǎo)熒光觀(guān)賞魚(yú)的四倍體進(jìn)行雜交，以獲得所述純合可變色光誘導(dǎo)熒光觀(guān)賞魚(yú)的絕育的三倍體。6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其中所述溫度物理絕育處理法包括:將所述純合可變色光誘導(dǎo)熒光觀(guān)賞魚(yú)的單細(xì)胞期受精卵置于42°C的養(yǎng)魚(yú)水中，熱激10分鐘。7.根據(jù)權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)所述的方法，還包括如下色素基因敲除步驟之一:在所述步驟A之前，通過(guò)基因敲除技術(shù)對(duì)所述待處理魚(yú)種進(jìn)行處理，敲除其中的魚(yú)體色素基因；或者在獲得所述可變色光誘導(dǎo)熒光觀(guān)賞魚(yú)之后，通過(guò)基因敲除技術(shù)對(duì)所述可變色光誘導(dǎo)熒光觀(guān)賞魚(yú)進(jìn)行處理，敲除其中的魚(yú)體色素基因。8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其中，所述待處理魚(yú)種為斑馬魚(yú)，被敲除的所述魚(yú)體色素基因是斑馬魚(yú)golden基因。9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其中所述色素基因敲除步驟包括:在所述斑馬魚(yú)或所述可變色光誘導(dǎo)熒光觀(guān)賞魚(yú)的golden基因組外顯子區(qū)域中，尋找NGG的特征序列，其中緊鄰NGG之前20bp序列即為候選的目標(biāo)序列；將所述目標(biāo)序列構(gòu)建入pT7gRNA載體；將含有所述目標(biāo)序列的pT7gRNA載體與Cas9mRNA共同注射入所述斑馬魚(yú)的單細(xì)胞期受精卵或所述可變色光誘導(dǎo)熒光觀(guān)賞魚(yú)的單細(xì)胞期受精卵中，并將其培養(yǎng)成幼魚(yú)；根據(jù)所述幼魚(yú)的魚(yú)體顏色的深淺篩選出色素基因敲除成功的幼魚(yú)作為之后繁殖的種魚(yú)，以制備出敲除了魚(yú)體色素基因的待處理魚(yú)種或生產(chǎn)出敲除了魚(yú)體色素基因的可變色光誘導(dǎo)熒光觀(guān)賞魚(yú)?！疚臋n編號(hào)】A01K67/027GK103540611SQ201310446742【公開(kāi)日】2014年1月29日申請(qǐng)日期:2013年9月26日優(yōu)先權(quán)日:2013年9月26日【發(fā)明者】馬明,李冰峰,唐力,史文天申請(qǐng)人:馬明,李冰峰