水稻轉(zhuǎn)錄因子Os01g36630基因CDS序列的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及水稻轉(zhuǎn)錄因子Os01g36630基因CDS序列的應(yīng)用，其是利用轉(zhuǎn)錄因子激活基序VP64與水稻轉(zhuǎn)錄因子Os01g36630融合構(gòu)建得到組成型轉(zhuǎn)錄因子，并將編碼所述組成型轉(zhuǎn)錄因子的基因轉(zhuǎn)化到農(nóng)作物如水稻中，從而改良水稻籽粒性狀，例如增加水稻籽粒長(zhǎng)度。對(duì)于詳細(xì)闡明調(diào)控種子發(fā)育機(jī)理具有重要的理論價(jià)值，并且可以通過(guò)轉(zhuǎn)基因手段，改良水稻的粒型，因此在生產(chǎn)實(shí)踐中也具有重要意義。
【專利說(shuō)明】水稻轉(zhuǎn)錄因子0s01g36630基因 CDS序列的應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，具體地說(shuō)，涉及水稻轉(zhuǎn)錄因子0s01g36630基因⑶S序 列的應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002] 水稻（Oryza sativa L.)是我國(guó)和全世界最重要的三大糧食作物之一，是世界一 半以上人口的主食，也是一個(gè)重要的功能基因研究的模式植物。與其相關(guān)的遺傳學(xué)和分子 生物學(xué)研究一直倍受研究者的重視，轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控是基因表達(dá)調(diào)控的重要方式。當(dāng)前水 稻增產(chǎn)的研究較依賴于有限的水稻種質(zhì)資源，傳統(tǒng)的雜交育種優(yōu)勢(shì)正在逐漸減弱，而水稻 轉(zhuǎn)基因技術(shù)有可能發(fā)掘水稻進(jìn)一步增產(chǎn)的潛力。
[0003] 在植物界中，能形成種子的植物約占植物總數(shù)的三分之二以上，作為重要的繁殖 器官，種子同時(shí)也為人們提供食物來(lái)源，水稻就是其中的重要代表，種子來(lái)源于受精后的胚 珠。從分子生物學(xué)的角度來(lái)說(shuō)，種子的發(fā)育和萌發(fā)是一個(gè)有次序的、選擇性的基因表達(dá)過(guò) 程。而轉(zhuǎn)錄因子在基因表達(dá)的精確調(diào)控中起到了關(guān)鍵性的作用。
[0004] 禾谷類作物的產(chǎn)量很大程度上取決于其籽粒的大小，因此水稻籽粒性狀的基因調(diào) 控是重要的研究領(lǐng)域。Jumonji(JMJ)家族轉(zhuǎn)錄因子主要調(diào)控組蛋白的甲基化，組蛋白修飾 酶，包括組蛋白去乙?；福℉istone deacetylases，HDACs),組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶（Histone methyltransferases，HMTs),以及組蛋白去甲基化酶（Histonedemethylase，HDMs)等，在 動(dòng)植物發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用。然而在單子葉植物模式物種水稻中，對(duì)這些修飾酶 的功能研究還相對(duì)較少。植物中第一個(gè)報(bào)道的具有去甲基化酶活性的jmjC家族基因是 IBMlQncrease in BONSAI methylation，JMJ25)。通過(guò)篩選 EMS 誘變的突變體庫(kù)，檢測(cè)可 以使BNS (BONSAI)基因的DNA甲基化升高的突變體，Saze等克隆了一個(gè)含有jmjc結(jié)構(gòu)域的 基因 IBMl，其突變失活后引起多種表型，包括葉片卷曲變小，植株矮小，種子發(fā)育異常等，還 引起B(yǎng)NS基因 DNA甲基化增加，另外還證實(shí)IBMl可執(zhí)行H3K9去甲基化酶的功能（Saze H， Shiraishl A,Miura A,Kakutanl T. (2008)Control of genic DNA methylation by ajmjC domain-containing protein in Arabidopsis thaliana. Science.)〇
[0005] 組蛋白賴氨酸甲基化是一個(gè)重要的表觀遺傳修飾，即可以激活也可以抑制相關(guān)基 因的表達(dá)。研究表明，在植物以外的模式系統(tǒng)中，含有Jumonji C(jmjC)結(jié)構(gòu)域的蛋白可以 去除組蛋白甲基化。中國(guó)學(xué)者證明了在植物里含有jmjC結(jié)構(gòu)域的蛋白與哺乳動(dòng)物的同源 蛋白相比在功能上既有保守性也有特異性。特別是屬于JMJD2家族的水稻jmjC基因 JMJ706 編碼了一個(gè)異染色質(zhì)富集蛋白。JMJ706蛋白能夠在體外特異的去除組蛋白H3K9的二甲基 化和三甲基化。功能缺失突變體表現(xiàn)為H3K9的二甲基化和三甲基化增加，并影響了小穗發(fā) 育，同時(shí)伴有花器官形態(tài)和數(shù)目的改變?；虮磉_(dá)及組蛋白修飾分析實(shí)驗(yàn)證明了 JMJ706蛋 白調(diào)控一小組花發(fā)育調(diào)節(jié)基因。綜合實(shí)驗(yàn)結(jié)果，表明水稻中JMJ706基因編碼一個(gè)異染色質(zhì) 相關(guān)的H3K9去甲基化酶，并在水稻花發(fā)育過(guò)程中起調(diào)控作用（Qianwen Sun and Dao-Xiu Zhou. (2008)Rice jmjC domain-containing gene JMJ706encodes H3K9demethyIase required for floral organ development. PNAS.XJMJ706 為定位在異染色質(zhì)區(qū)域的核蛋 白，其突變后引起水稻花器官發(fā)育異常并導(dǎo)致H3K9me2及me3甲基化修飾程度積累。JMJ706 全長(zhǎng)cDNA互補(bǔ)轉(zhuǎn)化其突變體jmj6后，轉(zhuǎn)基因植株花發(fā)育異常的表型得以恢復(fù)：amiRNA抑 制野生型JMJ706基因后，可產(chǎn)生類似jmj6的表型(孫前文.（2009)水稻組蛋白末端修飾 酶基因的功能研究，華南農(nóng)業(yè)大學(xué)博士論文)。JMJ家族的另外一個(gè)基因 JMJ703,是水稻中 一種活性H3K4特異性去甲基酶，能特異的降低組蛋白H3K4的甲基化水平，參與控制轉(zhuǎn)座子 的活性。JMJ703功能喪失性突變體具有多種表型，表現(xiàn)為植株矮化，倒一、二、三節(jié)間明顯 比野生型短，葉片直立，二級(jí)枝梗減少，突變體種子長(zhǎng)、寬以及厚度都減少（Xiekui Cui. et al. (2013)Control of transposon activity by a histone H3K4demethylase in rice. Proc Natl Acad Sci USA)。總之，控制水稻籽粒發(fā)育是一個(gè)復(fù)雜過(guò)程，涉及到多基因多條 途徑的協(xié)調(diào)控制，目前發(fā)現(xiàn)調(diào)控該性狀的基因不多，調(diào)控籽粒發(fā)育的分子機(jī)理尚未闡明，因 此，尋找控制籽粒性狀發(fā)育的基因和新的發(fā)掘手段對(duì)作物改良并提高作物產(chǎn)量具有重要意 義。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的是提供水稻轉(zhuǎn)錄因子0s01g36630基因⑶S序列的應(yīng)用。
[0007] 為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明首先提供一種組成型水稻轉(zhuǎn)錄因子，即融合蛋白 (VP16) 4-Linker-0s01g36630。
[0008] 其中，VP16為來(lái)自單純皰疹病毒的VP16蛋白，將4個(gè)VP16功能域基序融合在一起 可構(gòu)成一類增強(qiáng)子，增強(qiáng)轉(zhuǎn)錄因子的功能，從而在轉(zhuǎn)基因植株中出現(xiàn)更明顯的表型變化。上 述融合蛋白中涉及的（VP16) 4，即VP64是由4個(gè)VP16蛋白的氨基酸序列以Gly-Ser為間隔 形成的融合蛋白，其氨基酸序列和核苷酸序列分別如SEQ ID No. 10和SEQ ID No. 4所示。
[0009] 上述融合蛋白中涉及的Linker由39個(gè)柔性氨基酸串聯(lián)而成，其氨基酸序列如SEQ ID No. 9所示，編碼該Linker的核苷酸序列如SEQ ID No. 3所示。
[0010] 上述融合蛋白中涉及的0s01g36630為水稻轉(zhuǎn)錄因子0s01g36630,其氨基酸序列 如SEQ ID No. 2所示，或該序列經(jīng)替換、缺失或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸形成的具有同等功能 的氨基酸序列；水稻轉(zhuǎn)錄因子0s01g36630基因的⑶S序列為：SEQ ID No. 1所示的核苷酸 序列。
[0011] 本發(fā)明還提供編碼所述組成型水稻轉(zhuǎn)錄因子的基因，以及在嚴(yán)格條件下，可與該 基因的核苷酸序列發(fā)生雜交的核苷酸序列。
[0012] 本發(fā)明還提供含有編碼所述組成型水稻轉(zhuǎn)錄因子的基因的載體、工程菌及細(xì)胞 系。
[0013] 所述載體的構(gòu)建方法如下：
[0014] (1)在植物轉(zhuǎn)錄因子數(shù)據(jù)庫(kù)（http://rice, plantbiology. msu. edu/analyses_ search_locus. shtml)中找到0s01g36630基因，根據(jù)其序列設(shè)計(jì)PCR擴(kuò)增引物對(duì)，其為正向 引物F :5' -CAAAAAAGCAGGCTTCATGTCGATGCGGGAGITT-3' 和反向引物 R :5' -CAAGAAAGCTGGGTC CTATCTATCAGAGAGAGCA-3' 。
[0015] (2)以野生日本晴'kitaake'水稻總cDNA為模板，利用上述引物F和R進(jìn)行PCR， 獲得0s01g36630基因完整的CDS序列。
[0016] (3)將上述PCR產(chǎn)物克隆到pDONER克隆載體上，經(jīng)測(cè)序鑒定得到與目的基因完全 相同的序列。
[0017] (4)以植物雙元表達(dá)載體pCambial301_UbiN (圖6)左右邊界包含的序列為骨架 序列，通過(guò)體外重組，將ubi promoter-VP64-Gateway表達(dá)單兀、35S promoter-asRED表達(dá) 單元和35S promoter-hyg表達(dá)單元與之融合構(gòu)建，得到載體nVP64-hyg-asRED的全序列如 SEQ ID No. 5 所示。
[0018] (5)通過(guò)LR反應(yīng)將0s01g36630基因的CDS序列構(gòu)建到其目的基因的5'端連有 VP64編碼基因的植物表達(dá)載體nVP64-hyg-asRED上，獲得攜帶有編碼所述組成型水稻轉(zhuǎn)錄 因子 VP64-Linker-0s01g36630 基因的表達(dá)載體 ubi :VP64-0s01g36630,其全序列如 SEQ ID No. 6所示。
[0019] 上述表達(dá)載體可通過(guò)使用Ti質(zhì)粒、植物病毒載體、直接DNA轉(zhuǎn)化、微注射、電穿 孔等常規(guī)生物技術(shù)方法導(dǎo)入植物細(xì)胞中（Weissbach，1998, Method for Plant Molecular Biology VIII，Academy Press，New York，第 411-463 頁(yè)；Geiserson 和 Corey，1998, Plant Molecular Biology,2nd Edition)。
[0020] 本發(fā)明還提供一種轉(zhuǎn)基因水稻植株的構(gòu)建方法，具體為：采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法， 將上述表達(dá)載體轉(zhuǎn)入水稻愈傷組織中，用含誘導(dǎo)劑和農(nóng)桿菌的AAM培養(yǎng)液進(jìn)行轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化 后的材料經(jīng)過(guò)共培養(yǎng)-篩選-分化-生根-轉(zhuǎn)基因苗的鍛煉和移栽，篩選轉(zhuǎn)基因水稻植株。
[0021] 本發(fā)明還提供編碼所述組成型水稻轉(zhuǎn)錄因子的基因在改良水稻籽粒性狀(例如增 加水稻粒長(zhǎng)及千粒重）中的應(yīng)用。
[0022] 本發(fā)明還提供了用于擴(kuò)增水稻轉(zhuǎn)錄因子0s01g36630基因⑶S序列的引物對(duì)，包括 正向引物 F : 5' -CAAAAAAGCAGGCTTCATGTCGATGCGGGAGITT-3' 和反向引物 R : 5' -CAAGAAAGCTG GGTCCTATCTATCAGAGAGAGCA-3' 。
[0023] 本發(fā)明進(jìn)一步提供水稻轉(zhuǎn)錄因子0s01g36630基因⑶S序列在調(diào)控水稻籽粒性狀 中的應(yīng)用。利用轉(zhuǎn)錄因子激活基序VP64(SEQ ID No. 10)與水稻轉(zhuǎn)錄因子0s01g36630融合 構(gòu)建得到組成型轉(zhuǎn)錄因子，并將編碼所述組成型轉(zhuǎn)錄因子的基因轉(zhuǎn)化到農(nóng)作物如水稻中， 從而改良轉(zhuǎn)基因水稻籽粒的性狀。
[0024] 前述的應(yīng)用，是將水稻轉(zhuǎn)錄因子0s01g36630基因的⑶S序列構(gòu)建到轉(zhuǎn)錄因子激活 基序VP64編碼基因 （SEQ ID No. 4)的下游，轉(zhuǎn)化水稻，從而改良轉(zhuǎn)基因水稻籽粒的性狀。優(yōu) 選將水稻轉(zhuǎn)錄因子0s01g36630基因的CDS序列通過(guò)Gateway系統(tǒng)轉(zhuǎn)錄因子激活基序VP64 編碼基因的下游。
[0025] 本發(fā)明首次利用轉(zhuǎn)錄因子激活基序VP64 (即4個(gè)轉(zhuǎn)錄因子激活基序VP16)與水稻 轉(zhuǎn)錄因子0s01g36630融合構(gòu)建得到組成型轉(zhuǎn)錄因子，并將編碼所述組成型轉(zhuǎn)錄因子的基 因轉(zhuǎn)化到農(nóng)作物如水稻中，從而改良水稻籽粒性狀，例如水稻籽粒長(zhǎng)度的增加。對(duì)于詳細(xì)闡 明調(diào)控種子發(fā)育機(jī)理具有重要的理論價(jià)值，并且可以通過(guò)轉(zhuǎn)基因手段，改良水稻的粒型，因 此在生產(chǎn)實(shí)踐中也具有重要意義。

【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0026] 圖1為本發(fā)明實(shí)施例1中nVP64-hyg_asRED載體圖譜。
[0027] 圖2為本發(fā)明實(shí)施例1中ubi :VP64-0s01g36630載體圖譜。
[0028] 圖3為本發(fā)明實(shí)施例3中PCR檢測(cè)VP64_0s01g36630轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性株系，其中WT為 野生型水稻 'kitaake'，NV0584H-27、NV0584H-29 為 VP64-0s01g36630 轉(zhuǎn)基因水稻株系。
[0029] 圖4為本發(fā)明實(shí)施例4中轉(zhuǎn)基因水稻籽粒性狀的表型長(zhǎng)度的比較；其中WT為野生 型水稻 'kitaake'，NV0584H-27、NV0584H-29 為 VP64-0s01g36630 轉(zhuǎn)基因水稻株系。
[0030] 圖5為本發(fā)明實(shí)施例4中轉(zhuǎn)基因水稻籽粒性狀的數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果；其中WT為野 生型水稻 'kitaake'，NV0584H-27、NV0584H-29 為 VP64-0s01g36630 轉(zhuǎn)基因水稻株系。
[0031] 圖6為本發(fā)明實(shí)施例1中pCambial301_UbiN載體圖譜。

【具體實(shí)施方式】
[0032] 以下實(shí)施例用于說(shuō)明本發(fā)明，但不用來(lái)限制本發(fā)明的范圍。若未特別指明，實(shí)施例 中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段，所用原料均為市售商品。
[0033] 實(shí)施例1
[0034] 0s01g36630基因⑶S序列的獲得及植物表達(dá)載體的構(gòu)建
[0035] 10s01g36630基因 CDS序列的獲得
[0036] 在植物轉(zhuǎn)錄因子數(shù)據(jù)庫(kù)（http://rice. plantbiology. msu. edu/analyses_ search_locus. shtml)中找到0s01g36630基因，根據(jù)其序列設(shè)計(jì)PCR擴(kuò)增引物，正向引物 F :5' -CAAAAAAGCAGGCTTCATGTCGATGCGGGAGTTT-3' 和反向引物 R :5' -CAAGAAAGCTGGGTCCTAT CTATCAGAGAGAGCA-3'。以野生型日本晴'kitaake'水稻總cDNA為模板，利用引物F和R進(jìn) 行PCR，獲得0s01g36630基因完整的CDS序列（如SEQ ID No. 1所示)。
[0037] 2植物表達(dá)載體的構(gòu)建
[0038] 將水稻轉(zhuǎn)錄因子0s01g36630基因的CDS序列通過(guò)Gateway系統(tǒng)構(gòu)建到4個(gè)轉(zhuǎn)錄 因子激活基序VP16編碼基因（如SEQ ID No. 4所示）的下游。
[0039] 2. 1將上述PCR產(chǎn)物克隆到pDONER克隆載體上
[0040] 按照PrimeSTAR聚合酶擴(kuò)增體系和反應(yīng)程序進(jìn)行PCR。此過(guò)程中包含兩輪 PCR，第一輪PCR的引物用加部分adaptor attB接頭的基因引物（F和R)，而第二輪的 模板用第一輪的PCR產(chǎn)物，并且引物用完整的adaptor attB引物（attB5' adaptor : 5'-GTGGGGACAAGTTTG TACAAAAAAGCAGGCTTC-3'，attB3' adaptor :5'-GTGGGGACCAC TTTGTACAAGAAAGCTGGGTC-3'）。將 PCR 產(chǎn)物克隆到 pDONER 克隆載體(購(gòu)自 Invitrogen)上， 經(jīng)測(cè)序鑒定得到與目的基因完全相同的序列。
[0041] 2. 2植物表達(dá)載體的構(gòu)建
[0042] 以植物雙元表達(dá)載體pCambial301_UbiN (圖6)左右邊界包含的序列為骨架序列， 通過(guò)體外重組，將ubi promoter-VP64-Gateway表達(dá)單兀、35S promoter-asRED表達(dá)單兀和 35S promoter-hyg表達(dá)單元與之融合構(gòu)建，得到載體nVP64_hyg_asRED的全序列如SEQ ID No. 5所示，載體圖譜見(jiàn)圖1。
[0043] 表達(dá)載體nVP64-hyg_asRED含有Gateway重組系統(tǒng)，pDONR帶有目的基因的質(zhì)粒 作為入門載體（Entery vector),通過(guò)LR反應(yīng)可完成目的基因表達(dá)載體的構(gòu)建。
[0044] 通過(guò)LR反應(yīng)將0s05g27980基因的CDS序列構(gòu)建到其目的基因的5'端連有VP64 編碼基因的植物表達(dá)載體nVP64-hyg-asRED上，獲得攜帶有編碼所述組成型水稻轉(zhuǎn)錄因 子 VP64-Linker-0s05g27980 基因的表達(dá)載體 ubi :VP64-0s05g27980,其全序列如 SEQ ID No. 6所示，載體圖譜見(jiàn)圖2。
[0045] LR反應(yīng)體系如下：
[0046] 表達(dá)載體 lyl(30-50ng)
[0047] 入門載體（pDONR-gene) 1 μ I (30_50ng)
[0048] LR Clonase Enzyme Mix I μ I
[0049] ddH20 2 μ I
[0050] 總體積 5μ I
[0051] 于25°C反應(yīng)過(guò)夜。用反應(yīng)體系轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a，篩選陽(yáng)性克隆。
[0052] 實(shí)施例2轉(zhuǎn)基因水稻植株的獲得
[0053] 取水稻'kitaake'成熟種子，人工或機(jī)械脫殼，挑選飽滿光潔無(wú)菌斑的種子經(jīng)消毒 之后接種到誘導(dǎo)培養(yǎng)基上進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)。選擇外觀良好，生長(zhǎng)力好的水稻愈傷組織為受體 材料，采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將ubi :VP64-0s01g36630轉(zhuǎn)入水稻愈傷組織中，用含有100 μ M的 乙酰丁香酮和OD值為0. 7的農(nóng)桿菌的AAM培養(yǎng)液進(jìn)行轉(zhuǎn)化，將轉(zhuǎn)化液浸泡過(guò)的愈傷組織置 于共培養(yǎng)基上進(jìn)行共培養(yǎng)，25°C暗培養(yǎng)3d后置于篩選培養(yǎng)基上培養(yǎng)約30d，每IOd繼代一 次。然后將篩出的抗性愈傷轉(zhuǎn)移到分化培養(yǎng)基上分化約20d，每IOd繼代一次。將分化出綠 色小苗的抗性愈傷轉(zhuǎn)移到生根培養(yǎng)基上生根，待約7d長(zhǎng)出發(fā)達(dá)根系后煉苗，并計(jì)算轉(zhuǎn)化所 獲轉(zhuǎn)基因苗數(shù)。煉苗7d后轉(zhuǎn)移至大田生長(zhǎng)。獲得30株轉(zhuǎn)基因苗。
[0054] 本實(shí)施例中涉及的培養(yǎng)基配方如下：
[0055] 誘導(dǎo)培養(yǎng)基：N6大量+B5微量+NB有機(jī)+鐵鹽+銅鈷母液+2. 5mg/L2, 4D+0. 6g/L 酸水解酪蛋白+2. 878g/L脯氨酸+0. 5g/L谷氨酰胺+30g/L鹿糖，以水配制，調(diào)pH至5. 8? 5. 9后加入植物凝膠4g/L。
[0056] 共培養(yǎng)基：N6大量+B5微量+NB有機(jī)+鐵鹽+2. 5mg/L2, 4D+0. 5g/L谷氨酰胺 +0. 6g/L酸水解酪蛋白+10g/L葡萄糖+30g/L鹿糖，以水配制，調(diào)pH至5. 2后加入植物凝膠 4g/L。滅菌后，50°C左右加入AS (乙酰丁香酮）100?200yg/mL。
[0057] 篩選培養(yǎng)基：N6大量+B5微量+NB有機(jī)+鐵鹽+銅鈷母液+2. 5mg/L2, 4D+0. 6g/L 酸水解酪蛋白+2. 878g/L脯氨酸+0. 5g/L谷氨酰胺+30g/L鹿糖，以水配制，調(diào)pH至5. 8? 5. 9后加入植物凝膠4g/L。滅菌后加入35mg/L潮霉素(購(gòu)自上海紐津生物技術(shù)有限公司）。
[0058] 分化培養(yǎng)基：MS無(wú)機(jī)+MS-B5微量+MS有機(jī)+鐵鹽+MS-銅鈷母液+0. 05mg/L NAA+2. Omg/L Kinetin (激動(dòng)素）+30g/L山梨醇+2g/L水解酪蛋白+30g/L鹿糖，以水配制， 調(diào)pH至5. 8?5. 9后加入植物凝膠4g/L。
[0059] 實(shí)施例3轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性株系的鑒定
[0060] 為檢測(cè)實(shí)施例2獲得的VP64-0s01g36630轉(zhuǎn)基因水稻株系中ubi : VP64-0s01g36630基因在T2代轉(zhuǎn)基因水稻（NV0584H-27、NV0584H-29)中的過(guò)表達(dá)情況，本 實(shí)施例在載體與目的基因接頭處設(shè)計(jì)引物（正向引物：5' -GTGGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAG GCTTC-3' 和反向引物：5'-GTGGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTC-3'）進(jìn)行 PCR 檢測(cè)，得到了 明顯的特異性條帶。由圖3可見(jiàn)，擴(kuò)增出的條帶大小在IOOObp以上，且引物是在載體與目 的基因接頭處設(shè)計(jì)的，擴(kuò)增出的片段大小與目的基因（1188bp)基本一致。因此可以說(shuō)明， 實(shí)施例2獲得的轉(zhuǎn)基因水稻株系NV0584H-27、NV0584H-29中含有VP64-0s01g36630融合基 因。
[0061] 實(shí)施例4轉(zhuǎn)基因水稻表型分析和考種分析
[0062] 將實(shí)施例2獲得的轉(zhuǎn)基因水稻株系NV0584H-27、NV0584H-29和野生型水稻種子進(jìn) 行比較，從表型上可以明顯的看出，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因材料的籽粒明顯變長(zhǎng)（圖4)。考種數(shù)據(jù)分析 表明（圖5)，本發(fā)明獲得的VP64-0s01g36630轉(zhuǎn)基因水稻籽粒的粒長(zhǎng)顯著大于野生型水稻 籽粒。
[0063] 雖然，上文中已經(jīng)用一般性說(shuō)明及具體實(shí)施方案對(duì)本發(fā)明作了詳盡的描述，但在 本發(fā)明基礎(chǔ)上，可以對(duì)之作一些修改或改進(jìn)，這對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見(jiàn)的。因 此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎(chǔ)上所做的這些修改或改進(jìn)，均屬于本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。
【權(quán)利要求】
1. 一種組成型水稻轉(zhuǎn)錄因子，其特征在于，其為融合蛋白（VP16)4~Linker-〇s01g36630 ； 其中，VP16為來(lái)自單純皰疹病毒的VP16蛋白，（VP16)4是由4個(gè)VP16蛋白的氨基酸 序列以Gly-Ser為間隔形成的融合蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID No. 10所示；Linker由39 個(gè)柔性氨基酸串聯(lián)而成，其氨基酸序列如SEQ ID No. 9所示；0s01g36630為水稻轉(zhuǎn)錄因子 0s01g36630,其氨基酸序列如SEQ ID No. 2所示，或該序列經(jīng)替換、缺失或添加一個(gè)或幾個(gè) 氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。
2. 編碼權(quán)利要求1所述組成型水稻轉(zhuǎn)錄因子的基因。
3. 含有權(quán)利要求2所述基因的載體。
4. 含有權(quán)利要求2所述基因的工程菌。
5. -種轉(zhuǎn)基因水稻植株的構(gòu)建方法，其特征在于，采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法，將權(quán)利要求 3所述的載體轉(zhuǎn)入水稻愈傷組織中，用含誘導(dǎo)劑和農(nóng)桿菌的AAM培養(yǎng)液進(jìn)行轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化后的 材料經(jīng)過(guò)共培養(yǎng)-篩選-分化-生根-轉(zhuǎn)基因苗的鍛煉和移栽，篩選轉(zhuǎn)基因水稻植株。
6. 權(quán)利要求2所述的基因在改良水稻籽粒性狀中的應(yīng)用。
7. 用于擴(kuò)增水稻轉(zhuǎn)錄因子0s01g36630基因CDS序列的引物對(duì)，其特征在于， 包括正向引物 F :5'-CAAAAAAGCAGGCTTCATGTC GATGCGGGAGITT-3' 和反向引物 R : 5'-CAAGAAAGCTGGGTCC TATCTATCAGAGAGAGCA-3' ； 其中，水稻轉(zhuǎn)錄因子0s01g36630基因的⑶S序列為： SEQ ID No. 1所示的核苷酸序列。
8. 水稻轉(zhuǎn)錄因子0s01g36630基因CDS序列在調(diào)控水稻籽粒性狀中的應(yīng)用。
9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，其特征在于，其是利用轉(zhuǎn)錄因子激活基序VP64與水稻 轉(zhuǎn)錄因子0s01g36630融合構(gòu)建得到組成型轉(zhuǎn)錄因子，并將編碼所述組成型轉(zhuǎn)錄因子的基 因轉(zhuǎn)化水稻，從而改良轉(zhuǎn)基因水稻籽粒的性狀； 其中，所述轉(zhuǎn)錄因子激活基序VP64的氨基酸序列如SEQ ID No. 10所示。
10. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，其特征在于，其是將水稻轉(zhuǎn)錄因子0s01g36630基因 的⑶S序列通過(guò)Gateway系統(tǒng)構(gòu)建到轉(zhuǎn)錄因子激活基序VP64編碼基因的下游，轉(zhuǎn)化水稻， 從而改良轉(zhuǎn)基因水稻籽粒的性狀； 其中，所述轉(zhuǎn)錄因子激活基序VP64編碼基因的核苷酸序列如SEQ ID No. 4所示。
【文檔編號(hào)】A01H5/00GK104371023SQ201310351663
【公開(kāi)日】2015年2月25日 申請(qǐng)日期:2013年8月13日 優(yōu)先權(quán)日:2013年8月13日
【發(fā)明者】劉斌, 張宮璞, 劉軍, 趙濤, 李宏宇, 林辰濤 申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所