三七及屏邊三七病程相關(guān)功能基因的克隆的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及三七及屏邊三七植物體內(nèi)的一些病程相關(guān)功能基因，該基因系首次利用RT-PCR技術(shù)從三七和屏邊三七中克隆而得到，詳細(xì)序列見序列表1。植物在長(zhǎng)期進(jìn)化進(jìn)程中已發(fā)展出一套復(fù)雜機(jī)制用于抵抗壞境中的有害生物入侵，當(dāng)病原菌入侵時(shí)，抗病相關(guān)基因能否被有效誘導(dǎo)以及表達(dá)量大小差異是造成寄主植株最終表現(xiàn)為抗病或者感病現(xiàn)象的根本原因。因此，該基因的克隆將有助于揭示三七及其他藥用植物抗病分子機(jī)理，同時(shí)對(duì)未來三七抗病新品種的培育也具有著重要的理論指導(dǎo)意義。
【專利說明】三七及屏邊三七病程相關(guān)功能基因的克隆

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及利用RT-PCR技術(shù)克隆三七及屏邊三七病程相關(guān)功能基因的一種技 術(shù)。

【背景技術(shù)】
[0002] 植物病害是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)當(dāng)中所面臨的一種主要限制因子，藥用植物在其栽培過程中 也同樣面臨著一樣的問題。植物受到病害感染之后，常常表現(xiàn)為嚴(yán)重的連作障礙問題、產(chǎn)量 劇減、藥用有效成分降低及品質(zhì)變劣等一系列問題。
[0003] 三七[Panax notoginseng(Burk)F. H. Chen]為五加科人參屬植物，又稱"南國(guó)神 草"、"金不換"等，是我國(guó)重要的名貴中藥材之一。三七屬于塊根入藥，有顯著的止血、活血 化淤、消腫定痛之功效，其使用歷史已有近600年。李時(shí)珍《本草綱目》記載：三七性溫、微 苦、味甘、歸肝、腎、胃經(jīng)，具有止血化瘀、消腫定痛之功，能治一切血病。
[0004] 三七屬于栽培馴化較早的中藥材之一，至今為止其人工栽培歷史已有400多年。 而這種長(zhǎng)期的、規(guī)?；脑耘嗍沟萌咴谧陨矸N植中暴露出很多問題，主要表現(xiàn)為品質(zhì)降 低、產(chǎn)量不穩(wěn)定、極易感染病蟲害等等。
[0005] 屏邊三七[Panax stipuleanatus Η. T. Tsai et K. M. Feng]亦是人參屬植物，為 三七近緣植物物種之一，又名"野三七"、"香刺"、"土三七"等。據(jù)三七研究院孫玉琴等老師 們長(zhǎng)期的觀察發(fā)現(xiàn)：在同樣的生長(zhǎng)及栽培環(huán)境條件下，發(fā)現(xiàn)屏邊三七表現(xiàn)為極少感病，基本 上對(duì)三七病害免疫。這就為三七抗病基因的挖掘、開發(fā)利用提供了可能。
[0006] 最近的幾年里，人們克隆到了多個(gè)植物抗病基因使得對(duì)寄主與病原相互作用分子 機(jī)理的研究得到迅速的發(fā)展。植物在生長(zhǎng)發(fā)育過程中常受到一些病原物的侵襲，表現(xiàn)為抗 病或感病，在長(zhǎng)期的相互作用及相互選擇、協(xié)同進(jìn)化的過程中，植物逐漸獲得了一些列復(fù)雜 的防御機(jī)制來保護(hù)自己。這些機(jī)制包括植物細(xì)胞對(duì)病原菌的識(shí)別，胞內(nèi)信號(hào)的轉(zhuǎn)換與傳導(dǎo)， 防衛(wèi)反應(yīng)的開啟與系統(tǒng)獲得抗性的形成。植物體最終會(huì)表現(xiàn)為產(chǎn)生加固和阻止病原生長(zhǎng)的 細(xì)胞壁成分；合成小分子抑菌物質(zhì)如植保素（phytoalexin)，毒性酚類小分子化合物；誘導(dǎo) 產(chǎn)生各種病程相關(guān)蛋白（pathogenesis related, PR蛋白）如幾丁質(zhì)酶、葡聚糖酶等；蛋白 酶抑制劑的生成；釋放各種活性氧；誘導(dǎo)植產(chǎn)生物內(nèi)原激素等等一系列復(fù)雜的生化過程。
[0007] 因此，對(duì)植物抗性基因的克隆成為當(dāng)前研究的熱點(diǎn)。自1992年第一個(gè)植物R基因 Hml被克隆以來，越來越多植物中的R基因被克隆。在植物抗病基因的克隆工作中，圖位克 隆（positional cloning,map-based cloning)和轉(zhuǎn)座子標(biāo)記技術(shù)（transposon tagging) 是常用的兩種技術(shù)。如玉米抗圓斑病基因 Hml，番茄抗葉霉病基因 Cf-9, Cf-4,煙草抗煙草 花葉病毒基因 N，亞麻抗葉銹基因 L6和M等均是利用轉(zhuǎn)座子標(biāo)記技術(shù)克隆到的抗病基因。大 麥抗白粉病基因 Mlo,番茄抗葉霉病基因 Cf-2,抗葉斑病基因 Pto和Prf基因、抗枯萎病基 因12,擬南芥抗丁香假單胞桿菌基因 RPS2、RPM1，水稻抗白葉枯病基因 Xa21、Xal、抗稻瘟病 基因 Pib均是利用圖位克隆技術(shù)得到。然而，轉(zhuǎn)座子標(biāo)簽法需要篩選并鑒定突變體、工作量 較大、加之插入位點(diǎn)的不確定性也大大地限制了在其他植物上的應(yīng)用；圖位克隆法則要求 有高密度的分子標(biāo)記圖譜，而藥用植物中大都存在有遺傳背景不清、分子標(biāo)記缺失等問題， 這些問題的存在使得想要利用圖位克隆技術(shù)研究相關(guān)基因變得比較困難。
[0008] 從已被克隆R基因來看，雖然這些R基因針對(duì)不同的細(xì)菌、真菌、病毒和線蟲，但它 們的產(chǎn)物卻具有著令人驚奇的結(jié)構(gòu)相似性。而且抗性基因常常以基因家族（family)的形 式出現(xiàn)，不同植物中的同類基因之間具有著較高的保守性。這對(duì)于那些使用常規(guī)基因克隆 技術(shù)困難的植物來說，提供了一種克隆抗性基因的途徑。本發(fā)明通過使用三七近緣屬植物 人參、西洋參EST數(shù)據(jù)，經(jīng)序列拼接、基因功能注釋、KEGG作圖，最后成功地克隆出三七和屏 邊三七中部分病程相關(guān)功能基因，這些基因在其他藥用植物研究當(dāng)中還沒有相關(guān)報(bào)道。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0009] 本發(fā)明提供了一種三七病程相關(guān)功能基因克隆的方法。
[0010] 本發(fā)明提供了一些病程相關(guān)功能基因，它是下列核苷酸序列之一：
[0011] 序列表中R ID No. 1的DNA序列；
[0012] 與序列表中R ID No. 1限定的DNA序列具有一個(gè)或幾個(gè)堿基突變，且編碼相同功 能蛋白質(zhì)的DNA序列。
[0013] -種由上述基因所編碼的蛋白質(zhì)，具有序列表中序列2的氣基酸殘基序列或?qū)⑿?列2的氨基酸殘基序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代且具有序列2的氨基酸殘基序列 相同活性的由序列2衍生的蛋白質(zhì)。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0014] 圖1病原與植物之間識(shí)別KEGG代謝通路圖
[0015] 圖29個(gè)病程相關(guān)候選引物在三七及屏邊三七中的PCR擴(kuò)增結(jié)果
[0016] 樣品編號(hào)：M :DL2000DNA marker 由上至下依次為 2000bp、1000bp、750bp、500bp、 250bp、100bp ;PN，三七；PS，屏邊三七；1，cn ;2，contig27 ;3，contigl56 ;4，contig335 ;5， contig534 ;6, contig552 ;7, contig622 ;8, contig829 ;9, contigl030。

【具體實(shí)施方式】
[0017] 1、三七及屏邊三七總RNA的提取和檢測(cè)
[0018] 取云南文山三七（panax notoginseng)及屏邊三七（panax stipuleanatus)根 各lg，在研缽中用液氮快速研磨成粉末，取研磨后的樣品〇. Ig置于無 RNase的I. 5ml離 心管中，加入Iml的Trizol至粉碎的樣本中，輕輕顛倒混勻，室溫放置5min ;4°C條件下 12000rpm離心5min ;取上清至新的EP管中，加入200μ L的氯仿，劇烈震蕩約15s，室溫條 件下放置3min ;4-C條件下12000rpm離心15min ;取上清至新的EP管中，保證不要吸到組織 碎片。加入500μ L的異丙醇上下輕輕顛倒混勻，室溫放置IOmin ;4°C條件下12000rpm離 心IOmin ;此時(shí)EP管底部會(huì)有白色沉淀，棄上清后，加入IOOOyL的75%乙醇。短暫渦旋后 4°C條件下12000rpm離心Imin去上清后，室溫干燥IOmin溶于IOOyL DEPC處理的水中， 用1. 0%瓊脂糖電泳檢測(cè)RNA的完整性，用GenQuant核酸定量?jī)x測(cè)定A260、A280比值和濃 度。置于-80°C冰箱備用。
[0019] 2、逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA
[0020] 使用TIANScript cDNA第一鏈合成試劑盒（北京天根生物技術(shù)有限公司）逆轉(zhuǎn) 錄合成cDNA。具體操作步驟如下：在冰浴的無核酸酶的離心管中加入2 μ g總RNA、2 μ L 的 01igo(dT)15 引物、2yL 的 SuperPure dNTP(2.5mM each)，補(bǔ) RNase-Free ddH20 定容 至14. 5μ L ;70°C加熱5min后迅速在冰上冷卻2min。簡(jiǎn)短離心后加入以下組分：4μ L的 5XFirst-Strand Buffer，0.5yL RNasin;加入 lyL(200U)TIANScript M-MLV，輕輕用移 液器混勻；42°C溫浴50min，然后95°C加熱5min終止反應(yīng)；置于冰上后用RNase-Free CldH2O 將反應(yīng)體系稀釋到50 μ L，置于-20°C冰箱保存。
[0021] 3、病程相關(guān)功能基因的獲得及引物設(shè)計(jì)
[0022] 截止6月5號(hào)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)網(wǎng)站（http://www. ncbi. nlm. nih. gov/)共收錄人參 (Panax ginseng)EST 序列 11，412 條、西洋參（Panax quinquefoliusm)EST 序列 5, 018 條。 首先使用EGassembler工具對(duì)這些序列進(jìn)行拼接，具體如下：人參當(dāng)中的6158條拼接成了 1，304條更長(zhǎng)的EST，而另外的5254條無法拼成更長(zhǎng)的EST，因此最后總共得到了 6558條拼 接好的序列。這些拼接好的序列用KAAS工具進(jìn)行KEGG注釋。6558個(gè)拼接好的序列中1536 個(gè)有KEGG注釋，分布在278條KEGG通路上，其中和代謝相關(guān)的通路有113條；西洋參當(dāng)中 的2147條拼接成了 539條更長(zhǎng)的EST，而另外的2871條無法拼成更長(zhǎng)的EST，因此最后總 共得到了 3410條拼接好的序列。這些拼接好的序列用KAAS工具進(jìn)行KEGG注釋。3410個(gè) 拼接好的序列中812個(gè)有KEGG注釋，分布在253條KEGG通路上，其中和代謝相關(guān)的通路有 101 條。
[0023] 根據(jù)基因注釋結(jié)果及病原與植物間互作代謝通路圖基因分布，最終挑選出9個(gè)病 程候選基因。其中7個(gè)候選基因的編碼區(qū)內(nèi)具有完整的起始密碼子和終止密碼子，而另外 的2個(gè)候選基因僅有起始密碼子。使用引物設(shè)計(jì)軟件primer5. 0對(duì)具有完整起始密碼子和 終止密碼子的7個(gè)候選基因分別進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，正向引物位于或者包含起始密碼子、反向 引物位于或者包含終止密碼子。另外2個(gè)候選基因引物設(shè)計(jì)時(shí)，除正向引物包含起始密碼 子外，反向引物設(shè)計(jì)時(shí)盡可能靠近3'末端，引物相關(guān)詳細(xì)信息見下表1。
[0024] 表1病程候選基因引物設(shè)計(jì)詳細(xì)信息表
[0025]

【權(quán)利要求】
1. 病程相關(guān)功能基因，它是下列核苷酸序列之一： 1) 序列表1的DNA序列； 2) 由序列表1通過一個(gè)或幾個(gè)核苷酸的添加、刪除、取代而得到的序列。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的基因，其特征在于：所述病程相關(guān)基因?yàn)樾蛄斜?所示的核 苷酸序列。
3. 權(quán)利要求1所述的基因在三七育種中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】A01H5/00GK104278039SQ201310273521
【公開日】2015年1月14日 申請(qǐng)日期:2013年7月2日 優(yōu)先權(quán)日:2013年7月2日
【發(fā)明者】黃璐琦, 申業(yè), 崔秀明, 李瑞博, 劉玉忠 申請(qǐng)人:中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所