專利名稱：菌根菌劑及其制備方法和用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及菌根菌劑及其制備方法和用途。
背景技術(shù)：
目前，國(guó)內(nèi)對(duì)菌劑產(chǎn)品的研究大都集中于松屬樹種菌劑產(chǎn)品的研究與開發(fā)，而對(duì)板栗菌劑的研究相對(duì)較少，常見的菌劑產(chǎn)品雖然可以侵染板栗，但是侵染率不高，而且多數(shù)菌劑產(chǎn)品的侵染效果隨著長(zhǎng)期應(yīng)用菌種老化等問題的出現(xiàn)而逐漸降低。因此，尋找到一種可以與板栗有良好共生關(guān)系，并可以在人工條件下大量培養(yǎng)的外生菌根真菌，制成菌劑應(yīng)用于生產(chǎn)實(shí)踐，意義重大。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明旨在至少解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的技術(shù)問題之一。為此，本發(fā)明的一個(gè)目的在于提出一種能夠有效應(yīng)用于板栗植株的菌根菌劑及其制備方法。首先，需要說明的是，本發(fā)明是基于發(fā)明人的下列探索和發(fā)現(xiàn)而完成的:發(fā)明人于2011年5月至2012年9月，在河北省唐山市遷西地區(qū)，于多種不同地形的板栗林下采集真菌子實(shí)體，其中，只采集板栗根系形成的菌根與其菌絲相連的子實(shí)體，并將采集到的子實(shí)體，于冰盒內(nèi)低溫保存，及時(shí)帶回實(shí)驗(yàn)室，經(jīng)過多次人工分離、純化后，得到一種新的板栗外生菌根真菌菌種。該菌種的子實(shí)體形態(tài)學(xué)初步鑒定結(jié)果為灰樹花，對(duì)分離后的菌絲進(jìn)行分子鑒定的結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)該與板栗具有良好共生關(guān)系的真菌為灰樹花。灰樹花又名栗磨，其子實(shí)體具有食用和藥用價(jià)值。目前，針對(duì)灰樹花子實(shí)體培養(yǎng)的研究較多，然而利用灰樹花的菌絲制作菌劑，并應(yīng)用于板栗菌根化的研究，尚未見報(bào)道。進(jìn)一步，發(fā)明人通過多次試驗(yàn)，對(duì)灰樹花人工大量培養(yǎng)的條件和利用灰樹花制作菌根菌劑的方法進(jìn)行了探索，從而篩選獲得了最佳培養(yǎng)條件和菌根菌劑制備方法。此外，發(fā)明人還采用幾種市售的菌劑(綿毛絲膜菌、紅絨蓋牛肝菌和美味牛肝菌)作為對(duì)照，將各種菌劑接種于當(dāng)年生的板栗實(shí)生苗上，然后定期調(diào)查苗木的生長(zhǎng)指標(biāo)并測(cè)定其葉片凈光合速率，調(diào)查菌根侵染率、苗木生物量指標(biāo)及葉片礦質(zhì)元素含量，進(jìn)而通過數(shù)據(jù)比較和分析，以便驗(yàn)證本發(fā)明制備獲得的菌根菌劑的實(shí)際應(yīng)用效果。結(jié)果證明，相對(duì)于目前市售的菌劑，將本發(fā)明的菌根菌劑接種于板栗幼苗后，其在提高苗木的苗高、地徑、地上、地下生物量、凈光合速率和葉片中礦質(zhì)元素N、P、K的含量方面的效果更加顯著。為此，根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，本發(fā)明提出了一種制備菌根菌劑的方法。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，該方法包括:按照37.5 75ml:100g的比例，將灰樹花菌液接入特定固體培養(yǎng)基中，并于25攝氏度下培養(yǎng)3周，以便獲得菌根菌劑，其中，所述特定固體培養(yǎng)基由重量比為7.5 6.5:1.25 1.75:1.25 1.75的草炭、蛭石和珍珠巖均勻混合而成。發(fā)明人驚奇地發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明的方法成本低、效率高、簡(jiǎn)單易行，適于工廠化大批量生產(chǎn)，并且制備獲得的菌根菌劑，對(duì)板栗植株的侵染效果非常好，且接種于板栗幼苗后，在提高苗木的苗高、地徑、地上、地下生物量、凈光合速率和葉片中礦質(zhì)元素N、P、K的含量方面的效果顯著，進(jìn)而能夠有效用于提高板栗植株抗干旱及抗病蟲害能力。另外，根據(jù)本發(fā)明上述實(shí)施例的制備菌根菌劑的方法還可以具有如下附加的技術(shù)特征:根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施例，所述灰樹花菌液與所述特定固體培養(yǎng)基的比例為50ml:100go由此，菌絲繁殖快、制備獲得的菌根菌劑性狀優(yōu)良，對(duì)板栗植株的侵染效果更好。根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施例，在該特定固體培養(yǎng)基中，所述草炭、蛭石和珍珠巖的重量比為7:1.5:1.5。由此，能夠使菌絲繁殖迅速、制備獲得的菌根菌劑性狀優(yōu)良，對(duì)板栗植株的侵染效果更好。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，每IOOOg該特定固體培養(yǎng)基中包含25g紅糖。這是因?yàn)椋t糖能夠?yàn)榫z提供大量的其繁殖所需的碳源，以及維生素和微量元素，從而能夠加速其繁殖。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述灰樹花菌液是通過以下步驟獲得的:將所述灰樹花菌進(jìn)行活化；以及將經(jīng)過活化的灰樹花菌進(jìn)行液體培養(yǎng)，以便獲得所述灰樹花菌液。由此，獲得的菌液活性非常高，接種于所述特定固體培養(yǎng)基后繁殖迅速，制備獲得的菌根菌劑性狀優(yōu)良，對(duì)板栗植株的侵染效果好。。其中，根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，將灰樹花菌進(jìn)行活化的方法不受特別限制，只要能夠有效活化菌種，獲得繁殖力優(yōu)越的菌種即可。根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施例，通過平板培養(yǎng)實(shí)現(xiàn)所述活化。由此，方法簡(jiǎn)單，易于操作，菌種活性效果好。根據(jù)本發(fā)明的一些具體實(shí)施例，將經(jīng)過活化的灰樹花菌進(jìn)行液體培養(yǎng)，進(jìn)一步包括:取直徑0.65cm圓形等質(zhì)的經(jīng) 過活化的灰樹花菌菌片15個(gè)，加入裝有25ml MMN液體培養(yǎng)基的三角瓶中，之后放入搖床內(nèi)培養(yǎng)，設(shè)置溫度25°C，轉(zhuǎn)速140R/min，暗培養(yǎng)12d。由此，培養(yǎng)獲得的灰樹花菌液活性非常高，接種于所述特定固體培養(yǎng)基后繁殖迅速，制備獲得的菌根菌劑性狀優(yōu)良，對(duì)板栗植株的侵染效果好。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，通過上述方法制備獲得的菌根菌劑，每克菌根菌劑中含有孢子1X1011。由此，培養(yǎng)獲得的灰樹花菌液活性非常高，接種于所述特定固體培養(yǎng)基后繁殖迅速，制備獲得的菌根菌劑性狀優(yōu)良，對(duì)板栗植株的侵染效果好。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)具體示例，本發(fā)明的制備菌根菌劑的方法包括以下步驟:首先，將灰樹花進(jìn)行平板培養(yǎng)活化。接著，取直徑0.65cm圓形等質(zhì)的經(jīng)過活化的灰樹花菌菌片15個(gè),加入裝有25mlMMN液體培養(yǎng)基的三角瓶中，之后放入搖床內(nèi)培養(yǎng)，設(shè)置溫度25°C，轉(zhuǎn)速140R/min，暗培養(yǎng)12d，以便獲得灰樹花菌液。然后，取50ml灰樹花菌液接入裝有IOOg含有草炭:蛭石:珍珠巖=7:1.5:1.5的特定固體培養(yǎng)基以及2.5g紅糖的培養(yǎng)瓶中，于25°C下培養(yǎng)三周(21d)，以便獲得菌根菌劑。根據(jù)本發(fā)明的又一方面，本發(fā)明還提出了一種菌根菌劑。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，該菌根菌劑是通過前面所述的方法制備獲得的。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，本發(fā)明的菌根菌劑對(duì)板栗植株的侵染效果非常好，且接種于板栗幼苗后，在提高苗木的苗高、地徑、地上、地下生物量、凈光合速率和葉片中礦質(zhì)元素N、P、K的含量方面的效果顯著，進(jìn)而能夠有效用于提高板栗植株抗干旱及抗病蟲害能力。
根據(jù)本發(fā)明的再一方面，本發(fā)明還提出了前面所述的菌根菌劑，在提高板栗植株抗干旱及抗病蟲害能力中的用途。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，該用途的實(shí)現(xiàn)方法并不受特別限制，只要保證菌根菌劑能夠有效侵染板栗植株即可。進(jìn)一步，本發(fā)明提出了一種提高板栗植株抗干旱及抗病蟲害能力的方法。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，該方法包括選自下列步驟的至少之一:向所述板栗植株幼苗的培養(yǎng)基質(zhì)中添加前面所述的本發(fā)明的菌根菌劑；以及利用該菌根菌劑接種所述板栗植株。發(fā)明人驚奇地發(fā)現(xiàn)，利用該方法，采用本發(fā)明的菌根菌劑，能夠有效地提高板栗植株的苗高、地徑、地上、地下生物量、凈光合速率和葉片中礦質(zhì)元素N、P、K的含量方面，進(jìn)而能夠有效提高板栗植株的抗干旱及抗病蟲害能力。其中，需要說明的是，在本文中所采用的術(shù)語“培養(yǎng)基質(zhì)”并不受特別限制。當(dāng)采用傳統(tǒng)方法培養(yǎng)板栗植株幼苗時(shí)，該培養(yǎng)基質(zhì)即為普通土壤；當(dāng)利用市售的營(yíng)養(yǎng)土培養(yǎng)板栗植株幼苗時(shí)，所述培養(yǎng)基質(zhì)即為該營(yíng)養(yǎng)土；當(dāng)采用無土栽培方法培養(yǎng)板栗植株幼苗時(shí)，該培養(yǎng)基質(zhì)則其所采用的無土的培養(yǎng)基質(zhì)。由此，無論采用何種培養(yǎng)基質(zhì)進(jìn)行板栗植株培養(yǎng)，均可以有效地提高板栗植株的苗高、地徑、地上、地下生物量等，進(jìn)而能夠有效提高板栗植株的抗干旱及抗病蟲害能力。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，將所述菌根菌劑接種于所述板栗植株根部，優(yōu)選發(fā)達(dá)的側(cè)根。根據(jù)本發(fā)明的一些具體示例，本發(fā)明的菌根菌劑尤其適用于板栗幼苗。其中，需要說明的是，用于接種的板栗幼苗，需要有發(fā)達(dá)的側(cè)根，從而易于菌根菌劑侵染。本發(fā)明的附加方面和優(yōu)點(diǎn)將在下面的描述中部分給出，部分將從下面的描述中變得明顯，或通過本發(fā)明的實(shí)踐了解到。
具體實(shí)施例方式下面詳細(xì)描述本發(fā)明的實(shí)施例，。下面描述的實(shí)施例是示例性的，僅用于解釋本發(fā)明，而不能理解為對(duì) 本發(fā)明的限制。實(shí)施例1發(fā)明人于2011年5月至2012年9月，在河北省唐山市遷西地區(qū)，于多種不同地形的板栗林下采集真菌子實(shí)體，其中，只采集板栗根系形成的菌根與其菌絲相連的子實(shí)體，并將采集到的子實(shí)體，于冰盒內(nèi)低溫保存，及時(shí)帶回實(shí)驗(yàn)室，經(jīng)過多次人工分離、純化后，得到一種新的板栗外生菌根真菌菌種。該菌種的子實(shí)體形態(tài)學(xué)初步鑒定結(jié)果為灰樹花，對(duì)分離后的菌絲進(jìn)行分子鑒定的結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)該與板栗具有良好共生關(guān)系的真菌為灰樹花。進(jìn)一步，發(fā)明人在研究確定現(xiàn)階段仍沒有利用灰樹花的菌絲制作菌劑并應(yīng)用于板栗菌根化的報(bào)道后，設(shè)計(jì)進(jìn)行了多次試驗(yàn)，以便對(duì)灰樹花人工大量培養(yǎng)的條件和利用灰樹花制作菌根菌劑的方法進(jìn)行探索，以期篩選獲得最佳培養(yǎng)條件和菌根菌劑制備方法。具體步驟如下:1、確定灰樹花菌液體培養(yǎng)的最適條件方法:發(fā)明人以生長(zhǎng)迅速期的灰樹花真菌平板為材料，采用滅菌的打孔器在母菌落上取長(zhǎng)勢(shì)一致直徑0.65cm的菌餅，放入裝有25ml不含瓊脂的MMN液體培養(yǎng)基的三角瓶中，在25°C，140R/min條件下培養(yǎng)進(jìn)行暗培養(yǎng)。設(shè)三角瓶的菌餅接種量分別為5個(gè)、10個(gè)、15個(gè)，每個(gè)處理15瓶，定期(3d、6d、9d、12d、15d)測(cè)定每個(gè)接種量3瓶液體培養(yǎng)的菌絲干重。其中，采用細(xì)胞干重法(可參見《現(xiàn)代植物生理學(xué)實(shí)驗(yàn)指南》，1999，通過參照將其全文并入本文)測(cè)定菌液的生物量，將所有菌液過濾，菌絲體用蒸餾水充分洗滌，在常壓下100°C干燥，然后用電子天平精確稱重，以便獲得各實(shí)驗(yàn)組獲得的菌絲干重。結(jié)果:發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，接種量為15個(gè)直徑0.65cm的菌餅時(shí)獲得的菌絲干重，培養(yǎng)12天時(shí)菌絲狀態(tài)最好。由此，發(fā)明人確定了灰樹花菌液體培養(yǎng)的最佳為接種量15個(gè)直徑為
0.65cm的菌餅，最佳培養(yǎng)時(shí)間為12天。具體地，本實(shí)施例確定的灰樹花菌液體培養(yǎng)的最適條件為:取直徑0.65cm圓形等質(zhì)的經(jīng)過活化的灰樹花菌菌片15個(gè)，加入裝有25ml MMN液體培養(yǎng)基的三角瓶中，之后放入搖床內(nèi)培養(yǎng)，設(shè)置溫度25°C，轉(zhuǎn)速140R/min，暗培養(yǎng)12d。2、確定菌根菌劑固體培養(yǎng)的最適條件方法:于超凈工作臺(tái)內(nèi)，按照表I中所示的9種處理方法，將前面獲得的長(zhǎng)勢(shì)均一，培養(yǎng)效果良好的灰樹花菌液，與滅過菌的不同配方的固體培養(yǎng)基(固體培養(yǎng)基配方及各處理的菌液接種量見表I)混合并置于培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，封口后，于25°C恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)，培養(yǎng)三周，然后測(cè)定各種配方的培養(yǎng)基質(zhì)所獲得的菌絲化率。表I
權(quán)利要求
1.一種制備菌根菌劑的方法，其特征在于，包括: 按照37.5 75ml =IOOg的比例，將灰樹花菌液接入特定固體培養(yǎng)基中，并于25攝氏度下培養(yǎng)3周，以便獲得菌根菌劑， 其中， 所述特定固體培養(yǎng)基由重量比為7.5 6.5:1.25 1.75:1.25 1.75的草炭、蛭石和珍珠巖均勻混合而成。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述灰樹花菌液與所述特定固體培養(yǎng)基的比例為50ml =IOOg0
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述草炭、蛭石和珍珠巖的重量比為7:1.5:1.5， 任選地，每IOOO g所述特定固體培養(yǎng)基中包含25g紅糖。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述灰樹花菌液是通過以下步驟獲得的: 將所述灰樹花菌進(jìn)行活化；以及 將經(jīng)過活化的灰樹花菌進(jìn)行液體培養(yǎng)，以便獲得所述灰樹花菌液。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，通過平板培養(yǎng)實(shí)現(xiàn)所述活化。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述將經(jīng)過活化的灰樹花菌進(jìn)行液體培養(yǎng)，進(jìn)一步包括: 取直徑0.65cm圓形等質(zhì)的經(jīng)過活化的灰樹花菌菌片15個(gè)，加入裝有25ml MMN液體培養(yǎng)基的三角瓶中，之后放入搖床內(nèi)培養(yǎng)，設(shè)置溫度25°C，轉(zhuǎn)速140R/min，暗培養(yǎng)12d。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，每克所述菌根菌劑中含有孢子IX 1011。
8.一種菌根菌劑，其是通過權(quán)利要求1-7任一項(xiàng)所述的方法制備獲得的。
9.權(quán)利要求8所述的菌根菌劑，在提高板栗植株抗干旱及抗病蟲害能力中的用途。
10.一種提高板栗植株抗干旱及抗病蟲害能力的方法，其特征在于，包括選自下列步驟的至少之一: 向所述板栗植株幼苗的培養(yǎng)基質(zhì)中添加權(quán)利要求8所述的菌根菌劑；以及 利用權(quán)利要求8所述的菌根菌劑接種所述板栗植株， 任選地，將所述菌根菌劑接種于所述板栗植株根部。
全文摘要
本發(fā)明公開了菌根菌劑及其制備方法和用途。其中，制備菌根菌劑的方法包括按照37.5～75ml100g的比例，將灰樹花菌液接入特定固體培養(yǎng)基中，并于25攝氏度下培養(yǎng)3周，以便獲得菌根菌劑，其中，該特定固體培養(yǎng)基由重量比為7.5～6.51.25～1.751.25～1.75的草炭、蛭石和珍珠巖均勻混合而成。本發(fā)明的方法成本低、效率高、簡(jiǎn)單易行，適于工廠化大批量生產(chǎn)，并且制備獲得的菌根菌劑，對(duì)板栗植株的侵染效果非常好，能夠有效用于提高板栗植株抗干旱及抗病蟲害能力。
文檔編號(hào)A01G31/00GK103229667SQ201310153800
公開日2013年8月7日 申請(qǐng)日期2013年4月27日 優(yōu)先權(quán)日2013年4月27日
發(fā)明者郭素娟, 柴迪迪, 李廣會(huì), 鄒峰, 謝鵬, 呂文君, 熊歡, 秦天天, 趙國(guó)強(qiáng), 付慶偉, 王鳳春 申請(qǐng)人:北京林業(yè)大學(xué)