專利名稱：東北紅豆杉開放式簡化培養(yǎng)基的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于植物組織培養(yǎng)工廠化育苗培養(yǎng)基技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種東北紅豆杉開放式簡化植物組織培養(yǎng)基。
背景技術(shù)：
目前，雖然已經(jīng)有上千種植物的組織培養(yǎng)取得了成功，但能真正用于商品化生產(chǎn)的植物種類不多。常規(guī)的封閉式組培有許多局限，如:配制培養(yǎng)基所用化學(xué)藥品種類繁多，用量多，要求精細(xì)，價格昂貴，組織培養(yǎng)過程中對設(shè)備要求嚴(yán)格，并且要求嚴(yán)格的滅菌條件，導(dǎo)致耗電量較大，生根方法煩瑣，且有的組培苗生根很難，移栽適應(yīng)能力差，成活率低等問題使組培成本大大提高，甚至導(dǎo)致試管苗比普通苗價格高幾倍甚至幾十倍的成本，廣大種植者無力購買，試管苗銷售量下降，嚴(yán)重限制了該技術(shù)的擴(kuò)大和推廣，致使許多品種沒有得到開發(fā)利用。針對以上問題，我們開展了開放式植物簡化組織培養(yǎng)技術(shù)研究，具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種成本低、初培芽誘導(dǎo)及萌動效果好，繼代苗增殖率高，芽的平均伸長量大的東北紅豆杉開放式簡化培養(yǎng)基。為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明的東北紅豆杉開放式簡化培養(yǎng)基包括初代培養(yǎng)基和繼代培養(yǎng) 基；所述初代培養(yǎng)基通過在優(yōu)化的B5基礎(chǔ)母液中加入卡拉膠、白砂糖、吲哚丁酸IBA、活性炭AC和農(nóng)用鏈霉素混合制成；混合液中卡拉膠濃度為6 10g/L,白砂糖濃度為20 30g/L，吲哚丁酸IBA濃度為2.5 5.0mg/L,活性炭AC濃度為0.5 2.5g/L，農(nóng)用鏈霉素濃度為0.10 0.50g/L ；所述優(yōu)化的B5基礎(chǔ)母液中，無機(jī)鹽組成如下:KN03:1500-3000mg/L ；MgS04.7H20:250-500mg/L ；CaC12.2H20:100-150mg/L ；(NH4) 2S04:70-134mg/L ；NaH2P04.H20:75-150mg/L ;其余成分及使用濃度與標(biāo)準(zhǔn) B5 培養(yǎng)
基相同；所述繼代培養(yǎng)基通過在優(yōu)化的MS基礎(chǔ)母液中加入卡拉膠、白砂糖、吲哚丁酸IBA、6-卞氨基腺嘌呤BA、活性炭AC和農(nóng)用鏈霉素混合制成；混合液中卡拉膠濃度為8 IOg/L,白砂糖濃度為20 30g/L，吲哚丁酸IBA濃度為1.0 3.0mg/L, 6-卞氨基腺嘌呤BA濃度為0.03 1.00mg/L,活性炭AC濃度為0.5 2.5g/L，農(nóng)用鏈霉素濃度為0.10 0.50g/L ；所述優(yōu)化的MS基礎(chǔ)母液中，無機(jī)鹽組成如下:硝酸鉀KN03:950-1900mg/L ;硝酸銨 NH4N03:825-1650mg/L ;磷酸二氫鉀 KH2P04:85-170mg/L ;硫酸鎂 MgS04.7H20:185-370mg/L ;氯化鈣 CaC12.2H20:220_440mg/L，其余
成分及使用濃度與標(biāo)準(zhǔn)MS培養(yǎng)基相同。
所述優(yōu)化的B5基礎(chǔ)母液中，無機(jī)鹽組成優(yōu)選如下:KN03:1500-1550mg/L ；MgS04.7H20:250-270mg/L ；CaC12.2H20: 100-1lOmg/L ；(NH4) 2S04:70-80mg/L ；NaH2P04.H20:75-85mg/L ;其余成分及使用濃度與標(biāo)準(zhǔn)B5培養(yǎng)基相同。所述優(yōu)化的MS基礎(chǔ)母液中，無機(jī)鹽組成優(yōu)選如下:硝酸鉀KN03:950-1000mg/L ;硝酸銨 NH4N03:825-850mg/L ;磷酸二氫鉀 KH2P04:85-90mg/L ;硫酸鎂 MgS04.7H20:185-190mg/L ;氯化鈣 CaC12.2H20:220_230mg/L，其余成分及使用濃度與標(biāo)準(zhǔn)MS培養(yǎng)基相同。本發(fā)明的東北紅豆杉組織培養(yǎng)方法包括下述步驟:初代培養(yǎng):取當(dāng)年生半木質(zhì)化2_6cm的莖尖作為外植體，接種于塑料杯的初代培養(yǎng)基中，用透氣膜封口 ；接種后，將接種杯置于人工氣候箱中，溫度25 ± I °C、濕度80 85%、光照強(qiáng)度1700— 20001uX，光暗交替12h/12h，培養(yǎng)15天后獲得初培苗；繼代培養(yǎng):取初培苗接種于塑料杯的繼代培養(yǎng)基中，用透氣膜封口 ；接種后，將接種杯置于人工氣候箱中，溫度25±1°C、濕度80 85%、光照強(qiáng)度1700— 20001UX，光暗交替12h/12h，培養(yǎng) 35-40 天。有益效果:初代培養(yǎng)基中添加0.1%活性炭可以使初代培養(yǎng)芽的萌動時間從13d降為6d，大大降低了初代培養(yǎng)的時間，抑制了褐化現(xiàn)象，可以使初代培養(yǎng)周期縮短一周，提高了成活率，降低了生產(chǎn)成本。初代培養(yǎng)基和繼代培養(yǎng)基當(dāng)中添加了抑菌劑農(nóng)用鏈霉素，對真菌和細(xì)菌均有良好的抑制作用，真菌和細(xì)菌污·染率均能保持在5%以下，配制好的培養(yǎng)基不需要高壓滅菌，簡化了生產(chǎn)程序，降低了生產(chǎn)成本。初代培養(yǎng)和繼代培養(yǎng)均采用塑料杯代替三角瓶，透氣膜和塑料杯可再利用，降低了成本；新開封的塑料杯不需要消毒滅菌處理，可以直接利用，簡化了操作程序；塑料杯無副作用，更有利于苗的生長；初代培養(yǎng)，雖然愈傷組織誘導(dǎo)率差異不顯著，但芽萌動率顯著提高；繼代培養(yǎng)，增殖率及芽平均伸長高度均顯著高于三角瓶；由于塑料杯內(nèi)濕度較低，溫度與外界環(huán)境溫度基本處于平衡，不利于雜菌的滋生，因而塑料杯培養(yǎng)基不易發(fā)生污染，利于開放式簡化組培的進(jìn)行。除各種營養(yǎng)元素母液采用蒸餾水配置以外，其余均可采用自來水代替蒸餾水，從而間接簡化了培養(yǎng)程序及成本。我們采用開放式簡化組培優(yōu)勢:由于基礎(chǔ)母液中大量元素減半，卡拉膠代替瓊脂粉，白砂糖代替蔗糖，IBA取替NAA和BA，塑料杯代替玻璃瓶，自來水代替蒸餾水，抑菌劑代替高壓滅菌和嚴(yán)格封閉環(huán)境操作。所以，接種速度為封閉式組培的3-5倍，明顯節(jié)省了培養(yǎng)基成本和接種時間，省略了高壓滅菌程序，簡化了生產(chǎn)流程，可以使在工廠化育苗中減少人力和設(shè)備投資。節(jié)約資金30-50%。初代培養(yǎng)基采用白砂糖作為作為碳源，在對初培芽愈傷組織誘導(dǎo)及芽萌動不產(chǎn)生影響的基礎(chǔ)上，降低了成本；繼代培養(yǎng)基采用白砂糖代替蔗糖作為碳源，在增殖率及芽平均伸長高度不受影響的前提下降低了成本。當(dāng)優(yōu)化的B5基礎(chǔ)母液無機(jī)鹽的含量為B5培養(yǎng)基中無機(jī)鹽含量的一半左右，優(yōu)化的MS基礎(chǔ)母液無機(jī)鹽的含量為MS培養(yǎng)基中無機(jī)鹽含量的一半時，在對初培芽愈傷組織誘導(dǎo)、芽萌動、增殖率及芽平均伸長高度不產(chǎn)生影響的基礎(chǔ)上，顯著降低了成本。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1根據(jù)表1、表2配制初代培養(yǎng)基:a、根據(jù)表I中無機(jī)鹽的使用濃度和標(biāo)準(zhǔn)B5培養(yǎng)基中其他成分的使用濃度配制優(yōu)化的B5基礎(chǔ)母液,分裝于I號、2號、......、7號燒杯中。b、將吲哚丁酸IBA和農(nóng)用鏈霉素加入各燒杯中與優(yōu)化的B5基礎(chǔ)母液混合至所需濃度。C、取一定量自來水(代替蒸餾水)煮沸，用電子天平秤取卡拉膠及糖，將卡拉膠倒
入沸水中煮化，定容至1L,接著倒入白砂糖,溶化后,取卡拉膠液分裝在I號、2號、.......7號燒杯中。分裝后，攪拌均勻。d.用分析天平稱量活性炭加入I號、2號........7號燒杯，當(dāng)液體溫度降低至
60°C以下時在各燒杯中加入農(nóng)用鏈霉素，用玻璃棒攪拌均勻，得到初代培養(yǎng)基；然后將各燒杯置于無菌超凈臺下。e.在超凈臺下將I號、2號........7號燒杯中配好初代培養(yǎng)基分別裝入I號、2
號........7號塑料杯中(新開封的不需要消毒)，每杯50mL，晾涼，凝固后用透氣膜封口，備
用。 根據(jù)表3、表4配制繼代培養(yǎng)基:a、根據(jù)表4中無機(jī)鹽的使用濃度和標(biāo)準(zhǔn)MS培養(yǎng)基中其他成分的使用濃度配制優(yōu)化的MS基礎(chǔ)母液,分裝于6號、7號、......>12號燒杯中。b、將吲哚丁酸IBA，6-卞氨基腺嘌呤BA，農(nóng)用鏈霉素加入各燒杯中與優(yōu)化的MS基礎(chǔ)母液混合至所需濃度。C、其余成分按照與初代培養(yǎng)基相同的方法加入各燒杯中與優(yōu)化的MS基礎(chǔ)母液混
合均勻，最后在超凈臺下分別裝入6號、7號、......、12號塑料杯中，每杯50mL,晾涼,凝固
后用透氣膜封口，備用。實(shí)施例2外植體的制備:試驗前一天取當(dāng)年生半木質(zhì)化2-3cm的莖尖，用流水沖洗12_24小時；在超凈臺下操作，用70%酒精將桌面及手擦拭干凈，點(diǎn)燃酒精燈。 將清洗好的半木質(zhì)化莖尖在無菌超凈臺下進(jìn)行消毒，用75%的酒精消毒30 60s，接著用0.1%升萊(HgCl2)消毒7 8min,消毒后用無菌水(高壓滅菌的自來水)沖洗4 5次，再用無菌濾紙(高壓滅菌的濾紙)吸干表面水潰。將手術(shù)刀、鑷子在酒精燈外沿灼燒，蘸95%的酒精，反復(fù)3遍(大概持續(xù)3min)，晾涼后，用手術(shù)刀將消過毒的半木質(zhì)化莖尖于滅過菌的培養(yǎng)皿上將其基部Icm處葉片切掉，同時切除因消毒而被腐蝕的切口處，外植體制備完畢。實(shí)施例3外植體接種及培養(yǎng)
初代培養(yǎng):在無菌超凈臺下酒精燈旁進(jìn)行接種，用已殺過菌的鑷子將制備好的外植體接種于各塑料杯的初代培養(yǎng)基中，每杯3 4個外植體,每接種一瓶用已消過毒的透氣膜封口。接種后，將接種杯置于人工氣候箱中，各接種杯所處環(huán)境參數(shù)如下:培養(yǎng)條件:溫度26°C、濕度85%、光照強(qiáng)度20001ux，光暗交替12h/12h。初代培養(yǎng)15天后，對各塑料杯中的芽萌動及愈傷組織誘導(dǎo)狀況進(jìn)行統(tǒng)計(實(shí)驗數(shù)據(jù)見表2。繼代培養(yǎng):在無菌超凈臺下酒精燈旁進(jìn)行接種，用已殺過菌的鑷子將初代培養(yǎng)獲得的生長狀況相近的小苗作為材料接種于各塑料杯的繼代培養(yǎng)基中，每接種一瓶用已消過毒的透氣膜封口。接種后，將接種杯置于人工氣候箱中，各接種杯環(huán)境參數(shù)與初代培養(yǎng)相同。繼代培養(yǎng)35天后，對各塑料杯中的增值率及芽平均生長高度狀況進(jìn)行統(tǒng)計(實(shí)驗數(shù)據(jù)見表4)。表I初代培養(yǎng)無機(jī)鹽簡化方案B權(quán)利要求
1.一種東北紅豆杉開放式簡化培養(yǎng)基，包括初代培養(yǎng)基和繼代培養(yǎng)基； 所述初代培養(yǎng)基通過在優(yōu)化的B5基礎(chǔ)母液中加入卡拉膠、白砂糖、吲哚丁酸IBA、活性炭AC和農(nóng)用鏈霉素混合制成；混合液中卡拉膠濃度為6 10g/L,白砂糖濃度為20 30g/L,吲哚丁酸IBA濃度為2.5 5.0mg/L,活性炭AC濃度為0.5 2.5g/L，農(nóng)用鏈霉素濃度為 0.10 0.50g/L ； 所述優(yōu)化的B5基礎(chǔ)母液中，無機(jī)鹽組成如下:KN03:1500-3000mg/L ；MgS04.7H20:250-500mg/L ；CaC12.2H20:100-150mg/L ；(NH4) 2S04:70-134mg/L ；NaH2P04.H20:75-150mg/L ;其余成分及使用濃度與標(biāo)準(zhǔn) B5 培養(yǎng)基相同； 所述繼代培養(yǎng)基通過在優(yōu)化的MS基礎(chǔ)母液中加入卡拉膠、白砂糖、吲哚丁酸IBA、6-卞氨基腺嘌呤BA、活性炭AC和農(nóng)用鏈霉素混合制成；混合液中卡拉膠濃度為8 10g/L，白砂糖濃度為20 30g/L，吲哚丁酸IBA濃度為1.0 3.0mg/L, 6-卞氨基腺嘌呤BA濃度為0.03 1.00mg/L,活性炭AC濃度為0.5 2.5g/L，農(nóng)用鏈霉素濃度為0.10 0.50g/L ； 所述優(yōu)化的MS基礎(chǔ)母液中，無機(jī)鹽組成如下: 硝酸鉀 KN03:950-1900mg/L ；硝酸銨 NH4N03:825-1650mg/L ;磷酸二氫鉀 KH2P04:85-170mg/L ;硫酸鎂 MgS04.7H20:185-370mg/L ;氯化鈣 CaC12.2H20:220_440mg/L，其余成分及使用濃度與標(biāo)準(zhǔn)MS培養(yǎng)基相同。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的東北紅豆杉開放式簡化培養(yǎng)基，其特征在于所述優(yōu)化的B5基礎(chǔ)母液中，無機(jī)鹽組成如下:KN03:1500- 1550mg/L ；MgS04.7H20:250-270mg/L ；CaC12.2H20:100-110mg/L ；(NH4) 2S04:70-80mg/L ；NaH2P04.H20:75-85mg/L ;其余成分及使用濃度與標(biāo)準(zhǔn)B5培養(yǎng)基相同。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的東北紅豆杉開放式簡化培養(yǎng)基，其特征在于所述優(yōu)化的B5基礎(chǔ)母液中，無機(jī)鹽組成如下:KN03:1500mg/L ；MgS04.7H20:250mg/L ；CaCl2.2H20:100mg/L ； (NH4) 2S04:70mg/L ；NaH2P04.H20:75mg/L ;其余成分及使用濃度與標(biāo)準(zhǔn)B5培養(yǎng)基相同。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的東北紅豆杉開放式簡化培養(yǎng)基，其特征在于所述優(yōu)化的MS基礎(chǔ)母液中，無機(jī)鹽組成如下: 硝酸鉀 KN03:950-1000mg/L ；硝酸銨 NH4N03:825-850mg/L ;磷酸二氫鉀 KH2P04:85-90mg/L ;硫酸鎂 MgS04.7H20:185-190mg/L ;氯化鈣 CaC12.2H20:220_230mg/L，其余成分及使用濃度與標(biāo)準(zhǔn)MS培養(yǎng)基相同。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的東北紅豆杉開放式簡化培養(yǎng)基，其特征在于所述優(yōu)化的MS基礎(chǔ)母液中，無機(jī)鹽組成如下: 硝酸鉀 KN03:950mg/L ;硝酸銨 NH4N03:825mg/L ;磷酸二氫鉀 KH2P04:85mg/L ;硫酸鎂MgS04.7H20:185mg/L ;氯化鈣CaC12.2H20:220mg/L,其余成分及使用濃度與標(biāo)準(zhǔn)MS培養(yǎng)基相同。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種東北紅豆杉開放式簡化培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基包括初代培養(yǎng)基和繼代培養(yǎng)基；所述初代培養(yǎng)基通過在優(yōu)化的B5基礎(chǔ)母液中加入卡拉膠、白砂糖、吲哚丁酸IBA、活性炭AC和農(nóng)用鏈霉素混合制成；繼代培養(yǎng)基通過在優(yōu)化的MS基礎(chǔ)母液中加入卡拉膠、白砂糖、吲哚丁酸IBA、6-卞氨基腺嘌呤BA、活性炭AC和農(nóng)用鏈霉素混合制成。本發(fā)明采用開放式簡化組培，用抑菌劑代替高壓滅菌和嚴(yán)格封閉環(huán)境操作，明顯節(jié)省了培養(yǎng)基成本和接種時間，省略了高壓滅菌程序，簡化了生產(chǎn)流程，可以使在工廠化育苗中減少人力和設(shè)備投資，節(jié)約資金30-50%。
文檔編號A01H4/00GK103238522SQ201310204499
公開日2013年8月14日 申請日期2013年5月28日 優(yōu)先權(quán)日2013年5月28日
發(fā)明者王淑杰, 劉麗麗, 袁麗娜, 于海業(yè), 鐘香梅, 李純, 牛海微, 戶新宇, 張蕾, 姚寧寧, 隋媛媛, 趙靜 申請人:吉林大學(xué)