用于診斷和治療結(jié)腸癌相關(guān)疾病的基于微小rna的方法和組合物的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供診斷和治療結(jié)腸癌的新方法和組合物。本發(fā)明還提供鑒定腫瘤形成抑制劑的方法。
【專利說(shuō)明】用于診斷和治療結(jié)腸癌相關(guān)疾病的基于微小RNA的方法和組合物
[0001]本申請(qǐng)是申請(qǐng)日為2007年7月12日、申請(qǐng)?zhí)枮?00780033066.9的同名申請(qǐng)的分
案申請(qǐng)。
[0002]相關(guān)申請(qǐng)的交叉引用
[0003]本申請(qǐng)要求2006年7月13日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)N0.60/807，304和2007年6月I日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)N0.60/932，736的權(quán)益，所述臨時(shí)申請(qǐng)的公開內(nèi)容以引用方式并入本文。
[0004]關(guān)于聯(lián)邦贊助研究的說(shuō)明
[0005]本發(fā)明在政府資助下進(jìn)行，且政府在國(guó)立衛(wèi)生研究院授權(quán)N0.XXX和國(guó)立癌癥研究所授權(quán)下對(duì)所述發(fā)明具有權(quán)力。
【背景技術(shù)】
[0006]結(jié)腸腺癌是世界上主要的癌癥死亡原因、
[0007]結(jié)直腸癌是美國(guó)第三最常見(jiàn)和第二主要的癌癥死亡原因2。散發(fā)性結(jié)腸腺癌最初為腺瘤并通過(guò)分子進(jìn)展、細(xì)胞和組織的變化來(lái)演化3。雖然5-年死亡率在最近30年內(nèi)適當(dāng)降低4，仍需要鑒定所述疾病的新預(yù)后生物標(biāo)記物和治療靶。目前，化療法具有重要的治療價(jià)值但手術(shù)是治療的唯一治愈形式5。
[0008]理想的治療靶應(yīng)該與疾病原因上相關(guān)，且經(jīng)可設(shè)計(jì)治療干預(yù)進(jìn)行修正；而理想的生物標(biāo)記應(yīng)該易于測(cè)量并與臨床結(jié)果具有強(qiáng)相關(guān)性。微小RNA符合這兩個(gè)標(biāo)準(zhǔn)6_8。
`[0009]微小RNA為18-25個(gè)核苷酸的非編碼RNA分子，其調(diào)節(jié)許多基因的翻譯9。從發(fā)現(xiàn)它們開始1CI’n，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)它們調(diào)節(jié)多種細(xì)胞過(guò)程，包括細(xì)胞凋亡12_14，分化1(l’n’15和細(xì)胞增殖16O微小RNA在癌變中起因果作用16，17。微小RNA的表達(dá)水平在大多數(shù)腫瘤類型18’19，包括結(jié)腸癌&22中被改變。在大多數(shù)慢性淋巴細(xì)胞白血病中微小RNA miR-15和miR_16a被刪除或下調(diào)23。特異性微小RNA的實(shí)驗(yàn)操作調(diào)節(jié)小鼠模型系統(tǒng)中腫瘤發(fā)育16’24_26。還證實(shí)了微小RNA對(duì)慢性淋巴細(xì)胞白血病7、肺癌8、和神經(jīng)母細(xì)胞瘤21的預(yù)后潛力。
[0010]微小RNA的異常表達(dá)可能引起癌變，抑制特異性微小RNA可能具有治療意義。可以設(shè)計(jì)修飾的反義寡核苷酸來(lái)特異性抑制微小RNA的功能28。Antagomirs為一種被證明在抑制小鼠體內(nèi)微小RNA功能中是有效的反義寡核苷酸29。由于微小RNA功能的特異性抑制劑易于設(shè)計(jì)，使得其成為治療靶的候選。
[0011]發(fā)明概述
[0012]在一個(gè)廣義的方面，本文提供一種診斷受試者是否患有結(jié)腸癌相關(guān)疾病、處于發(fā)展出結(jié)腸癌相關(guān)疾病的風(fēng)險(xiǎn)中、或具有降低的結(jié)腸癌相關(guān)疾病存活預(yù)后的方法。所述方法包括:測(cè)量來(lái)自受試者的測(cè)試樣品中至少一種miR基因產(chǎn)物的水平，其中相對(duì)于對(duì)照樣品中對(duì)應(yīng)miR基因產(chǎn)物的水平，測(cè)試樣品中所述miR基因產(chǎn)物水平的改變指示所述受試者患有結(jié)腸癌相關(guān)疾病或處于發(fā)展結(jié)腸癌相關(guān)疾病的風(fēng)險(xiǎn)中。在一個(gè)具體方面，所述至少一種miR基因產(chǎn)物選自由miR20a、miR-21、miR-106a、miR-181b、miR-203及其組合組成的組。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述的一種miR基因產(chǎn)物是miR-21。
[0013]在另一廣義的方面，本文提供一種測(cè)試至少結(jié)腸癌相關(guān)疾病應(yīng)答的開始、對(duì)結(jié)腸癌相關(guān)疾病應(yīng)答的傾向或降低的存活預(yù)后的方法，其包括:
[0014](I)測(cè)定來(lái)自受試者的樣品中至少一種標(biāo)記物的表達(dá)水平；所述至少一種標(biāo)記物包括至少一種miR基因產(chǎn)物，所述miR基因產(chǎn)物選自由miR20a、miR-21、miR_106a、miR-181b、miR-203及其組合組成的組；
[0015](2)比較步驟(1)中測(cè)定的表達(dá)水平與來(lái)自健康受試者的樣品中所述標(biāo)記物的對(duì)照表達(dá)水平；和
[0016](3)當(dāng)步驟(2)中的比較結(jié)果顯示:i)受試者中的至少一個(gè)標(biāo)記物的表達(dá)水平比對(duì)照中的高，或ii)受試者中的至少一個(gè)標(biāo)記物的表達(dá)水平比對(duì)照中的低時(shí)，判斷受試者患有結(jié)腸癌相關(guān)疾病。
[0017]樣品可包括組織、血液、血漿、血清、尿和糞便中的一種或多種。此外,所有的方法步驟可以在體外進(jìn)行。
[0018]在另一個(gè)廣義的方面，本文提供一種診斷受試者是否患有結(jié)腸癌相關(guān)疾病、處于發(fā)展出結(jié)腸癌相關(guān)疾病的風(fēng)險(xiǎn)中、或是否具有降低的結(jié)腸癌相關(guān)疾病存活預(yù)后的方法，包括:
[0019](I)逆轉(zhuǎn)錄來(lái)自獲自受試者的測(cè)試樣品的RNA以提供一組靶寡聚脫氧核苷酸；
[0020](2)使所述靶寡聚脫氧核苷酸與微陣列雜交以提供測(cè)試樣品的雜交譜，所述微陣列包括miRNA特異性探針寡核苷酸；和
[0021](3)比較測(cè)試樣品的雜交譜與對(duì)照樣品產(chǎn)生的雜交譜，其中至少一個(gè)miRNA信號(hào)的改變指示所述受試者患有結(jié)腸癌相關(guān)疾病，處于發(fā)展結(jié)腸癌相關(guān)疾病的風(fēng)險(xiǎn)中，或具有降低的結(jié)腸癌相關(guān)疾病存活預(yù)后。
[0022]在一個(gè)具體的方面，相對(duì)于對(duì)照樣品產(chǎn)生的信號(hào)，至少一個(gè)miRNA信號(hào)是被上調(diào)或下調(diào)的。此外，所述微陣列可包括一個(gè)或多個(gè)miRNA的miRNA特異性探針寡核苷酸，所述miRNA 選自由 miR20a、miR-21、miR-106a、miR-181b、miR-203 及其組合組成的組。
[0023]在另一個(gè)廣義的方面，本文提供一種抑制受試者中腫瘤形成的方法，所述受試者患有或懷疑患有結(jié)腸癌相關(guān)疾病，其中相對(duì)于對(duì)照細(xì)胞，在受試者的癌細(xì)胞中至少一種miR基因產(chǎn)物是被上調(diào)或下調(diào)的，所述miR基因產(chǎn)物選自由miR20a、miR-21、miR_106a、miR-181b、miR-203及其組合組成的組，包括:
[0024](I)當(dāng)癌細(xì)胞中至少一種miR基因產(chǎn)物被下調(diào)時(shí)，給受試者施用有效量的至少一種分離的miR基因產(chǎn)物，所述miR基因產(chǎn)物選自由miR20a、miR-21、miR_106a、miR_181b、miR-203及其組合組成的組，從而抑制受試者中腫瘤形成；或
[0025](2)當(dāng)癌細(xì)胞中至少一種miR基因產(chǎn)物被上調(diào)時(shí)，給受試者施用有效量的至少一種抑制所述至少一種miR基因產(chǎn)物表達(dá)的化合物，所述miR基因產(chǎn)物選自由miR20a、miR-21、miR-106a、miR_181b、miR-203及其組合組成的組，從而抑制受試者中腫瘤形成。
[0026]在一個(gè)具體的方面，在步驟(1)和/或步驟(2)中至少一個(gè)分離的miR基因產(chǎn)物是miR-21、或其分離的變體、或其生物活性片段或功能等價(jià)物，或與其結(jié)合的抗體。
[0027]在另一個(gè)廣義的方面，本文提供一種抑制患有結(jié)腸癌的受試者中腫瘤形成的方法，包括:[0028](1)相對(duì)于對(duì)照細(xì)胞，測(cè)定受試者的癌細(xì)胞中至少一種miR基因產(chǎn)物的量；和[0029](2)改變?cè)诎┘?xì)胞中表達(dá)的miR基因產(chǎn)物的量，通過(guò):[0030](i)給受試者施用有效量的至少一種分離的miR基因產(chǎn)物，如果在癌細(xì)胞中表達(dá)的所述miR基因產(chǎn)物的量少于對(duì)照細(xì)胞中表達(dá)的miR基因產(chǎn)物的量，所述miR基因產(chǎn)物選自由 miR20a、miR-21、miR_106a、miR_181b、miR-203 及其組合組成的組；或[0031](ii)給受試者施用有效量的至少一種用于抑制至少一種miR基因產(chǎn)物的化合物，如果在癌細(xì)胞中表達(dá)的miR基因產(chǎn)物的量大于對(duì)照細(xì)胞中表達(dá)的所述miR基因產(chǎn)物的量；[0032]從而抑制受試者中腫瘤形成。[0033]在一個(gè)具體的方面，步驟(i)中的至少一種分離的miR基因產(chǎn)物是miR-21或其分離的變體或生物活性片段。此外，在某些實(shí)施方案中，在步驟(ii)中的至少一種miR基因產(chǎn)物選自由miR20a、miR-21、miR-106a、miR-181b、miR-203及其組合組成的組，或其分離的變體或生物活性片段。[0034]在另一個(gè)廣義的方面，本文提供一種腫瘤形成抑制劑的鑒定方法，包括:給細(xì)胞提供一種測(cè)試試劑，并測(cè)量與結(jié)腸癌相關(guān)疾病中變化的表達(dá)水平相關(guān)的至少一種miR基因產(chǎn)物的水平，其中相對(duì)于合適的對(duì)照細(xì)胞，所述細(xì)胞中miR基因產(chǎn)物水平的升高或降低指示所述測(cè)試試劑為腫瘤形成的抑制劑。[0035]在另一個(gè)廣義的方面，本文提供一種腫瘤形成抑制劑的鑒定方法，包括:給細(xì)胞提供一種測(cè)試試劑，并測(cè)量與結(jié)腸癌相關(guān)疾病中改變的表達(dá)水平相關(guān)的至少一種miR基因產(chǎn)物的水平，其中相對(duì)于合適的對(duì)照細(xì)胞，所述細(xì)胞中miR基因產(chǎn)物水平的降低指示所述測(cè)試試劑為腫瘤形成的抑制劑。[0036]在另一個(gè)廣義的方面，本文提供一種用于評(píng)估一種或多種代謝途徑的標(biāo)記物，所述代謝途徑對(duì)至少一種結(jié)腸癌相關(guān)疾病的引發(fā)、進(jìn)展、嚴(yán)重性、病理、惡性(aggressiveness)、分期、活性、殘疾、死亡率、發(fā)病率、疾病亞分類或其他潛在致病或病理特征的至少一種有貢獻(xiàn)，其中所述標(biāo)記物包括一種或多種miR基因產(chǎn)物，所述miR基因產(chǎn)物選自由 miR20a、miR-21、miR-106a、miR-181b、miR-203 及其組合組成的組。[0037]在另一個(gè)廣義的方面，本文提供包含一個(gè)或多個(gè)本文所述標(biāo)記物的組合物。[0038]在另一個(gè)廣義的方面，本文提供鑒定引發(fā)或發(fā)展受試者中至少一種結(jié)腸癌相關(guān)疾病的潛力的方法，所述方法提供對(duì)一種或多種本文所述標(biāo)記物的測(cè)量。在某些實(shí)施方案，在分離的樣品中存在一種或多種標(biāo)記物，且所有的方法步驟在體外進(jìn)行。[0039]在另一個(gè)廣義的方面，本文提供測(cè)試結(jié)腸癌相關(guān)疾病的試劑，其中所述試劑包含多核苷酸，所述多核苷酸包括至少一種本文所述標(biāo)記物的核苷酸序列或與所述標(biāo)記物的核苷酸序列互補(bǔ)的核苷酸序列。[0040]在另一個(gè)廣義的方面，本文提供測(cè)試結(jié)腸癌相關(guān)疾病的試劑，其中所述試劑包含抗體，所述抗體識(shí)別由至少一種本文所述的標(biāo)記物編碼的蛋白。[0041]在另一個(gè)廣義的方面，本文提供測(cè)試結(jié)腸癌相關(guān)疾病的DNA芯片，探針固定在所述芯片上以測(cè)試至少一種本文所述的標(biāo)記物。[0042]在另一個(gè)廣義的方面，本文提供一種評(píng)估療法預(yù)防、診斷和/或治療至少一種結(jié)腸癌相關(guān)疾病的效力的方法，包括:[0043]1)給動(dòng)物施用一種療法，評(píng)估所述療法的效力，和[0044]2)通過(guò)評(píng)價(jià)至少一個(gè)本文所述的標(biāo)記物測(cè)定在治療或預(yù)防結(jié)腸癌相關(guān)疾病中待測(cè)試的治療的效力水平。
[0045]在某些實(shí)施方案中，候選治療劑包括藥物組合物、保健組合物和順勢(shì)療法組合物的一種或多種。此外，待評(píng)估的療法可用于人受試者。在某些實(shí)施方案中，所述方法不是通過(guò)手術(shù)或療法來(lái)治療人體或動(dòng)物體的方法。
[0046]在另一廣義的方面，本文提供一種評(píng)估至少一種材料引發(fā)動(dòng)物模型中結(jié)腸癌相關(guān)疾病應(yīng)答的能力的方法，所述方法包括:
[0047]I)在使動(dòng)物與足以引發(fā)動(dòng)物中結(jié)腸癌相關(guān)疾病應(yīng)答的量的一種或多種材料接觸后，測(cè)量一種或多種本文所述的被上調(diào)或下調(diào)的標(biāo)記物；和
[0048]2)測(cè)定上調(diào)或下調(diào)標(biāo)記物的至少一種是否具有引發(fā)結(jié)腸癌相關(guān)疾病應(yīng)答的能力。
[0049]在另一廣義的方面，本文提供一種治療結(jié)腸癌相關(guān)疾病的藥物組合物，包括:至少一種 miR 基因產(chǎn)物，所述 miR 基因產(chǎn)物選自由 miR20a、miR-21、miR-106a、miR-181b、miR-203及其組合組成的組；和藥學(xué)可接受的載體。
[0050]在另一廣義的方面，本文提供治療結(jié)腸癌的藥物組合物，其包括至少一種miR表達(dá)抑制化合物和藥學(xué)可接受的載體，其中所述的至少一種miR表達(dá)抑制化合物對(duì)miR基因產(chǎn)物具有特異性，所述miR基因產(chǎn)物選自由miR20a、miR-21、miR_106a、miR_181b、miR-203及其組合組成的組。
[0051]在另一廣義的方面，本文提供一種產(chǎn)品，包括:至少一種與結(jié)腸癌相關(guān)疾的標(biāo)記物結(jié)合的捕獲試劑，所述標(biāo)記物選自本文所述標(biāo)記物的至少一種。
[0052]在另一廣義的方面，本文提供篩選用于治療結(jié)腸癌相關(guān)疾病的治療劑的候選化合物的試劑盒，其中所述試劑盒`包括:至少一種本文所述的標(biāo)記物的一種或多種試劑，和表達(dá)至少一種標(biāo)記物的細(xì)胞。在某些實(shí)施方案中，使用包含抗體或抗體片段的試劑檢測(cè)所述標(biāo)記物的存在，所述抗體或抗體片段與至少一種標(biāo)記物特異性結(jié)合。同樣，在某些實(shí)施方案中，所述試劑是標(biāo)記的、放射標(biāo)記的、或生物素標(biāo)記的，和/或所述抗體或抗體片段是放射標(biāo)記的、生色團(tuán)標(biāo)記的、熒光團(tuán)標(biāo)記的或酶標(biāo)記的。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，所述試劑盒進(jìn)一步包括包含至少一種標(biāo)記物的容器。同樣，所述試劑可包括下述的一種或多種:抗體、附帶或可附帶的探針、和固定的金屬螯合物。
[0053]在另一廣義的方面，本文提供結(jié)腸癌相關(guān)疾病的篩選測(cè)試，包括:
[0054]使一種或多種權(quán)利要求20的標(biāo)記物與所述標(biāo)記物的底物和與測(cè)試試劑接觸，和
[0055]測(cè)定所述測(cè)試試劑是否調(diào)節(jié)所述標(biāo)記物的活性。
[0056]在某些實(shí)施方案中，所有的方法步驟可以在體外進(jìn)行。
[0057]在另一廣義的方面，本文提供預(yù)測(cè)受試者中結(jié)腸癌相關(guān)疾病存在的微陣列，包含針對(duì)至少一種權(quán)利要求20的標(biāo)記物的抗體。
[0058]在另一廣義的方面，本文提供方法、組合物等，其中通過(guò)檢測(cè)轉(zhuǎn)錄多核苷酸或其部分的存在來(lái)評(píng)估標(biāo)記物的表達(dá)水平，其中所述轉(zhuǎn)錄的多核苷酸包括所述標(biāo)記物的編碼區(qū)。同時(shí)，所述樣品可以是結(jié)腸癌相關(guān)體液或組織。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，所述樣品包括來(lái)自患者的細(xì)胞。
[0059]在另一廣義的方面，本文提供治療、預(yù)防、逆轉(zhuǎn)或限制在需要其的個(gè)體中結(jié)腸癌相關(guān)疾病并發(fā)癥的嚴(yán)重性的方法，包括:[0060]給個(gè)體施用干擾至少一種結(jié)腸癌相關(guān)疾病應(yīng)答信號(hào)傳導(dǎo)途徑的試劑，以足以干擾所述信號(hào)傳導(dǎo)的量，其中所述試劑包含至少一種miR基因產(chǎn)物，所述miR基因產(chǎn)物選自由miR20a、miR-21、miR_106a、miR_181b、miR-203 及其組合組成的組。
[0061]在另一廣義的方面，本文提供干擾至少一種結(jié)腸癌相關(guān)疾病應(yīng)答信號(hào)傳導(dǎo)途徑的試劑在制備藥物中的用途，所述藥物用于治療、預(yù)防、逆轉(zhuǎn)或限制個(gè)體中結(jié)腸癌相關(guān)疾病并發(fā)癥的嚴(yán)重性，其中所述試劑包含至少一種miR基因產(chǎn)物，所述miR基因產(chǎn)物選自由miR20a、miR-21、miR_106a、miR_181b、miR-203 及其組合組成的組。
[0062]在另一廣義的方面，本文提供治療、預(yù)防、逆轉(zhuǎn)或限制在需要其的個(gè)體中結(jié)腸癌相關(guān)疾病并發(fā)癥的嚴(yán)重性的方法，包括給所述個(gè)體施用干擾至少一種結(jié)腸癌相關(guān)疾病應(yīng)答級(jí)聯(lián)的試劑，其中所述試劑包含至少一種miR基因產(chǎn)物，所述miR基因產(chǎn)物選自由miR20a、miR-21、miR-106a、miR-181b，miR-203 及其組合組成的組。
[0063]在另一廣義的方面，本文提供干擾至少一種結(jié)腸癌相關(guān)疾病應(yīng)答級(jí)聯(lián)的試劑在制備藥物中的用途，所述藥物用于治療、預(yù)防、逆轉(zhuǎn)或限制個(gè)體中結(jié)腸癌相關(guān)疾病并發(fā)癥的嚴(yán)重性，其中所述試劑包含至少一種miR基因產(chǎn)物，所述miR基因產(chǎn)物選自由miR20a、miR-21、miR-106a、miR_181b、miR-203 及其組合組成的組。
[0064]在另一廣義的方面，本文提供包括一種包含數(shù)據(jù)庫(kù)的計(jì)算機(jī)可讀介質(zhì)，所述數(shù)據(jù)庫(kù)具有多種數(shù)據(jù)編碼的參考譜，其中至少第一參考譜代表來(lái)自一個(gè)或多個(gè)受試者的一個(gè)或多個(gè)樣品中至少第一標(biāo)記物的水平，所述受試者展示結(jié)腸癌相關(guān)疾病應(yīng)答的標(biāo)記(indicia),
[0065]其中所述標(biāo)記物包括一種或多種miR基因產(chǎn)物，所述miR基因產(chǎn)物選自由miR20a、miR-21、miR-106a、miR-181b、miR-203 及其組合組成的組。
[0066]在某些實(shí)施方案中， 所述計(jì)算機(jī)可讀介質(zhì)包含至少第二參考譜，其代表來(lái)自一個(gè)或多個(gè)受試者的一個(gè)或多個(gè)樣品中至少第二標(biāo)記物的水平，所述受試者展示結(jié)腸癌相關(guān)疾病應(yīng)答的標(biāo)記，或受試者患有結(jié)腸癌相關(guān)疾病。
[0067]在另一廣義的方面，本文提供一種測(cè)定患者是否患有，或傾向于患有結(jié)腸癌相關(guān)疾病，或具有差的結(jié)腸癌相關(guān)疾病存活預(yù)后的計(jì)算機(jī)系統(tǒng)，包括本文所述的數(shù)據(jù)庫(kù)，和包括計(jì)算機(jī)可執(zhí)行代碼的服務(wù)器，其使計(jì)算機(jī)接收受試者的譜，從數(shù)據(jù)庫(kù)識(shí)別匹配的在診斷上與受試者的譜相關(guān)的參考譜，并產(chǎn)生所述受試者是否患有或傾向于患結(jié)腸癌相關(guān)疾病的指
/Jn o
[0068]在另一廣義的方面，本文提供一種評(píng)價(jià)受試者中結(jié)腸癌相關(guān)疾病的存在、不存在、性質(zhì)或程度的計(jì)算機(jī)輔助方法，包括:
[0069]I)提供包括對(duì)來(lái)自獲自受試者的樣品的數(shù)據(jù)進(jìn)行分類的模型或運(yùn)算法則，其中，所述分類包括就至少一種標(biāo)記物的存在、不存在或量分析所述數(shù)據(jù)，其中所述標(biāo)記物包括一種或多種miR基因產(chǎn)物，所述miR基因產(chǎn)物選自由miR20a、miR-21、miR-106a、miR-181b、miR-203及其組合組成的組。
[0070]2)輸入獲自受試者的生物樣品的數(shù)據(jù)；和
[0071]3)分類生物樣品以指示結(jié)腸癌相關(guān)疾病的存在、不存在、性質(zhì)或程度。
[0072]在另一廣義的方面，至少一種miR基因產(chǎn)物及其組合包括分離的變體、或其生物活性片段或功能等價(jià)物、或與其結(jié)合的抗體。[0073]在另一廣義的方面，本文提供結(jié)腸癌的動(dòng)物模型，其中下述生物或化學(xué)過(guò)程的至少一個(gè)(上調(diào)或下調(diào)一種或多種miR基因產(chǎn)物)在所述動(dòng)物模型中發(fā)生，所述miR基因產(chǎn)物選自由miR20a、miR-21、miR_106a、miR_181b、miR-203及其組合組成的組。在某些實(shí)施方案中，所述動(dòng)物模型是非人脊椎動(dòng)物。在具體的實(shí)施方案中，所述動(dòng)物模型是小鼠、大鼠、兔或靈長(zhǎng)類動(dòng)物。
[0074]在附圖的啟發(fā)下閱讀時(shí)，從下述優(yōu)選實(shí)施方案的詳細(xì)描述中，本發(fā)明的各種目的和優(yōu)點(diǎn)對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是明顯的。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】[0075]專利或申請(qǐng)文件包括至少一副以彩色繪制的附圖。在提出要求和支付必須的費(fèi)用后辦事處(Office)可以提供帶有彩色附圖的本專利或?qū)＠暾?qǐng)出版物的副本。
[0076]圖la-lg:miR_21在結(jié)腸腺癌中以較高水平表達(dá)，在更晚期腫瘤中表達(dá)逐步增加。
[0077](圖1a)對(duì)miR-21的原位雜交進(jìn)行最優(yōu)化以區(qū)分miR-21的高表達(dá)和低表達(dá)。人腫瘤(T)中的結(jié)腸上皮細(xì)胞與臨近的非腫瘤組織(N)相比表達(dá)較高水平的miR-21。(圖1c)在高的放大倍率下，腫瘤組織中結(jié)腸上皮細(xì)胞的細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)在腫瘤組織中表達(dá)顯著量的miR-21。(圖le)非腫瘤組織在相同的放大倍率下不顯示miR-21的顯著表達(dá)。
[0078](圖lb，圖ld，圖1f)如所預(yù)料的，在低或高的放大倍率下，在腫瘤組織和非腫瘤組織的連續(xù)切片中爭(zhēng)奪對(duì)照探針(the scramble control probe)沒(méi)有顯示顯著染色。標(biāo)尺線(scale bars)(圖lc_f)顯示在晚期腫瘤中500 y M (g) miR-21以較高水平表達(dá)。點(diǎn)圖表示腺瘤和腫瘤表達(dá)水平的miR-21相對(duì)Ct值(來(lái)自定量RT-PCR)，其已分別針對(duì)配對(duì)非腺瘤或非腫瘤組織進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。組織類型從腺瘤到1-1V期的腫瘤進(jìn)行排序。線條顯示中間值。存在越晚期的腫瘤具有越高的miR-21表達(dá)的明顯趨勢(shì)(在排列的組中趨勢(shì)的非參數(shù)測(cè)試)。
[0079]圖2:miR-21在較晚期的腫瘤中以較高水平表達(dá)。使用微小RNA微陣列來(lái)測(cè)量miR-21的表達(dá)水平。點(diǎn)圖代表miR-211g2 (腫瘤/非腫瘤比例)，如根據(jù)來(lái)自原來(lái)的群(cohort)的微小RNA微陣列所計(jì)算的。使用來(lái)自微陣列的探針hsa_miR-21-precl7Nol來(lái)測(cè)量miR-21表達(dá)。排除基于微陣列數(shù)據(jù)具有不可測(cè)的miR-21表達(dá)的組織。組織類型從?M的I期至IV期腫瘤進(jìn)行排列。線條表示中間值。存在越晚期的腫瘤具有越高的miR-21表達(dá)的明顯趨勢(shì)(p=0.04 ;在排列的組中趨勢(shì)的非參數(shù)測(cè)試)。
[0080]圖3a和3b:腫瘤中高的miR-21表達(dá)預(yù)測(cè)在兩個(gè)獨(dú)立群中具有典型腺癌組織結(jié)構(gòu)的患者中差的存活。所述分析排除具有粘液腺癌或腺鱗狀癌組織結(jié)構(gòu)的受試者。
[0081](圖3a)在馬里蘭測(cè)試群中使用微小RNA微陣列來(lái)測(cè)量腫瘤和非腫瘤組織的微小RNA表達(dá)水平。排除基于微陣列數(shù)據(jù)具有不可測(cè)的miR-21表達(dá)的組織?；谧罡呷治唤M(tertile)對(duì)高的miR-21表達(dá)進(jìn)行分類。紅線表示具有高表達(dá)的個(gè)體，而綠線對(duì)應(yīng)低表達(dá)。對(duì)于非腫瘤組織，24/69組織被分類為高的，而26/72腫瘤被分類為高的。腫瘤中高的miR-21表達(dá)(右)與差的存活相關(guān)，而其在非腫瘤組織中沒(méi)有關(guān)聯(lián)。
[0082](圖3b)驗(yàn)證獨(dú)立群中腫瘤高的miR-21表達(dá)與差的預(yù)后的相關(guān)性。通過(guò)定量RT-PCR測(cè)量miR-21的表達(dá)水平。高的表達(dá)基于最高三分位組。35/103非腫瘤組織被分類為高的，且34/103腫瘤組織被分類為高的。P-值為根據(jù)Kaplan-Meier分析的log秩P-值。在所有線上的X’S表示檢查個(gè)體的時(shí)間。
[0083]圖4a和4b:腫瘤中高miR_21表達(dá)預(yù)測(cè)兩個(gè)獨(dú)立群中的差的存活。所述分析包括所有受試者，不考慮腺癌組織結(jié)構(gòu)。
[0084](圖4a)在馬里蘭測(cè)試群中使用微小RNA微陣列來(lái)測(cè)量腫瘤和非腫瘤組織的微小RNA表達(dá)水平。排除基于微陣列數(shù)據(jù)檢測(cè)不到miR-21表達(dá)的組織?；谧罡呷治唤M對(duì)高miR21表達(dá)進(jìn)行分類。紅線表示具有高表達(dá)的個(gè)體，而綠線對(duì)應(yīng)低表達(dá)。對(duì)于非腫瘤組織，26/74組織被分類為高的，而28/79腫瘤被分離為高的。腫瘤中高的miR-21表達(dá)(右)與差的存活相關(guān)，而其在非腫瘤組織中沒(méi)有關(guān)聯(lián)。
[0085](圖4b)對(duì)獨(dú)立群中腫瘤中高的miR-21表達(dá)與差的預(yù)后的相關(guān)性進(jìn)行驗(yàn)證。通過(guò)定量RT-PCR測(cè)量miR-21的表達(dá)水平。高表達(dá)基于最高三分位組。37/111非腫瘤組織被分類為高的，且37/111腫瘤組織被分類為高的。所有P-值為根據(jù)Kaplan-Meier分析的log秩P-值。在所有線上的X’s表示檢查個(gè)體的時(shí)間。
[0086]圖5a、5b和5c:在常規(guī)腺癌組織結(jié)構(gòu)情況下，高的miR-21表達(dá)與對(duì)輔助化療低的應(yīng)答有關(guān)。所述分析包括來(lái)自驗(yàn)證群的受試者，排除具有粘液腺癌組織結(jié)構(gòu)或腺鱗狀癌組織結(jié)構(gòu)的受試者。
[0087](圖5a)通過(guò)miR-21表達(dá)水平比較具有常規(guī)腺癌組織結(jié)構(gòu)的期受試者和接受輔助化療的受試者的存活率。對(duì)于77個(gè)II/III期的受試者，25個(gè)被分類為低的miR-21并接受治療，28個(gè)為低miR-21且不接受治療，11個(gè)為高的miR-21并接受治療，和13個(gè)為高的miR-21且不接受治療。對(duì)于接受輔助化療的II/III期受試者，腫瘤中高的miR-21表達(dá)與差的存活相關(guān)(p=0.03)。
[0088](圖5b)比較具有常規(guī)腺癌組織結(jié)構(gòu)的ITMII期受試者。對(duì)于33個(gè)II期受試者，8個(gè)被分類為低的miR-21并接受治療，15個(gè)為低miR-21且不接受治療，3為高miR-21的接受治療，和7個(gè)為高miR-21的且不接受治療。對(duì)于所有接受輔助化療的II期的受試者，在研究期間存活。
[0089](圖5c)比較具有常規(guī)腺癌組織結(jié)構(gòu)的TWIII期受試者。對(duì)于44個(gè)III期受試者，17個(gè)被分類為低的miR-21并接受治療，13個(gè)為低的miR-21且不接受治療，8為高的miR-21并接受治療，和6個(gè)為高的miR-21且不接受治療。對(duì)于接受輔助化療的III期受試者，腫瘤中高的miR-21表達(dá)與差的存活相關(guān)(p=0.02)。在所有線上的X’s表示檢查個(gè)體的時(shí)間。
[0090]圖6a、6b和6c:馬里蘭測(cè)試群和香港驗(yàn)證群的聯(lián)合分析，檢測(cè)腫瘤和接受輔助化療之間miR-21的表達(dá)與預(yù)后的相關(guān)性。所述分析包括來(lái)自兩個(gè)群的所有ITM的II/III期受試者。排除具有粘液腺癌組織結(jié)構(gòu)或腺鱗狀癌組織結(jié)構(gòu)的個(gè)體。左邊的柱包括分析接受輔助療法與預(yù)后之間的相關(guān)性的Kaplan-Meier圖。中間的柱包括對(duì)腫瘤中高的miR-21表達(dá)與預(yù)后相關(guān)性的分析，且右邊的柱基于化療和miR-21表達(dá)情況對(duì)個(gè)體進(jìn)行細(xì)分。
[0091](圖6a)所有ITM的II/III期受試者。對(duì)于119個(gè)II/III期的受試者，40個(gè)被分類為低的miR-21并接受治療，41個(gè)為低的miR-21但不接受治療，16為高的miR-21并接受治療，和22個(gè)為高的miR-21但不接受治療。高的miR-21表達(dá)與接受化療的那些(p=0.003)和不接受化療的那些(P=0.04)的差的存活相關(guān)。
[0092](圖6b)所有ITM的II期受試者。對(duì)于52個(gè)II/III期受試者，10個(gè)被分類為低的miR-21并接受治療，25個(gè)為低miR-21但不接受治療，4為高的miR-21并接受治療，和13個(gè)為高的miR-21但不接受治療。高的miR-21表達(dá)與預(yù)后之間的相關(guān)性在接受化療的個(gè)體(p=0.11)或不接受化療的個(gè)體(p=0.06)中不是統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著的。
[0093](圖6c)所有ITM的III期受試者。對(duì)于67個(gè)III期的受試者，30個(gè)被分類為低的miR-21并接受治療，16個(gè)為低miR-21但不接受治療，12為高的miR-21并接受治療，和9個(gè)為高的miR-21但不接受治療。高的miR-21表達(dá)與在接受化療的III期受試者中差的存活顯著相關(guān)(P=0.007)，但在不接受化療的受試者中不顯著相關(guān)(p=0.30)。在所有線上的X’s表示檢查個(gè)體的時(shí)間。
[0094]圖7a_7c.總的miRNA譜與臨床ITM分期和存活預(yù)后相關(guān)。miRNATIN比例的分級(jí)聚類導(dǎo)致形成兩個(gè)組，任意稱為A組和B組。圖7a顯示所得的HEAT圖和聚類分配。這兩個(gè)組由對(duì)ITM分期具有顯著不同存活預(yù)后的個(gè)體組成，其中與A組個(gè)體相比，B組個(gè)體更有可能被診斷為III或IV期(圖7b)。Kaplan-Meier分析顯示B組的存活預(yù)后更差(圖7c)。
[0095]圖8a-81.個(gè)體miRNA的TIN比例預(yù)測(cè)存活預(yù)后。此處展示的圖通過(guò)對(duì)9個(gè)miRNA的每一個(gè)進(jìn)行TW分期(左)和Kaplan-Meier分析(右)顯示TIN比例。Y軸(TW分期圖顯示的TIN比例)顯示每一個(gè)個(gè)體的經(jīng)log (2)轉(zhuǎn)化的TIN比例，而?!分期(1、I1、III或IV)顯示Y軸組個(gè)體。顯示的權(quán)值為通過(guò)分期進(jìn)行分組的個(gè)體的平均TIN比值的趨勢(shì)的非參數(shù)測(cè)試的結(jié)果。Kaplan-Meier圖包括對(duì)于那個(gè)具體的miRNA具有TIN比例數(shù)據(jù)的所有個(gè)體。發(fā)現(xiàn)TIN比例與臨床分期和存活預(yù)后均有關(guān)。
[0096]圖9a和9b.9個(gè)miRNA的miRNA信號(hào)預(yù)測(cè)死于結(jié)腸癌的風(fēng)險(xiǎn)。各個(gè)miR-21、miR-106a、miR181b、miR_16b、miR-203、let_7g、miR_29a、miR-103-2 和 miR-10a 的 TIN 比例顯示對(duì)結(jié)腸癌預(yù)后的預(yù)測(cè)。這9個(gè)miRNA的TIN比例的分級(jí)聚類將個(gè)體分成具有顯著不同存活預(yù)后兩組(IA) (IB)0 B組個(gè)體死于結(jié)腸癌的風(fēng)險(xiǎn)比A組高得多。如果個(gè)體缺少大于組成miRNA信號(hào)的9個(gè)TIN比例中的2個(gè)，從所述分析中排除它們。
[0097]優(yōu)選實(shí)施方案的詳述`
[0098]在一個(gè)廣義的方面，本文提供對(duì)具體微小RNA的鑒定，相對(duì)于正常對(duì)照細(xì)胞，所述微小RNA的表達(dá)在與不同結(jié)腸癌相關(guān)的癌細(xì)胞中改變。
[0099]如在本文可互換使用的，“miR基因產(chǎn)物”、“微小RNA”、“miR”或“miRNA”指來(lái)自miR基因的未加工(例如，前體)或經(jīng)加工的(例如，成熟)的RNA轉(zhuǎn)錄物。因?yàn)樗鰉iR基因產(chǎn)物沒(méi)有被翻譯成蛋白，術(shù)語(yǔ)“miR基因產(chǎn)物”不包括蛋白。未加工的miR基因轉(zhuǎn)錄物還稱為“miR前體”或“miR prec”并典型地包括長(zhǎng)度約為70-100個(gè)核苷酸的RNA轉(zhuǎn)錄物。可以通過(guò)用RNAse (例如，Dicer、Argonaut或RNAse III (例如，大腸桿菌RNAse III))消化，將所述miR前體進(jìn)行加工成具有19-25個(gè)核苷酸的活性RNA分子。所述具有19-25個(gè)核苷酸的活性RNA分子還稱為“經(jīng)加工的” miR基因轉(zhuǎn)錄或“成熟”miRNA。
[0100]所述具有19-25個(gè)核苷酸的活性RNA分子可以通過(guò)天然加工途徑(例如，使用完整細(xì)胞或細(xì)胞裂解物)或通過(guò)合成加工途徑(例如，使用分離的加工酶，諸如分離的Dicer、Argonaut或RNAse III)獲自miR前體。應(yīng)理解所述具有19-25個(gè)核苷酸的活性RNA分子還可以通過(guò)生物或化學(xué)合成直接產(chǎn)生，無(wú)需從miR前體進(jìn)行加工。當(dāng)在本文中以名字提及微小RNA時(shí)，所述名字對(duì)應(yīng)于前體和成熟形式，除非另外指出。
[0101]在一個(gè)方面，本文提供診斷受試者是否患有結(jié)腸或處于發(fā)展結(jié)腸癌風(fēng)險(xiǎn)中的方法，其包括測(cè)量來(lái)自受試者的測(cè)試樣品中至少一種miR基因產(chǎn)物的水平，并比較測(cè)試樣品中所述miR基因產(chǎn)物的水平與對(duì)照樣品中對(duì)應(yīng)miR基因產(chǎn)物的水平。如本文所使用的，“受試者”可以是任何患有或懷疑患有實(shí)體癌的哺乳動(dòng)物。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述受試者是患有或懷疑患有結(jié)腸癌的人。
[0102]在一個(gè)實(shí)施方案中，在所述測(cè)試樣品中測(cè)量的至少一種miR基因產(chǎn)物選自由miR20a、miR-21、miR-106a、miR-181b、miR-203及其組合組成的組。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，所述miR基因產(chǎn)物是miR-21。
[0103]所述結(jié)腸癌相關(guān)疾病可以是任何由結(jié)腸組織引起的障礙或癌癥。所述癌癥典型地與腫瘤塊的形成和/或存在相關(guān)，例如腺癌。
[0104]在一個(gè)實(shí)施方案中，所述結(jié)腸是腺癌和在所述測(cè)試樣品中測(cè)量的至少一種miR基因產(chǎn)物選自由miR20a、miR-21、miR_106a、miR_181b、miR-203及其組合組成的組。
[0105]在另一個(gè)實(shí)施方案中，在測(cè)試樣品中測(cè)量的至少一種miR基因產(chǎn)物是miR-21。
[0106]可以測(cè)量獲自受試者的生物樣品(例如，細(xì)胞、組織)中至少一種miR基因產(chǎn)物的水平。例如，可以通過(guò)常規(guī)的活檢技術(shù)從懷疑患有結(jié)腸癌相關(guān)疾病的受試者提取組織樣品(例如，來(lái)自腫瘤)。在另一個(gè)實(shí)施方式中，可以從受試者提取血液樣品，并通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)對(duì)血細(xì)胞(例如，白血細(xì)胞)進(jìn)行分離以獲得DNA提取物。所述血液或組織樣品優(yōu)選獲自開始放射治療、化學(xué)療法或其他治療性治療之前的受試者。對(duì)應(yīng)的對(duì)照組織樣品或血液樣品可獲自所述受試者未受影響的組織、正常人個(gè)體或正常個(gè)體群、或?qū)?yīng)于所述受試者樣品中大多數(shù)細(xì)胞的培養(yǎng)細(xì)胞。然后將對(duì) 照組織樣品或血液樣品與來(lái)自受試者的樣品一起處理，從而比較由來(lái)自受試者樣品的細(xì)胞中給定miR基因產(chǎn)生的miR基因產(chǎn)物的水平與來(lái)自對(duì)照樣品的細(xì)胞的對(duì)應(yīng)miR基因產(chǎn)物水平。所述生物樣品的參考miR表達(dá)標(biāo)準(zhǔn)也可用作對(duì)照。
[0107]相對(duì)于對(duì)照樣品中對(duì)應(yīng)miR基因產(chǎn)物的水平，獲自受試者的樣品中miR基因產(chǎn)物水平的改變(例如，增加或降低)指示受試者中存在結(jié)腸癌相關(guān)疾病。
[0108]在一個(gè)實(shí)施方案中，測(cè)試樣品中至少一種miR基因產(chǎn)物的水平大于對(duì)照樣品中對(duì)應(yīng)miR基因產(chǎn)物的水平(即，所述miR基因產(chǎn)物的表達(dá)被“上調(diào)”)。如本文所使用的，當(dāng)來(lái)自受試者的細(xì)胞或組織中的基因產(chǎn)生的miR基因產(chǎn)物的量大于對(duì)照細(xì)胞或組織樣品中相同基因產(chǎn)物的量時(shí)，miR基因產(chǎn)物的表達(dá)被“上調(diào)”。
[0109]在另一個(gè)實(shí)施方案中，測(cè)試樣品中至少一種miR基因產(chǎn)物的水平小于對(duì)照樣品中對(duì)應(yīng)miR基因產(chǎn)物的水平(即，miR基因產(chǎn)物的表達(dá)被“下調(diào)”)。如本文所使用的，當(dāng)來(lái)自受試者的細(xì)胞或組織中miR基因產(chǎn)物的量小于對(duì)照細(xì)胞或組織樣品中相同基因產(chǎn)生的量時(shí)，miR基因產(chǎn)物的表達(dá)被“下調(diào)”。
[0110]對(duì)照和正常樣品中相對(duì)的miR基因表達(dá)可以相對(duì)于一種或多種RNA表達(dá)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行測(cè)定。所述標(biāo)準(zhǔn)例如可以包括零miR基因表達(dá)水平、在標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞系中所述miR基因的表達(dá)水平，受試者未受影響的組織中所述miR基因的表達(dá)水平、或之前獲自正常人對(duì)照群的miR基因表達(dá)的平均水平。
[0111]可以使用任何適合檢測(cè)生物樣品中RNA表達(dá)水平的技術(shù)測(cè)定樣品中miR基因產(chǎn)物的水平。測(cè)定生物樣品(例如，細(xì)胞、組織)中RNA表達(dá)水平的合適技術(shù)(例如，Northern印跡分析、RT-PCR、原位雜交)為本領(lǐng)域所述技術(shù)人員所熟知的。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，使用Northern印跡分析測(cè)定至少一種miR基因產(chǎn)物的水平。例如,可以在核酸提取緩沖溶液存在下通過(guò)勻漿化作用，然后通過(guò)離心從細(xì)胞分離出總的細(xì)胞RNA。沉淀核酸，通過(guò)用DNase處理和沉淀除去DNA。然后根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)通過(guò)瓊脂糖凝膠上的凝膠電泳分離所述RNA分子，并轉(zhuǎn)移到硝化纖維素濾膜。然后通過(guò)加熱將所述RNA固定在濾膜上。使用與可疑RNA互補(bǔ)的合適標(biāo)記的DNA或RNA探針來(lái)完成特異性RNA的檢測(cè)和定量。例如參見(jiàn)，MolecularCloning:A Laboratory Manual, J.Sambrook 等，eds., 2nd edition, Cold Spring HarborLaboratory Press, 1989, Chapter7,其公開的全部?jī)?nèi)容以引用方式并入本文。
[0112]可以由所述核酸序列產(chǎn)生用于給定miR基因產(chǎn)物Northern印跡雜交的合適探針，其包括但不限于與目的miR基因產(chǎn)物至少約70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%、99%或完全互補(bǔ)的探針。標(biāo)記的DNA和RNA探針的制備方法，以及其與靶核苷酸序列的雜交條件描述于 Molecular Cloning:A Laboratory Manual, J.Sambrook 等編輯，第二版，ColdSpring Harbor Laboratory Press, 1989,第10和11章,其公開內(nèi)容以引用方式并入本文。
[0113]在一個(gè)非限制性的實(shí)施例中，所述核酸探針例如可以用放射性核素(諸如3H、32P、33P、14C或35S);重金屬；能用作經(jīng)標(biāo)記配體的特異性結(jié)合對(duì)成員的配體(例如，生物素、親和素或抗體)；熒光分子；化學(xué)發(fā)光分子；酶等進(jìn)行標(biāo)記。
[0114]通過(guò)Rigby 等(1977)，J.Mol.Biol.113 =237-251 的缺口翻譯方法，或通過(guò)Fienberg等(1983), Anal.Biochem.132:6-13的隨機(jī)引物法,探針可以被標(biāo)記為具有高的特異性活性，其全部公開的內(nèi)容以引用方式并入本文。后者是從單鏈DNA或從RNA模板選擇合成高特異性活性的32P-標(biāo)記探針的選擇方法。例如，根據(jù)缺口翻譯方法通過(guò)用高放射性的核苷酸替代先前存在的核苷酸，有可能制備超過(guò)108cpm/mg的32P標(biāo)記具有特異性活性的核酸探針。然后通過(guò)將雜交的濾膜曝光于膠片來(lái)進(jìn)行雜交的放射自顯影檢測(cè)。由雜交濾膜曝光的膠片的光密度掃描提供miR基因轉(zhuǎn)錄水平的準(zhǔn)確測(cè)量。使用另一種方法，miR基因轉(zhuǎn)錄水平可以通過(guò)計(jì)算機(jī) 成像系統(tǒng)(諸如購(gòu)自Amersham Biosciences, Piscataway, NJ的Molecular Dynamics400-B2DPhosphorimager)進(jìn)行定量。
[0115]在DNA或RNA探針的放射性核標(biāo)記是不可行的情況下，可以使用隨機(jī)引物方法將類似物，例如，dTTP類似物5- (N- (N-生物素酰-e -氨基己酰基)_3_氨基烯丙基)脫氧尿苷三磷酸整合到探針?lè)肿又?。所述生物素探針寡核苷酸可以通過(guò)與生物素-結(jié)合蛋白反應(yīng)來(lái)檢測(cè)，諸如親和素、鏈霉親和素與熒光染料或產(chǎn)生顏色反應(yīng)的酶偶合的抗體(例如，抗生物素抗體)。
[0116]除了 Northern和其他RNA雜交技術(shù)外，可以使用原位雜交技術(shù)來(lái)完成RNA轉(zhuǎn)錄水平的測(cè)定。所述技術(shù)與Northern印跡技術(shù)相比需要更少的細(xì)胞,且包括將全細(xì)胞沉積到顯微鏡蓋玻片上，并用含放射性或經(jīng)其他方式標(biāo)記的核酸(例如，cDNA或RNA)探針的溶液探測(cè)所述細(xì)胞的核酸含量。所述技術(shù)特別適合對(duì)來(lái)自受試者的組織活檢樣品進(jìn)行分析。原位雜交技術(shù)的實(shí)踐更詳細(xì)描述于美國(guó)專利N0.5，427，916，其公開的全部?jī)?nèi)容以引用方式并入本文。
[0117]在一個(gè)非限制性的實(shí)施例中，可以由所述核酸序列產(chǎn)生給定miR基因產(chǎn)物原位雜交的合適探針，其包括但不限于與目的miR基因產(chǎn)物至少約70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%、99%或完全互補(bǔ)的探針,如上述所。
[0118]細(xì)胞中miR基因轉(zhuǎn)錄物的相對(duì)數(shù)量還可以通過(guò)miR基因轉(zhuǎn)錄物的逆轉(zhuǎn)錄,接下來(lái)通過(guò)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的逆轉(zhuǎn)錄(RT-PCR)轉(zhuǎn)錄物的擴(kuò)增來(lái)確定。與內(nèi)標(biāo)(例如，來(lái)自存在于同一樣品的“管家”基因的mRNA水平)進(jìn)行比較來(lái)對(duì)miR基因轉(zhuǎn)錄物的水平進(jìn)行定量。用作內(nèi)標(biāo)的合適“管家”基因例如包括，肌球蛋白或甘油醛-3-磷酸脫氫酶(G3PDH)。進(jìn)行定量和半定量RT-PCR的方法，及其變化形式是本領(lǐng)域所屬的技術(shù)人員所熟知的。
[0119]在一些情況下，可能需要同時(shí)測(cè)定樣品中多種不同miR基因產(chǎn)物的表達(dá)水平。在其他情況下，可能需要測(cè)定與癌癥相關(guān)的所有已知miR基因轉(zhuǎn)錄物的表達(dá)水平。評(píng)估數(shù)百個(gè)miR基因或基因產(chǎn)物的癌癥特異性表達(dá)水平是耗時(shí)的，且需要大量的總RNA (例如，對(duì)于每個(gè)Northern印跡至少20 u g)和需要放射性同位素的放射自顯影技術(shù)。
[0120]為了克服這些限制，可以構(gòu)建微芯片形式的寡核苷酸文庫(kù)(即，微陣列)，其含有一組寡核苷酸(例如，寡脫氧核苷酸)探針，所述探針對(duì)一組miR基因具有特異性。使用所述微陣列，通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄RNA以產(chǎn)生一組靶寡脫氧核苷酸并對(duì)它們進(jìn)行雜交來(lái)探測(cè)微陣列上的寡核苷酸以產(chǎn)生雜交譜或表達(dá)譜，可以測(cè)定生物樣品中多個(gè)微小RNA的表達(dá)水平。然后比較測(cè)試樣品和對(duì)照樣品的雜交譜以測(cè)定實(shí)體癌細(xì)胞中哪個(gè)微小RNA具有改變的表達(dá)水平。
[0121]如本文所使用的，“探針寡核苷酸”或“探針寡脫氧核苷酸”指能與靶寡核苷酸雜交的寡核苷酸?！鞍泄押塑账帷被颉鞍泄衙撗鹾塑账帷敝复龣z測(cè)(例如，經(jīng)由雜交)的分子?！癿iR-特異性探針寡核苷酸”或“對(duì)miR特異性的探針寡核苷酸”指一種探針寡核苷酸，其具有經(jīng)選擇與特異性miR基因產(chǎn)物或與所述特異性miR基因產(chǎn)物的逆轉(zhuǎn)錄物雜交的序列。
[0122]具體樣品的“表達(dá)譜”或“雜交譜”本質(zhì)上為樣品狀態(tài)的指紋譜；而兩個(gè)狀態(tài)可能使任何具體基因被類似地表達(dá)，對(duì)許多基因同時(shí)進(jìn)行評(píng)價(jià)允許產(chǎn)生獨(dú)特于細(xì)胞狀態(tài)的基因表達(dá)譜。即，正常組織可能與癌(例如，腫瘤)組織不同，且可以測(cè)定癌組織中不同的預(yù)后狀態(tài)(例如，好的或差的長(zhǎng)期存活前景)。通過(guò)比較不同狀態(tài)中結(jié)腸癌組織的表達(dá)譜，獲得關(guān)于在這些狀態(tài)的每一個(gè)中哪些基因是重要的(包括基因的上調(diào)和下調(diào))的信息。在結(jié)腸癌組織中差異表達(dá)的序列的鑒定，以及導(dǎo)致不同預(yù)后結(jié)果的差異表達(dá)，允許以多種方式使用所述信息?！?br> [0123]在一個(gè)非限制性的實(shí)施例中，可以評(píng)價(jià)具體的治療方案(例如，確定化療藥物是否起到改善具體患者中長(zhǎng)期預(yù)后的作用)。類似地，可以進(jìn)行診斷或通過(guò)比較患者樣品與已知表達(dá)譜來(lái)證實(shí)。此外，這些基因表達(dá)譜(或個(gè)別基因)允許篩選抑制結(jié)腸癌表達(dá)譜或?qū)⒉畹念A(yù)后譜轉(zhuǎn)變成較好的預(yù)后譜的候選藥物。
[0124]因此，本文還提供診斷受試者是否患有結(jié)腸癌或處于發(fā)展出結(jié)腸癌風(fēng)險(xiǎn)中的方法，其包括:對(duì)來(lái)自獲自受試者的測(cè)試樣品的RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄以提供一組靶寡聚脫氧核苷酸，使所述靶寡聚脫氧核苷酸與微陣列雜交以提供測(cè)試樣品的雜交譜，所述微陣列包括miRNA特異性探針寡核苷酸，和比較測(cè)試樣品的雜交譜與對(duì)照樣品或參考標(biāo)準(zhǔn)產(chǎn)生的雜交譜，其中至少一種miRNA信號(hào)的改變指示所述受試者患有實(shí)體癌，處于發(fā)展實(shí)體癌的風(fēng)險(xiǎn)中。
[0125]在一個(gè)實(shí)施方案中，所述微陣列包括大部分的所有已知人miRNA的miRNA-特異性探針寡核苷酸。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，所述微陣列包括針對(duì)一種或多種miRNA的miRNA特異性探針寡核苷酸，所述miRNA選自由miR20a、miR-21、miR-106a、miR-181b、miR-203及其組合組成的組。
[0126]所述微陣列可以由產(chǎn)生自已知miRNA序列的基因特異性寡核苷酸探針制備。所述陣列針對(duì)每種miRNA可以包含兩種不同的寡核苷酸探針，一種包含活性、成熟的序列和另一種對(duì)所述miRNA前體具有特異性。所述陣列還可以包含對(duì)照、諸如與人直系同源物的區(qū)別僅在于幾個(gè)堿基的一種或多種小鼠序列，其可用作嚴(yán)格雜交條件的對(duì)照。還可以在微芯片上印刷來(lái)自這兩個(gè)物種的tRNA或其他RNA (例如rRNAS、mRNAS)，以提供特異性雜交的內(nèi)在的、相對(duì)穩(wěn)定的陽(yáng)性對(duì)照。還可以在所述微芯片上包括非特異性雜交的一種或多種合適對(duì)照。出于這個(gè)目的，基于不存在任何已知miRNA的任何同源來(lái)選擇序列。
[0127]可以使用本領(lǐng)域已知的技術(shù)來(lái)制備微陣列。例如，合適長(zhǎng)度的探針寡核苷酸(例如，40個(gè)核苷酸)，在C6位置為5’-胺修飾的并用商購(gòu)可得的微陣列系統(tǒng)(例如，GeneMachine 0mniGrid?100microarrayer 和 Amersham CodeLink? activated slides)進(jìn)行印刷。通過(guò)用經(jīng)標(biāo)記的引物逆轉(zhuǎn)錄靶RNA來(lái)制備對(duì)應(yīng)于靶RNA的經(jīng)標(biāo)記的cDNA低聚物。在第一鏈合成后，使RNA/DNA雜交體變性以降解RNA模板。然后，將由此制備的標(biāo)記靶cDNA在雜交條件下(例如，在25°C下6X SSPE/30%甲酰胺持續(xù)18小時(shí)，然后在37°C下在0.75XTNT (Tris HCl/NaCl/Tween20)中洗滌40分鐘)與微陣列芯片雜交。在陣列上固定的探針DNA識(shí)別樣品中互補(bǔ)的靶cDNA的位置上發(fā)生雜交。經(jīng)標(biāo)記的靶cDNA標(biāo)記所述陣列上結(jié)合發(fā)生的準(zhǔn)確位置，允許自動(dòng)檢測(cè)和定量。輸出信號(hào)由一系列雜交事件組成，指示患者樣品中特異性cDNA序列的相對(duì)豐度，從而對(duì)應(yīng)的互補(bǔ)miR的相對(duì)豐度。 [0128]根據(jù)一個(gè)實(shí)施方案，所述經(jīng)標(biāo)記的cDNA低聚物是由生物素標(biāo)記的引物制備的生物素標(biāo)記的cDNA。然后通過(guò)使用，例如，鏈親和素-Alexa647綴合物，直接檢測(cè)含生物素的轉(zhuǎn)錄物，對(duì)所述微陣列進(jìn)行操作，并利用常規(guī)掃描方法進(jìn)行掃描。陣列上每一個(gè)點(diǎn)的圖像強(qiáng)度與患者樣品中對(duì)應(yīng)miR的豐度成正比。
[0129]微陣列的使用對(duì)于miRNA表達(dá)檢測(cè)來(lái)說(shuō)具有幾個(gè)優(yōu)點(diǎn)。第一，可以同時(shí)鑒定同一樣品中幾百個(gè)基因的總表達(dá)。第二，通過(guò)仔細(xì)設(shè)計(jì)寡核苷酸探針可以鑒定成熟和前體分子的表達(dá)。第三，與Northern印跡分析相比,所述芯片需要少量的RNA,并通過(guò)使用2.5 y g總RNA提供可重復(fù)的結(jié)果。相對(duì)有限數(shù)量的miRNA (幾百個(gè)/物種)允許構(gòu)建幾個(gè)物種的共同微陣列，針對(duì)每個(gè)物種具有不同的寡核苷酸探針。所述工具允許在不同條件下分析每個(gè)已知miR的跨物種(trans-species)表達(dá)。
[0130]除了用于特異性MR的定量表達(dá)水平測(cè)試外，含有對(duì)應(yīng)于大部分miRNome (優(yōu)選全部miRNome)的miRNA特異性探針寡核苷酸的微芯片,可用來(lái)實(shí)現(xiàn)miR基因表達(dá)分析，以分析miR表達(dá)模式。不同的miR信號(hào)可以與已確定的疾病標(biāo)記物，或直接與疾病狀態(tài)相關(guān)。
[0131]根據(jù)本文所述的表達(dá)分析方法，來(lái)自懷疑患有結(jié)腸癌相關(guān)疾病的受試者的樣品的總RNA被定量逆轉(zhuǎn)錄以提供一組與樣品中所述RNA互補(bǔ)的經(jīng)標(biāo)記的靶寡脫氧核苷酸。然后，所述靶寡脫氧核苷酸與包括miRNA特異性探針寡核苷酸的微陣列雜交以提供樣品的雜交譜。所述結(jié)果是代表樣品中miRNA表達(dá)模式的樣品雜交譜。所述雜交譜包括來(lái)自樣品的所述靶寡脫氧核苷酸與微陣列中所述miRNA特異性探針寡核苷酸結(jié)合的信號(hào)。所述譜可被記錄為存在或不存在結(jié)合(信號(hào)相對(duì)零信號(hào))。
[0132]更優(yōu)選地，所記錄的譜包括每個(gè)雜交信號(hào)的強(qiáng)度。比較所述譜與正常(即，非癌)對(duì)照樣品產(chǎn)生的雜交譜。信號(hào)的改變指示受試者中存在或傾向于發(fā)展癌癥。
[0133]測(cè)量miR基因表達(dá)的其他技術(shù)也在本領(lǐng)域的技術(shù)范圍內(nèi)，包括測(cè)量RNA轉(zhuǎn)錄和降解速率的各種技術(shù)。
[0134]本文還提供確定患有結(jié)腸癌的受試者預(yù)后的方法，包括測(cè)量來(lái)自所述受試者的測(cè)試樣品中至少一種miR基因產(chǎn)物的水平，其與結(jié)腸癌相關(guān)疾病中的具體預(yù)后(例如，好的或良性預(yù)后，差的或不良預(yù)后)相關(guān)。
[0135]根據(jù)這些方法，與對(duì)照樣品中對(duì)應(yīng)miR基因產(chǎn)物水平相比，與測(cè)試樣品中具體預(yù)后相關(guān)的miR基因產(chǎn)物水平的改變指示所述受試者患有具有具體預(yù)后的實(shí)體癌。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述miR基因產(chǎn)物與不良(即，差的)預(yù)后相關(guān)。不良預(yù)后的實(shí)例包括，但不限于低存活率和快速疾病進(jìn)展。在某些實(shí)施方案中，通過(guò)對(duì)來(lái)自獲自受試者的測(cè)試樣品的RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄以提供一組靶寡聚脫氧核苷酸，使所述靶寡聚脫氧核苷酸與微陣列雜交以提供所述測(cè)試樣品的雜交譜，所述微陣列包括miRNA特異性探針寡核苷酸，并比較測(cè)試樣品的雜交譜與對(duì)照樣品產(chǎn)生的雜交譜來(lái)測(cè)量所述至少一種miR基因產(chǎn)物的水平。
[0136]不希望受任何理論限制，認(rèn)為細(xì)胞中一種或多種miR基因產(chǎn)物水平的改變能導(dǎo)致這些miR的一個(gè)或多個(gè)目標(biāo)靶的失調(diào)，其能導(dǎo)致實(shí)體癌的形成。因此，改變所述miR基因產(chǎn)物的水平(例如，通過(guò)降低在實(shí)體癌細(xì)胞中被上調(diào)的miR基因產(chǎn)物的水平，或增加在實(shí)體癌細(xì)胞中被下調(diào)的miR基因產(chǎn)物的水平)可以成功地治療所述實(shí)體癌。
[0137]因此，本文進(jìn)一步提供抑制患有或懷疑患有實(shí)體癌的受試者中腫瘤形成的方法，其中在所述受試者的癌細(xì)胞中至少一種miR基因產(chǎn)物失調(diào)(例如，下調(diào)、上調(diào))。如果在所述癌細(xì)胞中所述至少一種分離的miR基因產(chǎn)物(例如，miR-21)是被下調(diào)的，所述方法包括施用有效量的所述至少一種分離的miR基因產(chǎn)物、或其分離的變體或生物活性片段，從而抑制所述受試者中癌細(xì)胞增殖。
[0138]例如,如果miR基因產(chǎn)物在受試者的癌細(xì)胞中是被下調(diào)的,給所述受試者施用有效量的分離的miR基因產(chǎn)物可以抑制所述癌細(xì)胞增殖。給所述受試者施用的分離的miR基因產(chǎn)物與在癌細(xì)胞中被下調(diào)的內(nèi)源性野生型miR基因產(chǎn)物(例如，miR基因產(chǎn)物)一致，或可以是其變體或生物活性片段。
[0139]如本文所定義的，miR基因產(chǎn)物的“變體”指與對(duì)應(yīng)的野生型miR基因產(chǎn)物具有低于100%同一性的miRNA并具有對(duì) 應(yīng)野生型miR基因產(chǎn)物的一種或多種生物活性。所述生物活性的實(shí)例包括，但不限于，抑制靶RNA分子的表達(dá)(例如，抑制靶RNA分子的翻譯、調(diào)節(jié)靶RNA分子的穩(wěn)定性、抑制靶RNA分子的加工)和抑制與實(shí)體癌相關(guān)的細(xì)胞過(guò)程(例如，細(xì)胞分化、細(xì)胞生長(zhǎng)、細(xì)胞死亡)。這些變體包括物種變體和由miR基因中一個(gè)或多個(gè)突變(例如，置換、刪除、插入)導(dǎo)致的變體。在某些實(shí)施方案中，所述變體與對(duì)應(yīng)野生型miR基因產(chǎn)物至少具有約 70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%、或 99% 的同一性。
[0140]如本文所定義的，miR基因產(chǎn)物的“生物活性片段”指miR基因產(chǎn)物的RNA片段，其具有對(duì)應(yīng)野生型miR基因產(chǎn)物的一種或多種生物活性。如上所述,所述生物活性的實(shí)例包括，但不限于，抑制靶RNA分子的表達(dá)和抑制與結(jié)腸癌相關(guān)的細(xì)胞過(guò)程。在某些實(shí)施方案中，所述生物活性片段的長(zhǎng)度至少為約5、7、10、12、15或17個(gè)核苷酸。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，分離的miR基因產(chǎn)物可以與一種或多種其他抗癌治療聯(lián)合施用于受試者。合適的抗癌治療包括，但不限于，化學(xué)療法、放射療法及其組合(例如,化放療(chemoradiation))。
[0141]如果所述至少一種分離的miR基因產(chǎn)物在所述癌細(xì)胞中是被上調(diào)的，所述方法包括給受試者施用有效量的至少一種用于抑制所述至少一種miR基因產(chǎn)物表達(dá)的化合物，本文稱為miR基因表達(dá)抑制化合物，從而抑制實(shí)體癌細(xì)胞增殖。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，所述至少一種miR表達(dá)抑制化合物對(duì)miR基因產(chǎn)物具有特異性，所述miR基因產(chǎn)物選自由miR20a、miR-21、miR_106a、miR_181b、miR-203 及其組合組成的組。
[0142]miR基因表達(dá)抑制性化合物可以與一種或多種其他抗癌治療聯(lián)合施用于受試者。合適的抗癌治療包括，但不限于，化學(xué)療法、放射療法及其組合(例如，化放療)。
[0143]術(shù)語(yǔ)“治療(treat) “治療(treating) ”和“治療(treatment) ”,如本文所使用的，指緩解與疾病或病癥(例如，實(shí)體癌)相關(guān)的癥狀，包括預(yù)防或延遲疾病癥狀的發(fā)作，和/或減輕疾病或病癥癥狀的嚴(yán)重性或頻率。本文定義術(shù)語(yǔ)“受試者(subject)”^患者(patient)”和“個(gè)體(individual)”包括動(dòng)物,諸如哺乳動(dòng)物,包括,但不限于靈長(zhǎng)類動(dòng)物、牛、綿羊、山羊、馬、狗、貓、兔、豚鼠、大鼠、小鼠或其他?？?、羊科、馬科、犬科、貓科、嚙齒動(dòng)物或鼠科類。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述動(dòng)物是人。
[0144]如本文所使用的，分離的miR基因產(chǎn)物的“有效量”是指足以抑制遭受實(shí)體癌的受試者中癌細(xì)胞增殖的量。通過(guò)考慮因素，諸如受試者的尺寸和體重、疾病入侵的程度、受試者的年齡、健康和性別、給藥途徑以及給藥是局部的或全身的，本領(lǐng)域的技術(shù)人員能容易地確定給給定受試者施用的miR基因產(chǎn)物的有效量。
[0145]例如，分離的miR基因產(chǎn)物的有效量可以基于待治療的瘤塊的近似重量。瘤塊的近似重量可以通過(guò)計(jì)算所述瘤塊的近似體積確定，其中一立方厘米體積大約相當(dāng)于lg?；诹鰤K重量，分離的miR基因產(chǎn)物的有效量可以在約10-500 ii g/g瘤塊的范圍內(nèi)。在某些實(shí)施方案中，所述瘤塊至少可以是約IOii g/g瘤塊、至少大約60ii g/g瘤塊或至少大約IOOii g/g 瘤塊。
[0146]分離的miR基因產(chǎn)物的有效量還可以基于待治療的受試者的近似或估算體重。優(yōu)選地，如本文所述，所述有效量可以腸胃外或腸內(nèi)給藥。例如，給受試者施用的分離的miR基因產(chǎn)物的有效量可以在約5-3000ii g/kg體重、約700-1000 y g/kg體重、或大于約1000 u g/kg體重的范圍內(nèi)。
[0147]本領(lǐng)域的技術(shù)人員還可以容易地`確定給給定受試者施用分離的miR基因產(chǎn)物的合適給藥方案。例如，可以一次給所述受試者施用miR基因產(chǎn)物{例如，以單一注射或沉積(deposition))?；蛘?可以給受試者施用miR基因產(chǎn)物一天一次或兩次,持續(xù)約3_28天,更具體地約7-10天的周期。在一個(gè)具體的給藥方案中，施用miR基因產(chǎn)物一天一次，持續(xù)7天。在給藥方案包括多次施用的情況下，應(yīng)理解給受試者施用的分離的miR基因產(chǎn)物的有效量可以包括整個(gè)給藥方案中施用的基因產(chǎn)物的總量。
[0148]如本文所使用的，“分離的”miR基因產(chǎn)物是指合成的、或從天然狀態(tài)通過(guò)人干預(yù)改變或提取的基因產(chǎn)物。例如，認(rèn)為合成的miR基因產(chǎn)物、或部分或完全分離自其天然狀態(tài)的共存材料的miR基因產(chǎn)物是“分離的”。分離的miR基因產(chǎn)物可以以基本上純的形式存在，或可以存在于所述miR基因產(chǎn)物被遞送到的細(xì)胞中。因此，有意地被遞送到細(xì)胞或在細(xì)胞中表達(dá)的miR基因產(chǎn)物被認(rèn)為是“分離的”miR基因產(chǎn)物。在細(xì)胞內(nèi)從miR前體分子產(chǎn)生的miR基因產(chǎn)物也被認(rèn)為是“分離的”分子。根據(jù)一個(gè)具體的實(shí)施方案，本文所描述的分離的miR基因產(chǎn)物可用于制備藥物，所述藥物用于治療受試者(例如，人)的實(shí)體癌。
[0149]使用許多標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)可以獲得分離的miR基因產(chǎn)物。例如，使用本領(lǐng)域中已知的方法可以化學(xué)合成或重組產(chǎn)生miR基因產(chǎn)物。在一個(gè)實(shí)施方案中，使用適當(dāng)保護(hù)的核糖核苷酸亞磷酰胺和常規(guī)的DNA/RNA合成儀化學(xué)合成miR基因產(chǎn)物。合成的RNA分子或合成試劑的商品供應(yīng)商例如包括，Proligo (Hamburg, Germany)、Dharmacon Research (Lafayette,CO, U.S.A.)、Pierce Chemical (part of Perbio Science, Rockford, IL, U.S.A.)、GlenResearch (Sterling, VA,U.S.A.)、ChemGenes (Ashland,MA,U.S.A.)和 Cruachem(Glasgow,UK)。
[0150]或者，可以使用任何合適的啟動(dòng)子從重組的環(huán)狀或線性DNA質(zhì)粒表達(dá)所述miR基因產(chǎn)物。用于從質(zhì)粒表達(dá)RNA的合適啟動(dòng)子例如包括，U6或Hl RNApol III啟動(dòng)子序列，或細(xì)胞巨化病毒啟動(dòng)子。其他合適啟動(dòng)子的選擇是在本領(lǐng)域技術(shù)范圍內(nèi)的。本發(fā)明的重組質(zhì)粒還可以包括用于在癌細(xì)胞中表達(dá)miR基因產(chǎn)物的誘導(dǎo)型或調(diào)節(jié)型啟動(dòng)子。
[0151]可由重組質(zhì)粒表達(dá)的miR基因產(chǎn)物可以通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)從培養(yǎng)的細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)中分離出來(lái)。由重組質(zhì)粒表達(dá)的miR基因產(chǎn)物還可以被遞送至癌細(xì)胞中，并直接在癌細(xì)胞中表達(dá)。在下面將更詳細(xì)討論使用重組質(zhì)粒將miR基因產(chǎn)物遞送至癌細(xì)胞中。
[0152]所述miR基因產(chǎn)物可以由分開的重組質(zhì)粒表達(dá)，或它們可以由相同的重組質(zhì)粒表達(dá)。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述miR基因產(chǎn)物在單一質(zhì)粒中被表達(dá)為RNA前體分子，并且所述前體分子被合適的加工系統(tǒng)加工成功能性miR基因產(chǎn)物，所述加工系統(tǒng)包括但不限于癌細(xì)胞中現(xiàn)存(extant)的加工系統(tǒng)。其他合適的加工系統(tǒng)例如包括，體外果蠅細(xì)胞裂解系統(tǒng)(例如，如在Tuschl等人的美國(guó)公開的專利申請(qǐng)N0.2002/0086356中所述的，其公開的全部?jī)?nèi)容以引用方式并入本文)和大腸桿菌RNAse III系統(tǒng)(例如，如在Yang等人的美國(guó)公開的專利申請(qǐng)N0.2004/0014113中所述的，其公開的全部?jī)?nèi)容以引用方式并入本文)。
[0153]適合表達(dá)miR基因產(chǎn)物的質(zhì)粒的選擇，將核酸序列插入到質(zhì)粒中以表達(dá)所述基因產(chǎn)物的方法，和將重組質(zhì)粒遞送到目的細(xì)胞中的方法是在本領(lǐng)域技術(shù)范圍內(nèi)的。例如參見(jiàn)，Zeng 等(2002)，Molecular Cell9:1327-1333 ；Tuschl (2002), Nat.Biotechnol,20:446-448;Brummelkamp 等(2002)，Science296:550-553 ；Miyagishi 等(2002)，Nat.Biotechnol.20:497-500 ；Paddison 等(2002)，Genes Dev.16:948-958 ；Lee 等(2002)，Nat.Biotechnol.20:500-505 ;和 Paul 等(2002)，Nat.Biotechnol.20:505_508，其公開的全部?jī)?nèi)容以引用方式并入本文。
[0154]在一個(gè)實(shí)施方案中，表達(dá)所述miR基因產(chǎn)物的質(zhì)粒包含在CMV中間體早期啟動(dòng)子(CMV intermediate-early promoter)的控制下編碼miR前體RNA的序列。如本文所使用的，啟動(dòng)子的“控制下”指編碼所述miR基因產(chǎn)物的核酸序列被定位在啟動(dòng)子的3'，使得所述啟動(dòng)子能引發(fā)miR基因產(chǎn)物編碼序列的轉(zhuǎn)錄。
[0155]還可以由重組病毒載體表達(dá)所述miR基因產(chǎn)物。預(yù)期所述miR基因產(chǎn)物可以由兩個(gè)分開的重組病毒載體表達(dá)，或由相同的病毒載體表達(dá)。由重組病毒載體表達(dá)的RNA可以通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)分離自培養(yǎng)的細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)，或可以在癌細(xì)胞中被直接表達(dá)。在下面將更詳細(xì)討論重組病毒載體將所述miR基因產(chǎn)物遞送至癌細(xì)胞中的使用。
[0156]本發(fā)明的重組病毒載體包括編碼所述miR基因產(chǎn)物的序列和任何用于表達(dá)所述RNA序列的合適啟動(dòng)子。合適的啟動(dòng)子包括,但不限于U6或Hl RNApol III啟動(dòng)子序列或細(xì)胞巨化病毒啟動(dòng)子。其他合適啟動(dòng)子的選擇是在本領(lǐng)域技術(shù)范圍內(nèi)的。本發(fā)明的重組病毒載體還可以包括用于在癌細(xì)胞中表達(dá)miR基因產(chǎn)物的誘導(dǎo)型或調(diào)節(jié)型啟動(dòng)子。
[0157]可以使用能接受所述miR基因產(chǎn)物的編碼序列的任何病毒載體；例如，衍生自腺病毒(AV)、腺相關(guān)病毒(AAV)、逆轉(zhuǎn)錄酶病毒(例如，慢病毒(LV)、棒狀病毒、鼠白血病病毒)、皰疹病毒等的載體?？梢酝ㄟ^(guò)用來(lái)自其他病毒的衣殼蛋白或其他表面抗原假型包裝載體，或通過(guò)置換不同的病毒殼體蛋白(如果合適的話)來(lái)改變所述病毒載體的向性(tropism)。
[0158]例如，本發(fā)明的慢病毒載體用來(lái)自水泡性口炎病毒(VSV)、狂犬病、埃博拉病毒(Ebola)、Mokola等的表面蛋白進(jìn)行假型包裝。通過(guò)改造載體以表達(dá)不同的衣殼蛋白血清型，可以使本發(fā)明的AAV載體靶向不同的細(xì)胞。例如，在血清2型基因組上表達(dá)血清2型衣殼的AAV載體被稱為AAV2/2。在AAV2/2載體中這種血清2型衣殼基因能被血清5型衣殼基因替代以產(chǎn)生AAV2/5載體。構(gòu)建表達(dá)不同衣殼蛋白血清型的AAV載體的技術(shù)在本領(lǐng)域技術(shù)的范圍內(nèi)；例如參見(jiàn)，Rabinowitz, J.E.，等(2002)，J.Virol.76:791_801，其公開的全部?jī)?nèi)容以引用方式并入本文。[0159]適用于本發(fā)明的重組病毒載體的選擇，將表達(dá)RNA的核酸序列插入到所述載體中的方法，將病毒載體遞送至目的細(xì)胞的方法，和所表達(dá)的RNA產(chǎn)物的回收是在本領(lǐng)域技術(shù)范圍內(nèi)的。例如參見(jiàn)，Dornburg (1995), Gene Therapy2:301-310;Eglitis (1988),Biotechniques 6:608-614;Miller (1990), Hum.Gene Therapyl:5-14;and Anderson(1998)，Nature392:25_30，其公開的全部?jī)?nèi)容以引用方式并入本文。
[0160]特別適合的病毒載體是衍生自AV和AAV的那些。表達(dá)所述miR基因產(chǎn)物的合適AV載體，構(gòu)建所述重組AV載體的方法，和將所述載體遞送至靶細(xì)胞的方法描述于Xia等(2002)，Nat.Biotech.20:1006_1010，其公開的全部?jī)?nèi)容以引用方式并入本文。表達(dá)miR基因產(chǎn)物的合適AAV載體，構(gòu)建所述重組AAV載體的方法，和將所述載體遞送至靶細(xì)胞的方法描述于 Samulski 等(1987)，J.Virol.61:3096-3101;Fisher 等(1996)，J.Virol.,70:520-532 ；Samulski 等(1989)，J.Virol.63:3822-3826 ;美國(guó)專利 N0.5252479 ;美國(guó)專利N0.5，139,941 ;國(guó)際專利申請(qǐng)N0.W094/13788 ;和國(guó)際專利申請(qǐng)N0.W093/24641，其公開的全部?jī)?nèi)容以引用方式并入本文。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述miR基因產(chǎn)物表達(dá)自包含CMV中間體早期啟動(dòng)子的單一重組AAV載體。
[0161]在某一實(shí)施方案，本發(fā)明重組AAV病毒載體包含在人U6RNA啟動(dòng)子的控制下，與PolyT終止序列可操作連接的、編碼miR前體RNA的核酸序列。如本文所使用的，“與polyT終止序列可操作連接”指編碼正義或反義鏈的核酸序列與5’方向的polyT終止信號(hào)直接相鄰。在從載體轉(zhuǎn)錄miR序列期間，polyT終止信號(hào)起終止轉(zhuǎn)錄的作用。
[0162]在本發(fā)明治療方法的其他實(shí)施方案中，可以給所述受試者施用有效量的至少一種抑制miR表達(dá)的化合物。如本文所使用的，“抑制miR表達(dá)”指治療后miR基因產(chǎn)物的前體和/或活性、成熟形式的產(chǎn)生低于治療前產(chǎn)生的量。例如使用上面關(guān)于診斷方法所討論的測(cè)定miR轉(zhuǎn)錄水平的技術(shù)，本領(lǐng)域的技術(shù)人員能容易地確定癌細(xì)胞中miR的表達(dá)是否受到抑制。抑制在基因表達(dá)水平上(即，通過(guò)抑制編碼miR基因產(chǎn)物的miR基因的轉(zhuǎn)錄)或在加工水平上(例如，通過(guò)抑制將miR前體加工成成熟、活性的miR)發(fā)生。
[0163]如本文所使用的，抑制miR表達(dá)的化合物的“有效量”是指足以抑制遭受癌癥(例如，結(jié)腸癌)的受試者中癌細(xì)胞增殖的量。通過(guò)考慮因素，諸如受試者的尺寸和體重、疾病入侵的程度、受試者的年齡、健康和性別、給藥途徑以及給藥是局部的或全身的，本領(lǐng)域的技術(shù)人員能容易地確定給給定受試者施用的miR表達(dá)抑制化合物的有效量。
[0164]例如，如本文所述，所述表達(dá)抑制化合物的有效量可以基于待治療瘤塊的近似重量。如本文所述，抑制miR表達(dá)的化合物的有效量還可以基于待治療受試者的近似或估算體重。
[0165]本領(lǐng)域的技術(shù)人員還可以容易地確定給給定受試者施用抑制miR表達(dá)的化合物的合適給藥方案。
[0166]抑制miR基因表達(dá)的合適化合物包括雙鏈RNA (諸如短或小的干擾RNA或“siRNA”)，反義核酸和酶促RNA分子(諸如核酶)。這些化合物的每一個(gè)可以靶向給定miR基因產(chǎn)物并干擾靶miR基因產(chǎn)物的表達(dá)(例如，抑制靶miR基因產(chǎn)物翻譯、誘導(dǎo)靶miR基因產(chǎn)物的切割或破壞)。
[0167]例如，通過(guò)用分離的雙鏈RNA (“dsRNA”)分子誘導(dǎo)對(duì)miR基因的RNA干擾，可以抑制給定miR基因的表達(dá)，所述雙鏈RNA分子與所述miR基因產(chǎn)物的至少一部分具有至少90 %，例如至少95 %、至少98 %、至少99 %或100 %的序列同一性。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，所述dsRNA分子是“短或小的干擾RNA”或“siRNA”。
[0168]本發(fā)明方法中有用的siRNA包括長(zhǎng)度為約17個(gè)核苷酸至約29個(gè)核苷酸的短雙鏈RNA,優(yōu)選長(zhǎng)度為約19至約25個(gè)核苷酸。所述siRNA包括一個(gè)正義RNA鏈和一個(gè)互補(bǔ)的反義RNA鏈，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)的Watson-Crick堿基配對(duì)相互作用(以下稱為”堿基配對(duì)”)退火在一起。正義鏈包括與包含在所述靶miR基因產(chǎn)物內(nèi)的核酸序列基本一致的核酸序列。
[0169]如本文所使用的，在siRNA中與包含在所述靶mRNA基因產(chǎn)物內(nèi)的核酸序列“基本一致”的核酸序列是與所述靶序列一致或與所述靶序列區(qū)別在于一個(gè)或兩個(gè)核苷酸的核酸序列。siRNA的正義鏈和反義鏈可包括兩個(gè)互補(bǔ)的單鏈RNA分子，或可包括其中兩個(gè)互補(bǔ)部分通過(guò)單鏈“發(fā)夾”區(qū)堿基配對(duì)和共價(jià)連接的單一分子。
[0170]所述siRNA還可以是改變的RNA，其通過(guò)添加、刪除、置換和/或改變一個(gè)或多個(gè)核苷酸而不同于天然存在的RNA。所述改變可包括諸如將非核苷酸材料添加到所述siRNA的端上或所述siRNA的一個(gè)或多個(gè)內(nèi)部核苷酸上，或使siRNA對(duì)核酸酶消化具有抗性的修飾，或用脫氧核糖核苷酸置換所 述siRNA中的一個(gè)或多個(gè)核苷酸。
[0171]所述siRNA的一條或兩條鏈還可以包含一個(gè)3’突出端。如本文所使用的，“3’突出端”指延伸自雙重RNA鏈的3’-端的至少一個(gè)未配對(duì)的核苷酸。因此，在某些實(shí)施方案中，所述siRNA包括至少一個(gè)長(zhǎng)度為I至約6個(gè)核苷酸(其包括核糖核苷酸或脫氧核糖核苷酸)，長(zhǎng)度為I至約5個(gè)核苷酸,長(zhǎng)度為I至約4個(gè)核苷酸,或長(zhǎng)度為約2至約4個(gè)核苷酸的3’突出端。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，所述3’突出端存在于所述siRNA的兩條鏈，且長(zhǎng)度為2個(gè)核苷酸。例如，所述siRNA的每一條鏈可包括二胸苷酸(“TT”)或二尿苷酸(“uu”)的3關(guān)出立而。
[0172]如上面關(guān)于所述分離的miR基因產(chǎn)物的描述，所述siRNA可以化學(xué)或生物制備，或可以由重組質(zhì)粒或病毒載體表達(dá)。制備和測(cè)試dsRNA或siRNA分子的示例性方法描述于Gewirtz的美國(guó)公開的專利申請(qǐng)N0.2002/0173478和Reich等人的美國(guó)公開的專利申請(qǐng)N0.2004/0018176，兩者公開的全部?jī)?nèi)容以引用方式并入本文。
[0173]給定miR基因的表達(dá)還可以被反義核酸抑制。如本文所使用的，“反義核酸”指通過(guò)RNA-RNA、RNA-DNA或RNA-肽核酸相互作用的方式與靶RNA結(jié)合的核酸分子，其改變所述靶RNA的活性。適用于本發(fā)明方法的反義核酸是單鏈核酸(例如，RNA、DNA、RNA-DNA嵌合體、肽核酸(PNA))，其通常包含與miR基因產(chǎn)物中連續(xù)核酸序列互補(bǔ)的核酸序列。所述反義核酸可包含與miR基因產(chǎn)物中連續(xù)核酸序列50-100%互補(bǔ)、75-100%互補(bǔ)、或95-100%互補(bǔ)的核酸序列。
[0174]不希望受任何理論限制，認(rèn)為所述反義核酸激活RNase H或另一個(gè)消化所述miR基因產(chǎn)物/反義合適雙鏈體的細(xì)胞核酸酶。
[0175]反義核酸還可含有對(duì)所述核酸骨架或?qū)μ呛蛪A基部分(或其等價(jià)物)的修飾以增強(qiáng)靶特異性、核酸酶抗性、與分子功效相關(guān)的遞送或其他性質(zhì)。所述修飾包括膽固醇部分、雙鏈嵌入劑(諸如，吖啶)，或一種或多種抗核酸酶基團(tuán)。
[0176]如上面關(guān)于所述分離的miR基因產(chǎn)物的描述，反義核酸可以化學(xué)或生物制備，或可以由重組質(zhì)?；虿《据d體表達(dá)。示例性的制備和測(cè)試方法是在本領(lǐng)域的技術(shù)范圍內(nèi)的；例如參見(jiàn)，Stein and Cheng (1993), Science261:1004 和 Woolf 等的美國(guó)專利N0.5，849，902，其公開的全部?jī)?nèi)容以引用方式并入本文。
[0177]給定miR基因的表達(dá)還可以被酶促核酸抑制。如本文所使用的，“酶促核酸”指包含與miR基因產(chǎn)物的連續(xù)核酸序列互補(bǔ)的底物結(jié)合區(qū)的核酸，且其能特異性切割miR基因產(chǎn)物。所述酶促核酸底物結(jié)合區(qū)例如可以與miR基因產(chǎn)物中的連續(xù)核酸序列50-100%互補(bǔ)、75-100%互補(bǔ)、或95-100%互補(bǔ)。所述酶促核酸還可在堿基、糖和/或磷酸基團(tuán)處包含修飾。用于本發(fā)明方法的示例性酶促核酸是核酶。
[0178]如上面關(guān)于分離的miR基因產(chǎn)物的描述，所述酶促核酸可以化學(xué)或生物制備，或可以由重組質(zhì)?；虿《据d體表達(dá)。制備和測(cè)試dsRNA或siRNA分子的示例性方法描述于 Werner 和 Uhlenbeck (1995), Nucl.Acids Res.23:2092-96;Hammann 等人(1999)，Antisense and Nucleic Acid Drug Dev.9:25-31 ;和 Cech 等的美國(guó)專利 N0.4，987，071,其公開的全部?jī)?nèi)容以引用 方式并入本文。
[0179]施用至少一種miR基因產(chǎn)物或至少一個(gè)抑制miR表達(dá)的化合物將抑制在患有實(shí)體癌的受試者中癌細(xì)胞增殖。如本文所使用的，“抑制癌細(xì)胞增殖”指殺死所述細(xì)胞、或長(zhǎng)期或臨時(shí)妨礙或減慢所述細(xì)胞的生長(zhǎng)。如果在施用所述miR基因產(chǎn)物或miR基因表達(dá)抑制化合物后，受試者中所述細(xì)胞的數(shù)量維持不變或降低，可以推定癌細(xì)胞增殖的抑制。如果所述細(xì)胞的絕對(duì)數(shù)量增加但腫瘤的生長(zhǎng)速率降低，也可以推定癌細(xì)胞增殖的抑制。
[0180]受試者體內(nèi)的癌細(xì)胞數(shù)量可以通過(guò)直接測(cè)量，或通過(guò)根據(jù)原發(fā)性或轉(zhuǎn)移性瘤塊的大小估計(jì)測(cè)定。例如，受試者中癌細(xì)胞的數(shù)量可以通過(guò)免疫組織學(xué)方法，流式細(xì)胞儀，或其他設(shè)計(jì)用于檢測(cè)癌細(xì)胞特征表面標(biāo)記物的技術(shù)進(jìn)行測(cè)量。
[0181]瘤塊的大小可以通過(guò)直接目測(cè)法、或通過(guò)診斷顯像方法(諸如，X-射線、核磁共振成像、超聲波和閃爍掃描法)確定。如本領(lǐng)域已知的，用于確定瘤塊大小的診斷顯像方法-可以與或不與造影劑一起使用。瘤塊的大小還可以通過(guò)物理手段(諸如組織塊的觸診或用測(cè)量?jī)x器(如卡鉗)測(cè)量組織塊)確定。
[0182]可以通過(guò)任何適合給受試者的癌細(xì)胞遞送這些化合物的方式給受試者施用所述miR基因產(chǎn)物或miR基因表達(dá)抑制化合物。例如，可以通過(guò)適合用這些化合物或用包括編碼這些化合物的序列的核酸轉(zhuǎn)染受試者細(xì)胞的方法施用所述miR基因產(chǎn)物或miR表達(dá)抑制化合物。
[0183]在一個(gè)實(shí)施方案中，用包含編碼至少一種miR基因產(chǎn)物或miR基因表達(dá)抑制化合物的序列的質(zhì)?；虿《据d體轉(zhuǎn)染所述細(xì)胞。
[0184]真核細(xì)胞的轉(zhuǎn)染方法是本領(lǐng)域所熟知的，例如包括，將所述核酸直接注入細(xì)胞的核或原核中；電穿孔；脂質(zhì)體轉(zhuǎn)移或親脂性材料介導(dǎo)的轉(zhuǎn)移；受體介導(dǎo)的核酸遞送、生物彈道(bioballistic)或粒子加速；磷酸沉淀，和病毒載體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染。
[0185]例如，用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)移化合物例如，DOTAP (N-[l- (2，3_ 二油?；趸?丙基]_N, N, N-三甲基-甲基硫酸銨,Boehringer-Mannheim)或等價(jià)物(諸如LIPOFECTIN)轉(zhuǎn)染細(xì)胞。所使用的核酸的量對(duì)本發(fā)明實(shí)踐來(lái)說(shuō)不是關(guān)鍵的；用0.1-1OOii g核酸/IO5細(xì)胞可獲得可接受的結(jié)果。例如，可以使用在3iig D0TAP/105細(xì)胞中約0.5iig質(zhì)粒載體的比例。
[0186]還可以通過(guò)任何合適的腸內(nèi)或腸胃外施用途徑給受試者施用miR基因產(chǎn)物或miR基因表達(dá)抑制化合物。本發(fā)明方法的合適腸內(nèi)施用途徑例如包括，口服、直腸或鼻內(nèi)遞送。合適的腸胃外施用途徑例如包括，血管內(nèi)施用(例如，靜脈內(nèi)推注、靜脈內(nèi)輸注、動(dòng)脈內(nèi)推注、動(dòng)脈內(nèi)輸注和導(dǎo)管灌注到脈管系統(tǒng)中)；組織周圍和組織內(nèi)注射(例如,腫瘤周圍和腫瘤內(nèi)注射、視網(wǎng)膜內(nèi)注射、或視網(wǎng)膜下注射)；皮下注射或沉積，包括皮下輸注(諸如通過(guò)滲透泵)；直接施用到目的組織；例如通過(guò)導(dǎo)管或其他敷設(shè)裝置(例如，視網(wǎng)膜丸?；蛩▌┗虬ǘ嗫?、無(wú)孔或凝膠材料的植入物);和吸入。特別合適的施用途徑是注射、輸注和直接注射到腫瘤中。
[0187]在本發(fā)明的方法中，miR基因產(chǎn)物或miR基因產(chǎn)物表達(dá)抑制化合物可以以裸RNA，或與遞送劑組合，或以包含表達(dá)所述miR基因產(chǎn)物或miR基因產(chǎn)物表達(dá)抑制化合物的序列的核酸(例如，重組質(zhì)?；虿《据d體)給受試者施用。合適的遞送劑例如包括，Mirus TransitTKO親脂試劑；脂質(zhì)轉(zhuǎn)染(Iipofectin);脂質(zhì)轉(zhuǎn)染胺(lipofectamine) ;cellfectin ;聚陽(yáng)離子(例如，聚賴氨酸)和脂質(zhì)體。
[0188]包含表達(dá)所述miR基因產(chǎn)物或miR基因產(chǎn)物表達(dá)抑制化合物的序列的重組質(zhì)粒和病毒載體，和將所述質(zhì)粒和載體遞送至癌細(xì)胞的技術(shù)如本文所討論的和/或在本領(lǐng)域中是熟知的。
·[0189]在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，使用脂質(zhì)體將miR基因產(chǎn)物或miR基因表達(dá)抑制化合物(或包括編碼它們的序列的核酸)遞送到受試者中。脂質(zhì)體還可以增加所述基因產(chǎn)物或核酸的血液半衰期。用于本發(fā)明的合適脂質(zhì)體可以由標(biāo)準(zhǔn)微泡形成脂形成，其通過(guò)包括中性或帶負(fù)電的磷酸脂和固醇，諸如膽固醇。脂質(zhì)的選擇通常通過(guò)考慮因素，諸如所需脂質(zhì)體的大小和血液中所述脂質(zhì)體的半衰期來(lái)進(jìn)行指導(dǎo)。已知許多制備脂質(zhì)體的方法例如，如Szoka等(1980)，Ann.Rev.Biophys.Bioeng.9:467 ;和美國(guó)專利 Nos.4，235，871、4，501，728、4，837，028和5，019，369中所描述的，其公開的全部?jī)?nèi)容以引用方式并入本文。
[0190]用于本發(fā)明方法的脂質(zhì)體可包括使脂質(zhì)體靶向癌細(xì)胞的配體分子。優(yōu)選與癌細(xì)胞中普遍存在的受體結(jié)合的配體，諸如與腫瘤細(xì)胞抗原結(jié)合的單克隆抗體。
[0191]還可以修飾用于本發(fā)明方法的脂質(zhì)體以避免被單核巨噬細(xì)胞系統(tǒng)(“麗S”)和網(wǎng)狀內(nèi)皮組織系統(tǒng)(“RES”)清除。如此修飾的脂質(zhì)體在表面上具有調(diào)理抑制(opsonization-1nhibition)部分或使調(diào)理抑制部分整合到所述脂質(zhì)體結(jié)構(gòu)中。在一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的脂質(zhì)體可包括調(diào)理抑制部分和配體。
[0192]用于制備本發(fā)明脂質(zhì)體的調(diào)理抑制部分典型地為與脂質(zhì)體膜結(jié)合的大的親水聚合物。如本文所使用的，當(dāng)調(diào)理抑制部分與膜化學(xué)或物理連接時(shí)(例如，通過(guò)將脂溶性錨插入膜自身中，或通過(guò)直接與膜脂的活性基團(tuán)結(jié)合)，調(diào)理抑制部分與脂質(zhì)體膜“結(jié)合”。這些調(diào)理抑制親水聚合物形成保護(hù)的表面層，其通過(guò)MMS和RES顯著降低所述脂質(zhì)體的攝?。焕?，如在美國(guó)專利N0.4,920,016中所描述的，其公開的全部?jī)?nèi)容以引用方式并入本文。
[0193]適合修飾脂質(zhì)體的調(diào)理抑制部分優(yōu)選是數(shù)均分子量?jī)?yōu)選為約500-40000道爾頓，和更優(yōu)選為約2000-20000道爾頓的水溶性聚合物。所述聚合物包括聚乙二醇(PEG)或聚丙二醇(PPG)衍生物；例如，甲氧基PEG或PPGJP PEG或PPG硬脂酸脂；合成聚合物，諸如聚丙烯酰胺或聚N-乙烯吡咯烷酮；直鏈、支鏈或樹枝狀聚酰氨基胺；聚丙烯酸；多元醇，例如，與羧基或氨基化學(xué)連接的聚乙烯醇和聚木糖醇，以及神經(jīng)節(jié)苷脂(諸如神經(jīng)節(jié)苷脂GMl) JEG、甲氧基PEG或甲氧基PPG的共聚物、或其衍生物也是合適的。此外，所述調(diào)理抑制聚合物可以是PEG與聚氨基酸、多糖、聚酰氨基胺、聚乙烯胺或聚核苷酸之一的嵌段共聚物。所述調(diào)理抑制聚合物還可以是含氨基酸或羧酸的天然多糖，例如，半乳糖醛酸、葡萄糖醛酸、甘露糖醛酸、透明質(zhì)酸、果膠酸、神經(jīng)氨酸、褐藻酸、角叉菜膠、胺化多糖或寡糖(直鏈或支鏈)；或羧化多糖或寡糖，例如，與具有羧酸基團(tuán)所得連接的碳酸衍生物反應(yīng)。優(yōu)選地，所述調(diào)理抑制部分是PEG、PPG、或其衍生物。用PEG或PEG-衍生物改性的脂質(zhì)體有時(shí)稱為“PEG化脂質(zhì)體”。
[0194]可以通過(guò)眾多熟知技術(shù)中之一，將所述調(diào)理抑制部分與脂質(zhì)體膜連接。例如，PEG的N-羥基琥珀酰亞胺酯可以與磷脂酰乙醇胺的脂溶性錨結(jié)合，然后與膜結(jié)合。類似地，葡聚糖聚合物可以在60°C下經(jīng)由使用Na (CN) BH3和溶劑混合物(諸如30:12的四氫呋喃和水)的還原性胺化(amination)用硬脂酰氨脂溶性錨衍生。
[0195]經(jīng)調(diào)理抑制部分改性的脂質(zhì)體比未改性的脂質(zhì)體在循環(huán)中維持更長(zhǎng)時(shí)間。因此，所述脂質(zhì)體有時(shí)稱為“隱形”脂質(zhì)體。已知隱形脂質(zhì)體在由多孔或“滲透”微血管系統(tǒng)供養(yǎng)的組織中聚集。因此，這種微血管系統(tǒng)缺陷表征的組織，例如，實(shí)體瘤將有效聚集這些脂質(zhì)體，參見(jiàn) Gabizon,等(1988)，Proc.Natl.Acad.Sc1.，U.S.A.，18:6949_53。此外，RES 攝取的降低通過(guò)防止肝和脾內(nèi)脂質(zhì)體顯著的積累來(lái)降低隱形脂質(zhì)體的毒性。因此，用調(diào)理抑制部分改性的脂質(zhì)體特別適合于將miR基因產(chǎn)物或miR基因表達(dá)抑制化合物(或包括編碼它們的序列的核酸)遞送至腫瘤細(xì)胞。
[0196]根據(jù)本領(lǐng)域中已知的技術(shù)，所述miR基因產(chǎn)物或miR基因表達(dá)抑制化合物可配制成藥物組合物，在給受試者施用它們之前，有時(shí)稱為“藥物”。因此，本發(fā)明包括治療實(shí)體癌的藥物組合物。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述藥物組合物包含至少一個(gè)分離的miR基因產(chǎn)物或其分離的變體或生物活性片段，和藥學(xué)可接受的載體。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，所述至少一種miR基因產(chǎn)物對(duì)應(yīng)于一種miR基因產(chǎn)物，其相對(duì)于合適的對(duì)照細(xì)胞，在實(shí)體癌細(xì)胞中具有降低的表達(dá)水平。在一些實(shí)施方案中，所述分離的miR基因產(chǎn)物選自由miR20a、miR-21、miR-106a、miR_181b、miR-203 及其組合組成的組。
[0197]在其他實(shí)施方案中，本發(fā)明的藥物組合物包含至少一種miR表達(dá)抑制化合物。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，所述至少一種miR基因表達(dá)抑制化合物對(duì)miR基因具有特異性，所述miR基因在結(jié)腸癌細(xì)胞中的表達(dá)高于在對(duì)照細(xì)胞中的表達(dá)。在某些實(shí)施方案中，所述miR基因表達(dá)抑制化合物對(duì)一種或多種miR基因產(chǎn)物具有特異性，所述miR基因產(chǎn)物選自由miR20a、miR-21、miR_106a、miR_181b、miR-203 及其組合組成的組。
[0198]本發(fā)明的藥物組合物特征在于至少是無(wú)菌和無(wú)致熱原的。如本文所使用的，“藥物組合物”包括用于人和獸醫(yī)用途的制劑。本發(fā)明藥物組合物的制備方法是在本領(lǐng)域的技術(shù)范圍內(nèi)的，例如，如在 Remington’s Pharmaceutical Science,第 17 版，Mack PublishingCompany, Easton, Pa.(1985)中所述的,其公開的全部?jī)?nèi)容以引用方式并入本文。
[0199]本發(fā)明的藥物組合物包含至少一種miR基因產(chǎn)物或miR基因表達(dá)抑制化合物(或至少一種包含編碼它們的序列的核酸)(例如，0.1-90重量％)或其生理學(xué)可接受的鹽，與藥學(xué)可接受的載體混合。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的藥物組合物還包含一種或多種抗癌試劑(例如，化療試劑)。本發(fā)明的藥物制劑還包含至少一種miR基因產(chǎn)物或miR基因表達(dá)抑制化合物(或至少一種包含編碼它們的序列的核酸)，其被脂質(zhì)體和藥學(xué)可接受的載體封裝成膠囊。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述藥物組合物包含為miR-21的miR基因或基因產(chǎn)物。
[0200]尤其適合的藥學(xué)可接受的載體是水、緩沖水溶液、正常鹽水、0.4%鹽水、0.3%甘氨酸、透明質(zhì)酸等。
[0201]在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明的藥物組合物包含對(duì)核酸酶降解具有抗性的至少一種miR基因產(chǎn)物或miR基因表達(dá)抑制化合物(或至少一種包含編碼它們的序列的核酸)。本領(lǐng)域的技術(shù)人員能容易地合成核酸酶抗性的核酸，例如，通過(guò)將一種或多種在2’-位置修飾的核糖核苷酸整合到所述miR基因產(chǎn)物中。合適的2’-修飾的核糖核苷酸包括在2’ -位置用氟、氨基、烷基、烷氧基和0-烯丙基修飾的那些。
[0202]本發(fā)明的藥物組合物還包含常規(guī)的藥物賦形劑和/或添加劑。合適的藥物賦形劑包括穩(wěn)定劑、抗氧化劑、等滲調(diào)節(jié)劑、緩沖劑和PH調(diào)節(jié)劑。合適的添加劑例如包括，生理學(xué)上生物相容的緩沖溶液(例如，鹽酸氨丁三醇)，加入螯合劑(諸如，例如，DTPA或DTPA-雙酰胺)或鈣螯合復(fù)合物(諸如，例如，鈣DTPA、CaNaDTPA-雙酰胺)、或任選地加入鈣或鈉鹽(例如，氯化鈣、抗壞血酸鈣、葡萄糖酸鈣或乳酸鈣)?？砂b本發(fā)明的藥物組合物以液體形式使用或可將其凍干。
[0203]對(duì)于本發(fā)明的固體藥物組合物，可以使用常規(guī)無(wú)毒的固體藥學(xué)可接受載體；例如，醫(yī)藥級(jí)的甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸鎂、糖精鈉、滑石、纖維素、葡萄糖、蔗糖、碳酸鎂等。
[0204]例如，口服施用的固體藥物組`合物可包含上面所列的任何載體和賦形劑，且包含10-95%、優(yōu)選25 % -75 %的所述至少一種miR基因產(chǎn)物或miR基因表達(dá)抑制化合物(或至少一種包含編碼它們的序列的核酸)。用于氣溶膠(吸入)施用的藥物組合物可包含如上所述封裝在脂質(zhì)體中的0.01-20重量％、優(yōu)選I重量％ -10重量％的所述至少一種miR基因產(chǎn)物或miR基因表達(dá)抑制化合物(或至少一種包含編碼它們的序列的核酸)，和推進(jìn)劑。還可以根據(jù)需要包含載體，例如，用于鼻內(nèi)遞送的卵磷脂。
[0205]本發(fā)明的藥物組合物可進(jìn)一步包含一種或多種抗癌試劑。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，所述組合物包含至少一種miR基因產(chǎn)物或miR基因表達(dá)抑制化合物(或至少一種包含編碼它們的序列的核酸)和至少一種化療試劑。適用于本發(fā)明方法的化療試劑包括，但不限于，DNA-烷基化試劑、抗腫瘤抗生素試劑、抗代謝試劑、微管蛋白穩(wěn)定劑、微管蛋白去穩(wěn)定劑、荷爾蒙拮抗劑、拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制劑、蛋白激酶抑制劑、HMG-CoA抑制劑、CDK抑制劑、細(xì)胞周期蛋白抑制劑、胱天蛋白酶抑制劑、金屬蛋白酶抑制劑、反義核酸、三螺旋DNA、核酸適配體(nucleic acids aptamers),以及分子改良的病毒、細(xì)菌和外毒素試劑。適合本發(fā)明組合物的試劑的實(shí)例包括，但不限于:胞苷阿拉伯糖苷、甲氨蝶呤、長(zhǎng)春新堿、依托泊甙(VP-16)、阿霉素(亞德里亞霉素)、順鉬(⑶DP)、地塞米松、arglabin、環(huán)磷酰胺、沙可來(lái)新、甲基亞硝基脲、氟尿嘧啶、5-氟尿嘧啶(5FU)、長(zhǎng)春花堿、喜樹堿、放線菌素-D、絲裂霉素C、過(guò)氧化氫、奧沙利鉬、依立替康、拓?fù)涮婵怠⑷淙~酸、卡氮芥、鏈脲佐菌素、CPT-11、紫杉醇、他莫昔芬、達(dá)卡巴嗪、利妥昔單抗、柔紅霉素、1-0-D-阿拉伯呋喃糖基胞嘧啶、伊馬替尼、氟達(dá)拉濱、多西他塞、F0LF0X4。
[0206]本發(fā)明還提供腫瘤形成抑制劑的鑒定方法，包括給細(xì)胞提供測(cè)試試劑并測(cè)量所述細(xì)胞中至少一種miR基因產(chǎn)物的水平。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述方法包括給細(xì)胞提供一種測(cè)試試劑并測(cè)量癌細(xì)胞中與表達(dá)水平降低相關(guān)的至少一種miR基因產(chǎn)物的水平。在提供所述試劑后，相對(duì)于合適的對(duì)照細(xì)胞(例如，沒(méi)有提供試劑)，所述細(xì)胞中miR基因產(chǎn)物水平的增加指示所述測(cè)試試劑為腫瘤形成的抑制劑。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，在癌細(xì)胞中與表達(dá)水平降低相關(guān)的至少一種miR基因產(chǎn)物選自由miR20a、miR-21、miR_106a、miR_181b、miR-203及其組合組成的組。
[0207]在其他實(shí)施方案中，所述方法包括給細(xì)胞提供一種測(cè)試試劑并測(cè)量癌細(xì)胞中與表達(dá)水平增加相關(guān)的至少一種miR基因產(chǎn)物的水平。在提供試劑后，相對(duì)于合適的對(duì)照細(xì)胞(例如，沒(méi)有提供試劑)，所述細(xì)胞中miR基因產(chǎn)物水平的降低指示所述測(cè)試試劑為腫瘤形成的抑制劑。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，在癌細(xì)胞中與表達(dá)水平增加相關(guān)的至少一種miR基因產(chǎn)物選自由miR20a、miR-21、miR_106a、miR_181b、miR-203及其組合組成的組。
[0208]合適的試劑包括，但不限于藥物(例如，小分子、多肽)，和生物大分子(例如，蛋白、核酸)。所述試劑可以重組、合成產(chǎn)生，或其可以由天然來(lái)源分離(即，純化)。給細(xì)胞提供所述試劑的各種方法(例如，轉(zhuǎn)染)是本領(lǐng)域中熟知的，所述方法中的幾個(gè)描述于上文中。檢測(cè)至少一種miR基因產(chǎn)物表達(dá)的方法(例如，Northern印跡、原位雜交、RT-PCR、表達(dá)分析)也是本領(lǐng)域中熟知的。這些方法中的幾個(gè)也描述于上文中。
[0209]本發(fā)明現(xiàn)在將通過(guò)下述非限制性實(shí)施例進(jìn)行描述。
實(shí)施例
[0210]實(shí)施例1
[0211]結(jié)腸腫瘤中微小RNA表達(dá)模式的改變
[0212]使用微小RNA微陣列比較84對(duì)結(jié)腸腫瘤和臨近非腫瘤組織的微小RNA譜3°。這84個(gè)受試者是招募自馬里蘭巴爾的摩地區(qū)的患者，所述患者患有易發(fā)性結(jié)腸腺癌(incidentcolon adenocarcinoma),并稱為馬里蘭測(cè)試群(cohort)(表 I)。
[0213]表1一群(population)和腫瘤的特征
[0214]
【權(quán)利要求】
1.一種診斷受試者是否患有結(jié)腸癌相關(guān)疾病、處于發(fā)展出結(jié)腸癌相關(guān)疾病的風(fēng)險(xiǎn)中、或具有降低的結(jié)腸癌相關(guān)疾病存活預(yù)后的方法，包括:測(cè)量來(lái)自受試者的測(cè)試樣品中至少一種HliR基因產(chǎn)物的水平，其中相對(duì)于對(duì)照樣品中對(duì)應(yīng)HliR基因產(chǎn)物的水平，測(cè)試樣品中所述HliR基因產(chǎn)物水平的改變指示所述受試者患有結(jié)腸癌相關(guān)疾病或處于發(fā)展出結(jié)腸癌相關(guān)疾病的風(fēng)險(xiǎn)中。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述至少一種miR基因產(chǎn)物選自由miR20a、miR-21、miR-106a、miR_181b、miR-203 及其組合組成的組。
3.權(quán)利要求1的方法,其中所述至少一種miR基因產(chǎn)物是miR-21。
4.一種測(cè)試結(jié)腸癌相關(guān)疾病應(yīng)答的引發(fā)、對(duì)結(jié)腸癌相關(guān)疾病應(yīng)答的傾向、或降低的結(jié)腸癌相關(guān)疾病應(yīng)答存活預(yù)后中至少一種的方法，其包括: (1)測(cè)定來(lái)自受試者的樣品中至少一種標(biāo)記物的表達(dá)水平；所述至少一種標(biāo)記物包括至少一種miR基因產(chǎn)物，所述miR基因產(chǎn)物選自由miR20a、miR-21、miR_106a、miR_181b、miR-203及其組合組成的組； (2)比較步驟(1)中測(cè)定的表達(dá)水平與來(lái)自健康受試者的樣品中所述標(biāo)記物的對(duì)照表達(dá)水平；和 (3)當(dāng)步驟(2)中的比較結(jié)果指示i)受試者中所述至少一種標(biāo)記物的表達(dá)水平比對(duì)照中的高，或ii)受試者中所述至少一種標(biāo)記物的表達(dá)水平比對(duì)照中的低時(shí)，判斷受試者患有結(jié)腸癌相關(guān)疾病。
5.權(quán)利要求4的測(cè)試方法，其中所述樣品包括組織、血液、血漿、血清、尿和糞便的一種或多種。
6.權(quán)利要求4的測(cè)試方法，其中所有的方法步驟在體外進(jìn)行。
7.—種診斷受試者是否患有結(jié)腸癌相關(guān)疾病、處于發(fā)展出結(jié)腸癌相關(guān)疾病的風(fēng)險(xiǎn)中、或具有降低的結(jié)腸癌相關(guān)疾病存活預(yù)后的方法，包括: (1)對(duì)來(lái)自獲自受試者的測(cè)試樣品的RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄以提供一組靶寡聚脫氧核苷酸； (2)使所述靶寡聚脫氧核苷酸與微陣列雜交以提供所述測(cè)試樣品的雜交譜，所述微陣列包括miRNA特異性探針寡核苷酸；和 (3)比較所述測(cè)試樣品的雜交譜與對(duì)照樣品產(chǎn)生的雜交譜， 其中至少一種miRNA信號(hào)的改變指示所述受試者患有結(jié)腸癌相關(guān)疾病，處于發(fā)展出結(jié)腸癌相關(guān)疾病的風(fēng)險(xiǎn)中，或具有降低的結(jié)腸癌相關(guān)疾病的存活預(yù)后。
8.權(quán)利要求7的方法,其中相對(duì)于對(duì)照樣品產(chǎn)生的信號(hào),至少一種miRNA信號(hào)是被上調(diào)或下調(diào)的。
9.權(quán)利要求7的方法，其中所述微陣列包括針對(duì)一種或多種miRNA的miRNA特異性探針寡核苷酸，所述miRNA選自由miR20a、miR-21、miR-106a、miR-181b、miR-203及其組合組成的組。
10.一種抑制受試者中腫瘤形成的方法，所述受試者患有或懷疑患有結(jié)腸癌相關(guān)疾病，其中相對(duì)于對(duì)照細(xì)胞，在受試者的癌細(xì)胞中至少一種miR基因產(chǎn)物是被上調(diào)或下調(diào)的，所述miR基因產(chǎn)物選自由miR20a、miR-21、miR-106a、miR-181b、miR-203及其組合組成的組，包括: (I)如果癌細(xì)胞中所述至少一種miR基因產(chǎn)物是被下調(diào)的，給受試者施用有效量的至少一種分離的miR基因產(chǎn)物，所述miR基因產(chǎn)物選自由miR20a、miR-21、miR_106a、miR-181b、miR-203及其組合組成的組，從而抑制受試者中腫瘤形成；或 (2)如果癌細(xì)胞中所述至少一種miR基因產(chǎn)物是被上調(diào)的，給受試者施用有效量的至少一種用于抑制至少一種miR基因產(chǎn)物表達(dá)的化合物，所述miR基因產(chǎn)物選自由miR20a、miR-21、miR-106a、miR_181b、miR-203及其組合組成的組，從而抑制受試者中腫瘤形成。
11.權(quán)利要求10的方法，其中在步驟(1)和/或步驟(2)中所述至少一種分離的miR基因產(chǎn)物是miR-21、或其分離的變體、或其生物活性片段或功能等價(jià)物，或與其結(jié)合的抗體。
12.—種抑制患有結(jié)腸癌的受試者中腫瘤形成的方法，包括: (1)測(cè)定相對(duì)于對(duì)照細(xì)胞，來(lái)自所述受試者的癌細(xì)胞中至少一種miR基因產(chǎn)物的量；和 (2)改變?cè)诎┘?xì)胞中表達(dá)的miR基因產(chǎn)物的量，通過(guò): (i )如果在癌細(xì)胞中表達(dá)的所述miR基因產(chǎn)物的量少于對(duì)照細(xì)胞中表達(dá)的miR基因產(chǎn)物的量，給受試者施用有效量的至少一種分離的miR基因產(chǎn)物，所述miR基因產(chǎn)物選自由miR20a、miR-21、miR-106a、miR-181b、miR-203 及其組合組成的組；或 (ii)如果在癌細(xì)胞中表達(dá)的miR基因產(chǎn)物的量大于對(duì)照細(xì)胞中表達(dá)的所述miR基因產(chǎn)物的量，給受試者施用有效量的至少一種抑制所述至少一種miR基因產(chǎn)物的化合物； 從而抑制受試者中的腫瘤形成。
13.權(quán)利要求12的方法，其中在步驟(i)中所述至少一種分離的miR基因產(chǎn)物是miR-21或其分離的變體或生物活性片段。`
14.權(quán)利要求12的方法，其中在步驟(ii)中所述至少一種miR基因產(chǎn)物選自由miR20a、miR-21、miR-106a、miR-18lb、miR-203及其組合組成的組，或其分離的變體或生物活性片段。
15.一種鑒定腫瘤形成抑制劑的方法，包括: 給細(xì)胞提供一種測(cè)試試劑，并 測(cè)量與結(jié)腸癌相關(guān)疾病中改變的表達(dá)水平相關(guān)的至少一種miR基因產(chǎn)物的水平，其中相對(duì)于合適的對(duì)照細(xì)胞，所述細(xì)胞中所述miR基因產(chǎn)物水平的升高或降低指示所述測(cè)試試劑為腫瘤形成的抑制劑。
16.權(quán)利要求15的方法，其中所述miR基因產(chǎn)物選自由miR20a、miR-21、miR_106a、miR-181b、miR-203及其組合組成的組。
17.一種鑒定腫瘤形成抑制劑的方法，包括: 給細(xì)胞提供一種測(cè)試試劑，并 測(cè)量與結(jié)腸癌相關(guān)疾病中改變的表達(dá)水平相關(guān)的至少一種miR基因產(chǎn)物的水平，其中相對(duì)于合適的對(duì)照細(xì)胞，所述細(xì)胞中所述miR基因產(chǎn)物水平的降低指示所述測(cè)試試劑為腫瘤形成的抑制劑。
18.權(quán)利要求25的方法，其中所述miR基因產(chǎn)物選自由miR20a、miR-21、miR_106a、miR-181b、miR-203及其組合組成的組。
19.權(quán)利要求26的方法，其中所述結(jié)腸癌相關(guān)疾病是腺癌。
20.一種評(píng)估一種或多種代謝途徑的標(biāo)記物，所述代謝途徑對(duì)至少一種結(jié)腸癌相關(guān)疾病的引發(fā)、進(jìn)展、嚴(yán)重性、病理、惡性、分期、活性、殘疾、死亡率、發(fā)病率、疾病亞分類或其他潛在致病或病理特征的至少一種有貢獻(xiàn)，其中所述標(biāo)記物包括一種或多種miR基因產(chǎn)物，所述miR基因產(chǎn)物選自由miR20a、miR-21、miR-106a、miR_181b、miR-203 及其組合組成的組。
21.—種包含一種或多種權(quán)利要求20的標(biāo)記物的組合物。
22.一種鑒定受試者中至少一種結(jié)腸癌相關(guān)疾病引發(fā)或發(fā)展的潛力的方法，所述方法提供對(duì)權(quán)利要求20的標(biāo)記物的一種或多種的測(cè)量。
23.權(quán)利要求22的方法，其中在分離的樣品中存在一種或多種標(biāo)記物，且所有的方法步驟在體外進(jìn)行。
24.—種測(cè)試結(jié)腸癌相關(guān)疾病的試劑,其中所述試劑包含多核苷酸,所述多核苷酸包括權(quán)利要求20的標(biāo)記物的至少一種的核苷酸序列或與所述標(biāo)記物的核苷酸序列互補(bǔ)的核苷酸序列。
25.一種測(cè)試結(jié)腸癌相關(guān)疾病的試劑，其中所述試劑包含抗體，所述抗體識(shí)別由權(quán)利要求20的標(biāo)記物的至少一種編碼的蛋白。
26.—種測(cè)試結(jié)腸癌相關(guān)疾病的DNA芯片，探針固定在所述芯片上以測(cè)試權(quán)利要求20的標(biāo)記物的至少一種。
27.一種評(píng)估療法 對(duì)預(yù)防、診斷和/或治療至少一種結(jié)腸癌相關(guān)疾病的效力的方法，包括: 1)給動(dòng)物實(shí)施一種療法，對(duì)所述療法的效力進(jìn)行評(píng)估，和 2)通過(guò)評(píng)價(jià)權(quán)利要求20的標(biāo)記物的至少一種以測(cè)定在治療或預(yù)防結(jié)腸癌相關(guān)疾病中被測(cè)試的治療的效力水平。
28.權(quán)利要求27的方法，其中所述候選治療劑包括藥物組合物、保健組合物和順勢(shì)療法組合物的一種或多種。
29.權(quán)利要求27的方法，其中所述被評(píng)估的療法可用于人受試者。
30.權(quán)利要求27的方法，其中所述方法不是通過(guò)手術(shù)或療法來(lái)治療人體或動(dòng)物體的方法。
31.一種評(píng)估至少一種材料在動(dòng)物模型中引發(fā)結(jié)腸癌相關(guān)疾病應(yīng)答的潛力的方法，所述方法提供: 1)在使動(dòng)物與足以引發(fā)動(dòng)物中結(jié)腸癌相關(guān)疾病應(yīng)答的量的一種或多種材料接觸后，測(cè)量一種或多種被上調(diào)或下調(diào)的權(quán)利要求20的標(biāo)記物；和 2)測(cè)定所述被上調(diào)或下調(diào)標(biāo)記物的至少一種是否具有引發(fā)結(jié)腸癌相關(guān)疾病應(yīng)答的能力。
32.—種治療結(jié)腸癌相關(guān)疾病的藥物組合物，包括: 至少一種miR基因產(chǎn)物，所述miR基因產(chǎn)物選自由miR20a、miR-21、miR_106a、miR-181b、miR-203及其組合組成的組；和 藥學(xué)可接受的載體。
33.權(quán)利要求32的藥物組合物，其中所述至少一種miR基因產(chǎn)物對(duì)應(yīng)于在癌細(xì)胞中相對(duì)于合適的對(duì)照細(xì)胞被上調(diào)或下調(diào)的miR基因產(chǎn)物。
34.權(quán)利要求32的藥物組合物，其中所述miR基因產(chǎn)物是miR-21。
35.權(quán)利要求32的藥物組合物，其中所述結(jié)腸癌相關(guān)疾病是腺癌。
36.一種治療結(jié)腸癌的藥物組合物，包括:至少一種miR表達(dá)抑制化合物，和 藥學(xué)可接受的載體， 其中所述的至少一種miR表達(dá)抑制化合物對(duì)miR基因產(chǎn)物具有特異性，所述miR基因產(chǎn)物選自由 miR20a、miR-21、miR_106a、miR_181b、miR-203 及其組合組成的組。
37.權(quán)利要求36的藥物組合物，其中所述至少一種miR表達(dá)抑制化合物對(duì)在癌細(xì)胞中相對(duì)于合適的對(duì)照細(xì)胞被上調(diào)或下調(diào)的miR基因產(chǎn)物具有特異性。
38.一種產(chǎn)品包括:至少一種與結(jié)腸癌相關(guān)疾病的標(biāo)記物結(jié)合的捕獲試劑，所述標(biāo)記物選自權(quán)利要求20的標(biāo)記物的至少一種。
39.一種用于篩選用于治療結(jié)腸癌相關(guān)疾病的治療劑的候選化合物的試劑盒，其中所述試劑盒包括: 至少一種權(quán)利要求20的標(biāo)記物的一種或多種試劑，和 表達(dá)至少一種標(biāo)記物的細(xì)胞。
40.權(quán)利要求39的試劑盒，其中使用包括抗體或抗體片段的試劑以檢測(cè)所述標(biāo)記物的存在，所述抗體或抗體片段與至少一種標(biāo)記物特異性結(jié)合。
41.權(quán)利要求40的試劑盒，其中所述試劑是標(biāo)記的、放射標(biāo)記的、或生物素標(biāo)記的，和/或其中所述抗體或抗體片段是放射標(biāo)記的、生色團(tuán)標(biāo)記的、熒光團(tuán)標(biāo)記的或酶標(biāo)記的。
42.權(quán)利要求39的試劑盒進(jìn)一步包括容器，其包含所述標(biāo)記物的至少一種。
43.權(quán)利要求39的試劑盒`，其中所述試劑包括抗體、與所述附帶或可附帶的探針、和固定金屬螯合物的一種或多種。
44.一種結(jié)腸癌相關(guān)疾病的篩選測(cè)試包括: 使權(quán)利要求20的標(biāo)記物的一種或多種與所述標(biāo)記物的底物和與測(cè)試試劑接觸，并 測(cè)定所述測(cè)試試劑是否調(diào)節(jié)所述標(biāo)記物的活性。
45.權(quán)利要求44的篩選測(cè)試，其中所有的方法步驟在體外進(jìn)行。
46.一種預(yù)測(cè)受試者中結(jié)腸癌相關(guān)疾病存在的微陣列，包括抗體，其針對(duì)權(quán)利要求20的標(biāo)記物的至少一種。
47.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中通過(guò)檢測(cè)經(jīng)轉(zhuǎn)錄的多核苷酸或其部分的存在以評(píng)估所述標(biāo)記物的表達(dá)水平，其中所述經(jīng)轉(zhuǎn)錄的多核苷酸包括所述標(biāo)記物的編碼區(qū)。
48.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中所述樣品是結(jié)腸癌相關(guān)體液或組織。
49.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中所述樣品包括獲自患者的細(xì)胞。
50.一種治療、預(yù)防、逆轉(zhuǎn)或限制在需要其的個(gè)體中結(jié)腸癌相關(guān)疾病并發(fā)癥的嚴(yán)重性的方法，包括: 給所述個(gè)體施用干擾至少一種結(jié)腸癌相關(guān)疾病應(yīng)答信號(hào)傳導(dǎo)途徑的試劑，以足以干擾所述信號(hào)傳導(dǎo)的量， 其中所述試劑包含至少一種miR基因產(chǎn)物，所述miR基因產(chǎn)物選自由miR20a、miR_21、miR-106a、miR_181b、miR-203 及其組合組成的組。
51.權(quán)利要求50的方法，其中所述至少一種miR基因產(chǎn)物是miR-21。
52.—種干擾至少一種結(jié)腸癌相關(guān)疾病應(yīng)答信號(hào)傳導(dǎo)途徑的試劑在制備藥物中的用途，所述藥物用于治療、預(yù)防、逆轉(zhuǎn)或限制個(gè)體中結(jié)腸癌相關(guān)疾病并發(fā)癥的嚴(yán)重性， 其中所述試劑包含至少一種miR基因產(chǎn)物，所述miR基因產(chǎn)物選自由miR20a、miR_21、miR-106a、miR_181b、miR-203 及其組合組成的組。
53.權(quán)利要求52的用途，其中所述至少一種miR基因產(chǎn)物是miR-21。
54.一種治療、預(yù)防、逆轉(zhuǎn)或限制在需要其的個(gè)體中結(jié)腸癌相關(guān)疾病并發(fā)癥的嚴(yán)重性的方法，包括: 給所述個(gè)體施用干擾至少一種結(jié)腸癌相關(guān)疾病應(yīng)答級(jí)聯(lián)的試劑， 其中所述試劑包含至少一種miR基因產(chǎn)物，所述miR基因產(chǎn)物選自由miR20a、miR_21、miR-106a、miR-181b，miR-203 及其組合組成的組。
55.權(quán)利要求55的方法，其中所述至少一種miR基因產(chǎn)物是miR-21。
56.一種干擾至少一種結(jié)腸癌相關(guān)疾病應(yīng)答級(jí)聯(lián)的試劑在制備藥物中的用途，所述藥物用于治療、預(yù)防、逆轉(zhuǎn)或限制個(gè)體中結(jié)腸癌相關(guān)疾病并發(fā)癥的嚴(yán)重性， 其中所述試劑包含至少一種miR基因產(chǎn)物，所述miR基因產(chǎn)物選自由miR20a、miR_21、miR-106a、miR_181b、miR-203 及其組合組成的組。
57.權(quán)利要求56的用途，其中所述至少一種miR基因產(chǎn)物是miR-21。
58.一種包含數(shù)據(jù)庫(kù)的計(jì)算機(jī)可讀介質(zhì)，所述數(shù)據(jù)庫(kù)具有多種數(shù)字編碼的參考譜，其中至少第一參考譜代表來(lái)自一個(gè)或多個(gè)受試者的一個(gè)或多個(gè)樣品中至少第一標(biāo)記物的水平，所述受試者展示結(jié)腸癌相關(guān)疾病應(yīng)答的標(biāo)記， 其中所述標(biāo)記物包括一種或多種miR基因產(chǎn)物，所述miR基因產(chǎn)物選自由miR20a、miR-21、miR-106a、miR-181b、miR-203 及其組合組成的組。
59.權(quán)利要求58的計(jì)算機(jī)可讀介質(zhì)，包含至少第二參考譜，其代表來(lái)自一個(gè)或多個(gè)受試者的一個(gè)或多個(gè)樣品中至少第二標(biāo)記物的水平，所述受試者展示結(jié)腸癌相關(guān)疾病應(yīng)答的標(biāo)記，或受試者患有結(jié)腸癌相關(guān)疾病。
60.一種測(cè)定患者是否患有，或傾向于患有結(jié)腸癌相關(guān)疾病，或具有差的結(jié)腸癌相關(guān)疾病存活預(yù)后的計(jì)算機(jī)系統(tǒng)，包括: 權(quán)利要求58的數(shù)據(jù)庫(kù)，和 包含計(jì)算機(jī)執(zhí)行代碼的服務(wù)器，所述代碼使計(jì)算機(jī)接收受試者的譜，從數(shù)據(jù)庫(kù)中識(shí)別在診斷上與受試者譜相關(guān)的匹配參考譜,并產(chǎn)生所述受試者是否患有或傾向于患結(jié)腸癌相關(guān)疾病的指示。
61.一種評(píng)價(jià)受試者中結(jié)腸癌相關(guān)疾病的存在、不存在、性質(zhì)或程度的計(jì)算機(jī)輔助方法，包括: 1)提供一種計(jì)算機(jī)，其包括對(duì)獲自所述受試者的樣品的數(shù)據(jù)進(jìn)行分類的模型或運(yùn)算法則， 其中，所述分類包括就至少一種標(biāo)記物的存在、不存在或量針對(duì)所述數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，和 其中所述標(biāo)記物包括一種或多種miR基因產(chǎn)物，所述miR基因產(chǎn)物選自由miR20a、miR-21、miR-106a、miR_181b、miR-203 及其組合組成的組。 2)輸入獲自受試者的生物樣品的數(shù)據(jù)；和 3 )對(duì)生物樣品進(jìn)行分類以指示結(jié)腸癌相關(guān)疾病的存在、不存在、性質(zhì)或程度。
62.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中所述至少一種miR基因產(chǎn)物及其組合包括其分離的變體、或生物活性片段或功能等價(jià)物、或與其結(jié)合的抗體。
63.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中所述結(jié)腸癌相關(guān)疾病是腺癌。
64.—種結(jié)腸癌的動(dòng)物模型，其中存在一種或多種miR基因產(chǎn)物中至少一種改變的表達(dá)，所述miR基因產(chǎn)物選自由miR20a、miR-21、miR-106a、miR-181b、miR-203及其組合組成的組。
65.權(quán)利要求64的動(dòng)物模型，其中所述動(dòng)物模型是非人脊椎動(dòng)物。
66.權(quán)利要 求64的標(biāo)記物，其中所述動(dòng)物模型是小鼠、大鼠、兔或靈長(zhǎng)類動(dòng)物。
【文檔編號(hào)】A01K67/027GK103589784SQ201310396056
【公開日】2014年2月19日 申請(qǐng)日期:2007年7月12日 優(yōu)先權(quán)日:2006年7月13日
【發(fā)明者】C·M·克羅斯, C·C·哈里斯, A·J·斯徹特 申請(qǐng)人:俄亥俄州立大學(xué)研究基金會(huì), 由衛(wèi)生與公眾服務(wù)部代表的美利堅(jiān)合眾國(guó)政府