一種微型月季花誘導(dǎo)方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于細(xì)胞工程【技術(shù)領(lǐng)域】，涉及一種微型月季花誘導(dǎo)方法，公開(kāi)了一種通過(guò)高效、快速誘導(dǎo)微型月季花芽的方法，包括：無(wú)菌苗的獲取，花芽誘導(dǎo)培養(yǎng)，成花培養(yǎng)等步驟。本發(fā)明首次以盆栽微型月季為植物材料，在其莖段離體再生體系中，最后確定微型月季開(kāi)花誘導(dǎo)的最適培養(yǎng)基為：MS+TDZ1.0mg/L+蔗糖40g/L+瓊脂7.2g/L，成功誘導(dǎo)試管苗開(kāi)花并將開(kāi)花率提高至87.1%，并成功培育出體態(tài)嬌小，色澤艷麗的超微月季試管苗，對(duì)月季無(wú)性育種具有重要的理論和實(shí)踐意義。
【專利說(shuō)明】一種微型月季花誘導(dǎo)方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于細(xì)胞工程【技術(shù)領(lǐng)域】，涉及一種微型月季花誘導(dǎo)方法，具體涉及一種誘 導(dǎo)微型月季試管苗開(kāi)花的方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 微型月季（Rosa chinesis Minima)屬薔薇科薔薇屬木本植物，為月季家族的新 品種，其株型矮小，開(kāi)花甚密，花色豐富，花略帶香味，花期長(zhǎng)，因其品性獨(dú)特又稱為"鉆石月 季"，是一種目前流行的微型花卉種質(zhì)資源，應(yīng)用市場(chǎng)前景廣闊、潛力巨大。目前，美國(guó)、丹 麥、加拿大等盆花產(chǎn)銷量大的國(guó)家，在對(duì)微型月季的生長(zhǎng)發(fā)育、盆花質(zhì)量控制、花期調(diào)控、產(chǎn) 品包裝及采后儲(chǔ)運(yùn)保鮮等方面都有較深入系統(tǒng)的研究。時(shí)至今日，美國(guó)和日本已進(jìn)入了微 型月季工廠化育苗階段，而中國(guó)則剛剛起步。
[0003] 花是高等植物個(gè)體發(fā)育的中心環(huán)節(jié)，也是影響花卉質(zhì)量的重要過(guò)程，花器官的分 化和發(fā)育是高等植物從營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)轉(zhuǎn)向生殖生長(zhǎng)，實(shí)現(xiàn)世代交替的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，它是植物發(fā)育 生物學(xué)的重要內(nèi)容，植物開(kāi)花過(guò)程是個(gè)復(fù)合的多步驟過(guò)程，涉及不同發(fā)育方式的轉(zhuǎn)換，人們 對(duì)植物成花機(jī)制的研究已開(kāi)展將近一個(gè)世紀(jì)，最初是以觀賞植物為主要材料進(jìn)行開(kāi)花調(diào)控 機(jī)制的研究。
[0004] 試管開(kāi)花是指用組織培養(yǎng)的方法，使植物的開(kāi)花過(guò)程在培養(yǎng)容器中完成，讓人們 在任何季節(jié)特別是非開(kāi)花季節(jié)觀賞到植物花的開(kāi)放，關(guān)于植物試管開(kāi)花國(guó)內(nèi)外都有報(bào)道， 研究試管開(kāi)花不僅可以為研究植物的花芽分化提供一個(gè)良好的試驗(yàn)系統(tǒng)，還因其新型、微 小，不僅具有較高的觀賞價(jià)值，而且在試管內(nèi)研究植物的開(kāi)花，有利于研究植物開(kāi)花機(jī)理， 調(diào)控花期，還可以開(kāi)展試管雜交育種，從而克服自然條件下對(duì)雜交的限制，培育新品種。
[0005] 植物成花是一個(gè)非常復(fù)雜的過(guò)程，環(huán)境條件和遺傳因子都可通過(guò)自身的分子機(jī)制 來(lái)調(diào)節(jié)植物的成花，但各因子之間卻并不是獨(dú)立存在的，而是相互作用，相互影響，形成一 個(gè)復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)調(diào)控，在植物成花過(guò)程中，環(huán)境與遺傳因子之間、基因與基因之間通常都 發(fā)生互作用，植物生長(zhǎng)的轉(zhuǎn)變主要是通過(guò)基因間抑制和解抑制相互作用及環(huán)境的相互協(xié)調(diào) 來(lái)完成的。
[0006] 成花過(guò)程中的基因可分為分生組織特性基因、花器官特性基因、成花計(jì)時(shí)基因和 定域基因。這些基因相互作用于成花過(guò)程，并不相互獨(dú)立，控制花分生組織特性基因 LFY、 API、AP2、CAL，花序分生組織特性的抑制基因 TFL1，TFL2 ;花分生組織形成后，花器官基因 被活化，控制花結(jié)構(gòu)的基因按功能可劃分為ABC三類，金魚草中的A功能基因是SQUA，B功 能的基因是天EF和GLO, C功能的基因是PLE ;成花計(jì)時(shí)基因不受日照長(zhǎng)度的影響，它們的 表達(dá)足夠觸發(fā)開(kāi)花，決定成花時(shí)間的早晚，成花計(jì)時(shí)基因主要有CO、EMF、GI、SUP、LUG、AP2、 AG、CLF起定域基因的作用，即限定有關(guān)基因在特定的花器官中表達(dá)的作用。
[0007] 成花過(guò)程中的環(huán)境因素主要包括光照、溫度、脅迫、外源激素等，植物接受以上因 素刺激，經(jīng)過(guò)一系列信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程，啟動(dòng)成花決定過(guò)程中的控制基因，并在諸多關(guān)鍵基因的 相互作用以及諸多代謝途徑的相互制約下，引起花芽分化，進(jìn)而導(dǎo)致花器官發(fā)生。
[0008] 光照的作用主要是在形態(tài)建成的誘導(dǎo)方面，它涉及到植物細(xì)胞分化的一些重要過(guò) 程，植物生長(zhǎng)的狀況與其所處的光環(huán)境密切相關(guān)，花的形態(tài)和花色是決定觀花植物觀賞品 質(zhì)的重要因素，強(qiáng)光有利于花色素苷的合成。大量試驗(yàn)結(jié)果表明，對(duì)于陰性植物來(lái)說(shuō)，遮蔭 能加快其生長(zhǎng)，提高觀賞品質(zhì)；而陽(yáng)性植物則需要充足的光照進(jìn)行有效的光合作用，使植株 花量多，花質(zhì)量好，對(duì)于牡丹等花卉來(lái)說(shuō)，遮蔭不利于花色素苷的形成，使花色素苷含量顯 著減少，從而導(dǎo)致花色變淺，觀賞品質(zhì)降低，光周期類型影響許多種植物的試管開(kāi)花。有些 植物在短日照和長(zhǎng)日照條件處理下，其試管開(kāi)花率有很大的差異。
[0009] 植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑與植物開(kāi)花具有密切的關(guān)系，不同的激素配比對(duì)試管中花芽形成 的誘導(dǎo)效果有著很大的差別，有研究結(jié)果表明，外源細(xì)胞分裂素對(duì)于試管花的誘導(dǎo)是必需 的因子。在多數(shù)情況下，只有當(dāng)細(xì)胞分裂素和生長(zhǎng)激素達(dá)到最適濃度比時(shí)，才能誘導(dǎo)植物開(kāi) 花，且開(kāi)花率達(dá)到最商。
[0010] 有關(guān)外源激素對(duì)植物成花的影響，多集中于ga3促進(jìn)花芽分化、提早開(kāi)花等方面。 GA3對(duì)不同植物的成花影響也不相同。對(duì)某些植物來(lái)說(shuō)，GA3可加快其花的發(fā)育進(jìn)程，促進(jìn)株 高和花徑生長(zhǎng)，促進(jìn)提前開(kāi)花，并影響其外觀品質(zhì)；而對(duì)另外一些植物來(lái)說(shuō)，ga 3可推遲其花 期，抑制花的形成，且抑制效果隨ga3濃度的提高而增強(qiáng)，多效唑和矮壯素均是植物生長(zhǎng)延 緩劑，能夠抑制赤霉素的生物合成，加速體內(nèi)生長(zhǎng)素的分解，從而促進(jìn)開(kāi)花，花期明顯延長(zhǎng)， 并使花數(shù)量增多，對(duì)提高花卉觀賞價(jià)值具有明顯的促進(jìn)作用。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0011] 本發(fā)明的目的在于解決【背景技術(shù)】中的微型月季開(kāi)花周期長(zhǎng)，受到基因和激素調(diào) 控、環(huán)境因子等多方面因素限制。本發(fā)明提供了一種微型月季開(kāi)花誘導(dǎo)的新方法，以提高微 型月季開(kāi)花率、增加其觀賞價(jià)值。
[0012] 本發(fā)明的目的是這樣實(shí)現(xiàn)的：
[0013] 一種微型月季開(kāi)花誘導(dǎo)的新方法，該方法包括如下步驟：
[0014] (1)無(wú)菌苗的獲取：
[0015] ①取在溫室或苗圃培育的月季盆栽苗的當(dāng)年生枝條，以軟毛刷去除表面灰塵后， 置于盛有清水的器皿中；
[0016] ②加入1滴中性強(qiáng)度洗潔精浸泡枝條30min，并不斷搖動(dòng)燒杯，流水沖洗lh，用濾 紙吸干紙條表面水分，備用；
[0017] ③將步驟②清洗后的月季枝條剪取長(zhǎng)度為3cm左右的微型月季莖段，用Cl2滅菌 30min，在超凈工作臺(tái)中，無(wú)菌蒸餾水浸泡清洗3次，再無(wú)菌濾紙吸干，備用；
[0018] ④配制芽誘導(dǎo)及增殖培養(yǎng)基：MS+TDZ1. 0mg/L+NAA0· lmg/L+蔗糖30g/L+瓊脂7g/ L+ 活性炭 〇· 6g/L，pH 為 5· 83-5. 85,經(jīng) 121°C 高壓滅菌 20min ;
[0019] ⑤將滅菌后的1L培養(yǎng)基平均盛放在20個(gè)植物組織培養(yǎng)瓶中，待培養(yǎng)基冷凝至室 溫；
[0020] ⑥將步驟③備用的滅菌后的莖段剪取為1. 5cm左右，形態(tài)學(xué)下端接種于步驟⑤分 裝好的芽誘導(dǎo)及增殖培養(yǎng)基中，每1個(gè)植物組織培養(yǎng)瓶中接種4個(gè)莖段，接種后標(biāo)注日期， 置于智能人工氣候箱中培養(yǎng)30天；
[0021] ⑦智能人工氣候箱的培養(yǎng)條件為：25°C，光強(qiáng)20001UX，光周期為16小時(shí)光照，8小 時(shí)黑暗，從而獲得無(wú)菌苗；
[0022] (2)花芽誘導(dǎo)培養(yǎng)：
[0023] ①在超凈工作臺(tái)中，切取生長(zhǎng)健壯的微型月季組培苗單芽莖段，形態(tài)學(xué)下端接種 于6種蔗糖濃度的花芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中；
[0024] ②此6種花芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基分別為：
[0025] YJ1 :MS+TDZ1. 0mg/L+ 瓊脂 7. 2g/L+ 蔗糖 70g/L ;
[0026] YJ2:MS+TDZ1. 0mg/L+ 瓊脂 7. 2g/L+ 蔗糖 65g/L ;
[0027] YJ3:MS+TDZ1. 0mg/L+ 瓊脂 7. 2g/L+ 蔗糖 55g/L ;
[0028] YJ4:MS+TDZ1. 0mg/L+ 瓊脂 7. 2g/L+ 蔗糖 40g/L ;
[0029] YJ5:MS+TDZ1. 0mg/L+ 瓊脂 7. 2g/L+ 蔗糖 30g/L ;
[0030] YJ6:MS+TDZ1. 0mg/L+ 瓊脂 7. 2g/L+ 蔗糖 15g/L ;
[0031] ③上述花芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基PH均為5. 83?5. 85,經(jīng)121°C高壓滅菌20min后，每1L 培養(yǎng)基倒20個(gè)植物組織培養(yǎng)瓶，待培養(yǎng)基冷凝至室溫；
[0032] ④接種步驟①中切取的微型月季組培苗單芽莖段分別接種到6種培養(yǎng)基中，每1 個(gè)植物組織培養(yǎng)瓶中接種5個(gè)莖段，每種培養(yǎng)基接種10瓶，接種后標(biāo)注日期，置于智能人工 氣候箱中培養(yǎng)40天；
[0033] ⑤培養(yǎng)條件為：25°C，光強(qiáng)20001ux，光周期為16小時(shí)光照，8小時(shí)黑暗，獲得微型 月季的叢生芽；
[0034] (3)成花培養(yǎng)：
[0035] ①將在6種花芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)40天的微型月季叢生芽切取為單叢，接種 于芽增殖培養(yǎng)基：MS+TDZ1. 0mg/L+NAA0· lmg/L+ 活性炭 0· 6g/L+ 蔗糖 30g/L+ 瓊脂 7g/L (ρΗ5· 83 ?5· 85)中；
[0036] ②在芽增殖培養(yǎng)基的植物組織培養(yǎng)瓶上，對(duì)來(lái)自6種花芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中微型月季 叢生芽做好標(biāo)記，置于人工氣候箱中培養(yǎng)10天，誘導(dǎo)微型月季開(kāi)花；
[0037] ③培養(yǎng)條件為：25°C，光強(qiáng)20001ux，光周期為16小時(shí)光照，8小時(shí)黑暗；10天后統(tǒng) 計(jì)結(jié)果。
[0038] 所述的Cl2制備過(guò)程是：取帶瓶塞的容器，在其中放入一個(gè)泡沫板，向其中加入 25mlNaC10,然后將需要滅菌的材料用鑷子輕輕的放在泡沫板上，向其中加入lml濃HC1，迅 速蓋緊瓶塞，使瓶?jī)?nèi)的NaCIO和濃HC1反應(yīng)30min，制得氯氣對(duì)材料進(jìn)行滅菌。
[0039] 本發(fā)明具有以下積極的效果：
[0040] 1、本發(fā)明采用具有強(qiáng)細(xì)胞分裂活性的新型植物激素 TDZ，巧妙運(yùn)用激素配比，調(diào)控 微型月季組培苗生長(zhǎng)發(fā)育。
[0041] 2、本發(fā)明經(jīng)高蔗糖誘導(dǎo)的組培苗開(kāi)花率為87. 1%，與未經(jīng)誘導(dǎo)相比得到極大提高。
[0042] 3、利用本發(fā)明方法，將高度約30cm的微型月季盆栽成功培育為高約3cm"迷你"微 型月季，其色澤艷麗，證明本方法對(duì)花卉觀賞工藝進(jìn)行創(chuàng)新取得成功。
[0043] 4、利用本發(fā)明方法培育出的微型月季試管苗體態(tài)嬌小、色澤艷麗、花期長(zhǎng)，觀賞價(jià) 值增加。

【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0044] 圖1是本發(fā)明獲得的無(wú)菌苗。
[0045] 圖2是本發(fā)明花芽誘導(dǎo)40天后的叢芽。
[0046] 圖3是本發(fā)明成花培養(yǎng)10天后的微型月季試管苗。
[0047] 圖4是本發(fā)明大規(guī)模培養(yǎng)的開(kāi)花試管苗。
[0048] 圖5是本發(fā)明在6種花芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)40天后的對(duì)比示意圖。
[0049] 圖6是本發(fā)明在6種芽誘導(dǎo)及增殖培養(yǎng)基中培養(yǎng)10天后的對(duì)比示意圖。

【具體實(shí)施方式】
[0050] 實(shí)施例1
[0051] 下面結(jié)合實(shí)施案例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明：
[0052] 以上所述的一種微型月季莖段離體快繁方法中，各步驟中采用的培養(yǎng)基均用蒸餾 水按常規(guī)方法配制。其中：
[0053] 芽誘導(dǎo)及增殖培養(yǎng)基：
[0054] YJ1 :MS+TDZ1. 0mg/L+ 瓊脂 7. 2g/L+ 蔗糖 70g/L ;
[0055] YJ2:MS+TDZ1. 0mg/L+ 瓊脂 7. 2g/L+ 蔗糖 65g/L ;
[0056] YJ3:MS+TDZ1. 0mg/L+ 瓊脂 7. 2g/L+ 蔗糖 55g/L ;
[0057] YJ4:MS+TDZ1. 0mg/L+ 瓊脂 7. 2g/L+ 蔗糖 40g/L ;
[0058] YJ5:MS+TDZ1. 0mg/L+ 瓊脂 7. 2g/L+ 蔗糖 30g/L ;
[0059] YJ6:MS+TDZ1. 0mg/L+ 瓊脂 7. 2g/L+ 蔗糖 15g/L。
[0060] 花芽誘導(dǎo)培培養(yǎng)基：
[0061] MS+TDZ1. 0mg/L+NAA0· lmg/L+ 活性炭 0· 6g/L+ 蔗糖 30g/L+ 瓊脂 7g/L。
[0062] 一、培養(yǎng)基的組成成分
[0063] (1)MS 培養(yǎng)基組成為：KN031900mg ?L'M^NOjeSOmg .L'CaCh ·2Η20440π^ .Γ1， MgS04 · 7H20370mg · I/1，KH2P04170mg · I/1，Η3Β036· 2mg · I/1，MnS04 · Η2016· 9mg · I/1， ZnS04 · 7H208. 6mg · L-1，KC10. 83mg · L-1，Na2Mo04 · 2H200. 25mg · L-1，CuS04 · 5H200. 025mg · L-1， CoCl2 · 6H200. 025mg · Γ1，Na2EDTA37. 3mg · Γ1，F(xiàn)eS04 · 7H2027. 8mg · Γ1，肌醇 20g · Γ1，煙 酸lOOmg · I71，鹽酸批卩多醇lOOmg · I71，鹽酸硫胺素 lOOmg · I71，甘氨酸400mg · I71，pH值 5. 80~5. 83〇
[0064] (2) 1/2MS 培養(yǎng)基組成為：KN03950mg ?L'M^NOsSSSmg ?L'CaCh ·2Η20220π^ .Γ1， MgS04 · 7H20185mg · I/1, KH2P0485mg · I/1, Η3Β033· lmg · I/1, MnS04 · Η208· 45mg · I/1, ZnS04 · 7H204. 3mg · L' KC10. 415mg · L' Na2Mo04 · 2H200. 1 25mg · L-1， CuS04 · 5H200. 0125mg · I/1, CoCl2 · 6H200. 0125mg · I/1, Na2EDTA18. 65mg · I/1, FeS04 · 7H2013. 9mg · I71，肌醇 lOg · I71，煙酸 50mg · I71，鹽酸批卩多醇 50mg · I71，鹽酸硫胺素 50mg · L \ 甘氛酸 200mg · L \ pH 值 5· 80_5· 83。
[0065] 二、培養(yǎng)基的配制和滅菌
[0066] 1. MS培養(yǎng)基的配制：
[0067] (1) MS培養(yǎng)基母液的配制
[0068] 1)大量元素母液的配制：
[0069] ① ΚΝ03母液的配制：稱取190g ΚΝ03放入到1000ml的燒杯中，用800ml蒸餾水使 之完全溶解，加蒸餾水定容到1000ml，轉(zhuǎn)移至廣口瓶中，室溫保存；較使用濃度該母液濃縮 倍數(shù)為100倍。
[0070] ②ΝΗ4Ν03母液的配制：稱取330g ΝΗ4Ν03放入到1000ml的燒杯中，用800ml蒸餾 水使之完全溶解，加蒸餾水定容到l〇〇〇ml，轉(zhuǎn)移至廣口瓶中，室溫保存；較使用濃度該母液 濃縮倍數(shù)為200倍。
[0071] ③MgS04 · 7H20母液的配制：稱取74g MgS04 · 7H20放入到1000ml的燒杯中，用 800ml蒸餾水使之完全溶解，加蒸餾水定容到1000ml，轉(zhuǎn)移至廣口瓶中，室溫保存；較使用 濃度該母液濃縮倍數(shù)為200倍。
[0072] ④ΚΗ2Ρ04母液的配制：稱取34g ΚΗ2Ρ04放入到1000ml的燒杯中，用800ml蒸餾水 使之完全溶解，加蒸餾水定容到l〇〇〇ml，轉(zhuǎn)移至廣口瓶中，室溫保存；較使用濃度該母液濃 縮倍數(shù)為200倍。
[0073] ⑤CaCl2 · 2H20母液的配制：稱取88g CaCl2 · 2H20放入到1000ml的燒杯中，用 800ml蒸餾水使之完全溶解，加蒸餾水定容到1000ml，轉(zhuǎn)移至廣口瓶中，室溫保存；較使用 濃度該母液濃縮倍數(shù)為200倍。
[0074] 2)微量元素母液的配制：分別稱取6. 2g H3B03,16. 9g MnS04 · H20,8. 6g ZnS04 · 7H20,0. 83g KC1，0. 25g Na2Mo04 · 2H20,0. 025g CuS04 · 5H20,0. 025g CoCl2 · 6H20 放 入到1000ml的燒杯中，用800ml蒸餾水使之完全溶解，加蒸餾水定容到1000ml，轉(zhuǎn)移至廣口 瓶中，室溫保存；較使用濃度該母液濃縮倍數(shù)為1000倍。
[0075] 3)鐵鹽母液的配制：分別稱取18. 65g Na2-EDTA和13. 9g FeS04 · 7H20,分別放入 2個(gè)500ml燒杯中，分別加入200ml蒸餾水，加熱并不斷攪拌，使之完全溶解；冷卻，將2種 溶液混合，調(diào)pH至5. 5,加蒸餾水定容到500ml，轉(zhuǎn)移至棕色瓶中，在4°C冰箱中保存；較使 用濃度該母液濃度濃縮倍數(shù)為500倍。
[0076] 4) B5有機(jī)母液的配制：分別稱取10g肌醇，0. 05g煙酸，0. 05g鹽酸批咳醇、0. 05g 鹽酸硫胺素和〇. 2g甘氨酸，放入到500ml的燒杯中，用300mL蒸餾水使之完全溶解，加蒸餾 水定容到500ml，高壓滅菌，轉(zhuǎn)移至無(wú)菌棕色瓶中，在4°C冰箱中保存；較使用濃度該母液濃 度濃縮倍數(shù)為200倍。
[0077] (2) MS培養(yǎng)基的配制：分別吸取上述MS培養(yǎng)基母液：10ml KN03、5ml NH4N03、5ml MgS04 · 7H20、5ml KH2P04、5ml CaCl2 · 2H20、lml 微量元素、2ml 鐵鹽、5ml B5 有機(jī)，加入到盛 有800ml蒸餾水的1000ml三角瓶中，加入30g蔗糖，加入蒸餾水定容到1L，充分溶解，調(diào)pH 值到5. 80-5. 83,用封口膜封口，然后采用121°C高壓濕熱滅菌20分鐘。
[0078] 三、氯氣（Cl2)滅菌具體方法
[0079] 取帶瓶塞的容器，在其中放入一個(gè)泡沫板，向其中加入25mlNaC10,然后將需要滅 菌的材料用鑷子輕輕的放在泡沫板上，向其中加入lml濃HC1，迅速蓋緊瓶塞，使瓶?jī)?nèi)的 NaCIO和濃HC1反應(yīng)30min，制得氯氣對(duì)材料達(dá)到滅菌的效果。
[0080] 四、微型月季無(wú)菌苗開(kāi)花誘導(dǎo)
[0081] (1)無(wú)菌苗的獲?。?br> [0082] ①取在溫室或苗圃培育的月季盆栽苗的當(dāng)年生枝條，以軟毛刷去除表面灰塵后， 置于盛有清水的器皿中；
[0083] ②加入1滴藍(lán)月亮牌洗潔精浸泡枝條30min，并不斷搖動(dòng)燒杯，流水沖洗lh，用濾 紙吸干紙條表面水分，備用；
[0084] ③將步驟②清洗后的月季枝條剪取長(zhǎng)度為3cm左右的微型月季莖段，用Cl2滅菌 30min，在超凈工作臺(tái)中，無(wú)菌蒸餾水浸泡清洗3次，再無(wú)菌濾紙吸干，備用；
[0085] (注：所述的Cl2制備過(guò)程是：取帶瓶塞的容器，在其中放入一個(gè)泡沫板，向其中加 入25mlNaC10,然后將需要滅菌的材料用鑷子輕輕的放在泡沫板上，向其中加入lml濃HC1， 迅速蓋緊瓶塞，使瓶?jī)?nèi)的NaCIO和濃HC1反應(yīng)30min，制得氯氣對(duì)材料進(jìn)行滅菌。）
[0086] ④配制芽誘導(dǎo)及增殖培養(yǎng)基：MS+TDZ1. 0mg/L+NAA0· lmg/L+蔗糖30g/L+瓊脂7g/ !^+活性炭〇.68/1，？!1為 5.83-5.85，經(jīng)1211：高壓滅菌2〇1^11。
[0087] ⑤將滅菌后的1L培養(yǎng)基平均盛放在20個(gè)植物組織培養(yǎng)瓶中，待培養(yǎng)基冷凝至室 溫；
[0088] ⑥將步驟③備用的滅菌后的莖段剪取為1. 5cm左右，形態(tài)學(xué)下端接種于步驟⑤分 裝好的芽誘導(dǎo)及增殖培養(yǎng)基中，每1個(gè)植物組織培養(yǎng)瓶中接種4個(gè)莖段，接種后標(biāo)注日期， 置于智能人工氣候箱中培養(yǎng)30天；
[0089] ⑦智能人工氣候箱的培養(yǎng)條件為：25°C，光強(qiáng)20001UX，光周期為16小時(shí)光照，8小 時(shí)黑暗，從而獲得無(wú)菌苗。
[0090] (2)花芽誘導(dǎo)培養(yǎng)：
[0091] ①在超凈工作臺(tái)中，切取生長(zhǎng)健壯的微型月季組培苗單芽莖段，形態(tài)學(xué)下端接種 于6種蔗糖濃度的花芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中；
[0092] ②此6種花芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基分別為：
[0093] YJ1 :MS+TDZ1. 0mg/L+ 瓊脂 7. 2g/L+ 蔗糖 70g/L ;
[0094] YJ2:MS+TDZ1. 0mg/L+ 瓊脂 7. 2g/L+ 蔗糖 65g/L ;
[0095] YJ3:MS+TDZ1. 0mg/L+ 瓊脂 7. 2g/L+ 蔗糖 55g/L ;
[0096] YJ4:MS+TDZ1. 0mg/L+ 瓊脂 7. 2g/L+ 蔗糖 40g/L ;
[0097] YJ5:MS+TDZ1. 0mg/L+ 瓊脂 7. 2g/L+ 蔗糖 30g/L ;
[0098] YJ6:MS+TDZ1. 0mg/L+ 瓊脂 7. 2g/L+ 蔗糖 15g/L ;
[0099] ③上述花芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基pH均為5. 83-5. 85,經(jīng)121°C高壓滅菌20min后，每1L培 養(yǎng)基倒20個(gè)植物組織培養(yǎng)瓶，待培養(yǎng)基冷凝至室溫；
[0100] ④接種步驟①中切取的微型月季組培苗單芽莖段分別接種到6種培養(yǎng)基中，每1 個(gè)植物組織培養(yǎng)瓶中接種5個(gè)莖段，每種培養(yǎng)基接種10瓶，接種后標(biāo)注日期，置于智能人工 氣候箱中培養(yǎng)40天；
[0101] ⑤培養(yǎng)條件為：25°c，光強(qiáng)20001UX，光周期為16小時(shí)光照，8小時(shí)黑暗，獲得微型 月季的叢生芽。
[0102] (3)成花培養(yǎng)：
[0103] ①將在6種花芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)40天的微型月季叢生芽切取為單叢，接種 于芽增殖培養(yǎng)基：MS+TDZ1. 0mg/L+NAA0· lmg/L+ 活性炭 0· 6g/L+ 蔗糖 30g/L+ 瓊脂 7g/L (ρΗ5· 83-5. 85)中；
[0104] ②在芽增殖培養(yǎng)基的植物組織培養(yǎng)瓶上，對(duì)來(lái)自6種花芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中微型月季 叢生芽做好標(biāo)記，置于人工氣候箱中培養(yǎng)10天，誘導(dǎo)微型月季開(kāi)花。
[0105] ③培養(yǎng)條件為：25°C，光強(qiáng)20001UX，光周期為16小時(shí)光照，8小時(shí)黑暗；10天后統(tǒng) 計(jì)結(jié)果。
[0106] (4)結(jié)果統(tǒng)計(jì)：
[0107] 記錄開(kāi)花率最高的花芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基為：MS+TDZ1. 0mg/L+蔗糖40g/L+瓊脂7. 2g/L， 經(jīng)其誘導(dǎo)之后，組培苗開(kāi)花率為87. 1% (如表1)。
[0108] 表1蔗糖濃度對(duì)微型月季試管苗開(kāi)花的影響
[0109]

【權(quán)利要求】
1. 一種微型月季花誘導(dǎo)方法，其特征在于：包括如下步驟： (1) 無(wú)菌苗的獲取： ① 取在溫室或苗圃培育的月季盆栽苗的當(dāng)年生枝條，以軟毛刷去除表面灰塵后，置于 盛有清水的器皿中； ② 加入1滴藍(lán)月亮牌洗潔精浸泡枝條30min，并不斷搖動(dòng)燒杯，流水沖洗lh，用濾紙吸 干紙條表面水分，備用； ③ 將步驟②清洗后的月季枝條剪取長(zhǎng)度為3cm左右的微型月季莖段，用Cl2滅菌 30min，在超凈工作臺(tái)中，無(wú)菌蒸餾水浸泡清洗3次，再無(wú)菌濾紙吸干，備用； ④ 配制芽誘導(dǎo)及增殖培養(yǎng)基：MS+TDZ1. Omg/L+NAAO. lmg/L+蔗糖30g/L+瓊脂7g/L+活 性炭 0· 6g/L，pH 為 5· 83-5. 85,經(jīng) 121°C 高壓滅菌 20min ; ⑤ 將滅菌后的1L培養(yǎng)基平均盛放在20個(gè)植物組織培養(yǎng)瓶中，待培養(yǎng)基冷凝至室溫； ⑥ 將步驟③備用的滅菌后的莖段剪取為1. 5cm左右，形態(tài)學(xué)下端接種于步驟⑤分裝好 的芽誘導(dǎo)及增殖培養(yǎng)基中，每1個(gè)植物組織培養(yǎng)瓶中接種4個(gè)莖段，接種后標(biāo)注日期，置于 智能人工氣候箱中培養(yǎng)30天； ⑦ 智能人工氣候箱的培養(yǎng)條件為：25°C，光強(qiáng)20001uX，光周期為16小時(shí)光照，8小時(shí)黑 暗，從而獲得無(wú)菌苗； (2) 花芽誘導(dǎo)培養(yǎng)： ① 在超凈工作臺(tái)中，切取生長(zhǎng)健壯的微型月季組培苗單芽莖段，形態(tài)學(xué)下端接種于6 種蔗糖濃度的花芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中； ② 此6種花芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基分別為： YJ1 :MS+TDZ1. 0mg/L+ 瓊脂 7. 2g/L+ 蔗糖 70g/L ; YJ2:MS+TDZ1. 0mg/L+ 瓊脂 7. 2g/L+ 蔗糖 65g/L ; YJ3:MS+TDZ1. 0mg/L+ 瓊脂 7. 2g/L+ 蔗糖 55g/L ; YJ4:MS+TDZ1. 0mg/L+ 瓊脂 7. 2g/L+ 蔗糖 40g/L ; YJ5:MS+TDZ1. 0mg/L+ 瓊脂 7. 2g/L+ 蔗糖 30g/L ; YJ6:MS+TDZ1. 0mg/L+ 瓊脂 7. 2g/L+ 蔗糖 15g/L ; ③ 上述花芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基pH均為5. 83-5. 85,經(jīng)121°C高壓滅菌20min后，每1L培養(yǎng)基 倒20個(gè)植物組織培養(yǎng)瓶，待培養(yǎng)基冷凝至室溫； ④ 接種步驟①中切取的微型月季組培苗單芽莖段分別接種到6種培養(yǎng)基中，每1個(gè)植 物組織培養(yǎng)瓶中接種5個(gè)莖段，每種培養(yǎng)基接種10瓶，接種后標(biāo)注日期，置于智能人工氣候 箱中培養(yǎng)40天； ⑤ 培養(yǎng)條件為：25°C，光強(qiáng)20001uX，光周期為16小時(shí)光照，8小時(shí)黑暗，獲得微型月季 的叢生芽； (3) 成花培養(yǎng)： ① 將在6種花芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)40天的微型月季叢生芽切取為單叢，接種于芽增 殖培養(yǎng)基：MS+TDZ1. 0mg/L+NAA0· lmg/L+ 活性炭 0· 6g/L+ 蔗糖 30g/L+ 瓊脂 7g/L (pH 為 5· 83-5. 85)中； ② 在芽增殖培養(yǎng)基的植物組織培養(yǎng)瓶上，對(duì)來(lái)自6種花芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中微型月季叢生 芽做好標(biāo)記，置于人工氣候箱中培養(yǎng)10天，誘導(dǎo)微型月季開(kāi)花； ③培養(yǎng)條件為：25°C，光強(qiáng)20001ux，光周期為16小時(shí)光照，8小時(shí)黑暗；10天后統(tǒng)計(jì)結(jié) 果。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種微型月季花誘導(dǎo)方法，其特征在于：所述的Cl2制備過(guò)程 是：取帶瓶塞的容器，在其中放入一個(gè)泡沫板，向其中加入25mlNaC10,然后將需要滅菌的 材料用鑷子輕輕的放在泡沫板上，向其中加入lml濃HC1，迅速蓋緊瓶塞，使瓶?jī)?nèi)的NaCIO和 濃HC1反應(yīng)30min，制得氯氣對(duì)材料進(jìn)行滅菌。
【文檔編號(hào)】A01H4/00GK104115743SQ201310150576
【公開(kāi)日】2014年10月29日 申請(qǐng)日期:2013年4月27日 優(yōu)先權(quán)日:2013年4月27日
【發(fā)明者】周曉馥, 徐洪偉, 武慧 申請(qǐng)人:吉林師范大學(xué)