專利名稱：一株能促進木麻黃生物量增長的內(nèi)生真菌的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一株能促進木麻黃生物量增長的內(nèi)生真菌。
背景技術(shù)：
植物內(nèi)生菌的研究始于19世紀末,Vogl從黑麥草Lolium temulentum L.種子中分離出第一株內(nèi)生菌[1]。但真正開始大量研究植株中的內(nèi)生菌起始于上世紀八十年代，主要是在溫帶地區(qū)、亞熱帶地區(qū)和熱帶地區(qū)的植被中開展研究。前人從大部分植物中都能分離出內(nèi)生菌，因此可以推測內(nèi)生菌在植株中是普遍存在的。在全世界范圍內(nèi)至少在80多個屬290多種的禾本科農(nóng)作物中發(fā)現(xiàn)了內(nèi)生菌[2]。目前從植物中分離的內(nèi)生菌根據(jù)其具有的獨特功能可以分為:固氮菌、固鉀菌、固磷菌等植物促生菌[3~4]、具有抗病蟲害的生防菌[5~7]和具有促進植物對不良環(huán)境的修復能力的抗性菌。在促進光合作用方面的內(nèi)生菌報道極少，僅有在水稻上發(fā)現(xiàn)一種具有光合作用能力的內(nèi)生菌，它也被證明是豆莢Aeschynomenew莖瘤中固氮菌Bredyrhizobium的一個株系。木麻黃科植物是兼有Frankia菌、內(nèi)生菌根菌和外生菌根菌的共生營養(yǎng)型植物，因此，關(guān)于木麻黃真菌學方面的研究方向目前較多涉及弗蘭克氏菌、叢枝狀菌根(簡稱AM菌根)、青枯菌、青枯假單胞桿菌等，雖然木麻黃人工接種菌根菌后的促生效果已毋庸置疑，但是僅停滯于根瘤菌根菌的研究，木麻黃內(nèi)生真菌方面的研究尚未見報道前人的研究中應(yīng)用菌株，多為外生真菌，同時也沒有從促進生物量增加作用的根本因素去尋找內(nèi)生真菌，提高其科學性和可靠性[11]。證實能促進生物量增加作用的內(nèi)生菌方面尚未見報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一株能促進木麻黃生物量增長的內(nèi)生真菌。本發(fā)明提供的一株能促進木麻黃生物量增長的內(nèi)生真菌，所述功能內(nèi)生真菌為曲霉(AspergiIIus sp.)木麻黃根際真菌17,已于2012年6月28日在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心登記保藏，保藏編號為CGMCC N0.6309。
該菌的分離、純化包括:
A、材料:將采集得到不同年份的根、枝條、鱗狀葉小枝分成三個部分，用自來水清洗干凈，分裝到自封袋內(nèi)，于4°C冰箱保存；
B、消毒:70%酒精浸泡30s——無菌水浸洗一次——10%次氯酸鈉浸泡7min——無菌水浸洗一次。當樣品最后一次浸洗后的水盛于滅菌的小燒杯中，在平板上劃線作為對照，以檢驗樣品的消毒是否徹底，若干天后如有菌落生成，則表明樣品表面消毒不徹底，需繼續(xù)調(diào)整消毒方法[12,]；
C、接種部位的選擇:鱗狀葉小枝:分取植株的上、中、下三個部分的鱗狀葉小枝，每個鱗狀葉小枝又分為枝尖部、枝中部和枝基部3個處理；枝條:上中下分為3部位，其中第3部位為枝莖交接處；根部:分為根尖和根基2個部分；
D、接種:將消毒后的外植體用接種刀切開，鋪放在培養(yǎng)基表面，于28°C恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)5— 7天后觀察菌落生長狀況。有的菌株繁殖迅速，可先將其產(chǎn)生的菌株進行分離純化；生長緩慢且數(shù)量較少的菌株可延長觀察時間，直到其生長穩(wěn)定后純化。固體培養(yǎng):使用改良馬丁固體培養(yǎng)基，配方為蛋白胨5.0g/L、酵母浸出粉2.0g/L、葡萄糖20.0g/L、磷酸氫二鉀1.0g/L、硫酸鎂0.5g/L、瓊脂14.0g/L、其它為無菌水，pH值
6.4±0.2，培養(yǎng)溫度為28°C，培養(yǎng)方式為平板培養(yǎng)，培養(yǎng)時間為48h ；
E、將分離繁殖出的不同種類的內(nèi)生真菌接入平板培養(yǎng)基進行純化，經(jīng)過2-3次點接純化、轉(zhuǎn)接后得到單一菌種的上述的Aspergillus sp.功能菌株；
其在平面培養(yǎng)基上，菌落為同心圓狀菌落，菌絲些許褐色；背部黃褐色，基質(zhì)顏色變黃。分生孢子梗直立，簡單，頂端球形，頂部著生小梗；分生孢子(梗孢子)單孢，球形；參照真菌鑒定手冊將其鑒定為曲霉屬(Aspergillus sp.)，保存在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏 號為CGMCC N0.6309。上述的一種能促進木麻黃生物量增長的內(nèi)生真菌應(yīng)用菌液的制備方法，是將上述的菌株接入液體培養(yǎng)基，搖床振蕩培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為28°C，培養(yǎng)時間48 72h，利用血球計數(shù)板計算菌液濃度，將菌液用超純水稀釋成1.0-9.0X106cfu/ml即為成品備用；液體培養(yǎng)基:為改良馬丁培養(yǎng)基，其中蛋白胨5.0g/L、酵母浸出粉2.0g/L、葡萄糖20.0g/L、磷酸氫二鉀1.0g/L、硫酸鎂0.5g/L、其它為無菌水、pH值6.4±0.2。上述的一種能促進木麻黃生物量增長的內(nèi)生真菌應(yīng)用菌液的應(yīng)用方法，是應(yīng)用該菌株的菌液，苗木栽植前期蘸根和用于林地澆根。上述的一種能促進木麻黃生物量增長的內(nèi)生真菌應(yīng)用菌液的應(yīng)用方法，是用9.0X105cfu/ml菌液，按每株IOOml在林地澆于每株木麻黃的根際。上述的一種能促進木麻黃生物量增長的內(nèi)生真菌應(yīng)用菌液的應(yīng)用方法，是應(yīng)用該菌株的菌液5.0X 105Cfu/ml在水培苗栽植前將苗蘸根lOmin。本發(fā)明涉及的菌株是從木麻黃植株中分離純化得到的，目標菌株為曲霉(Aspergillus sp.)木麻黃根際真菌17,已于2012年6月28日在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心登記保藏，簡稱CGMCC，地址為北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號，保藏編號為CGMCC N0.6309。將木麻黃根際真菌17接種于木麻黃水培苗，根據(jù)各項指標綜合評判，進一步證實其對生物量增長具有促進作用以及實際對木麻黃的干物質(zhì)的增效作用，尋找到對生物量增長有益的功能內(nèi)生真菌可應(yīng)用于生產(chǎn)。通過菌液浸泡的方法接種于木麻黃幼苗，接種30天后用測定木麻黃苗木的生物量參數(shù)。株高比較顯示，菌株17號處理較對照株高促生效果良好，為對照苗木株高的2.04倍；菌株17號處理下苗木地徑與對照苗木相比分別增加了 72.88%，菌株17號處理下苗木的生物量鮮重、生物量干重、地上部分鮮重和干重、地下部分鮮重和干重都顯著高于其他菌株處理下的苗木，生物量鮮重達到1.128g，為對照CK的2.53倍，生物量干重達到0.307g,為對照CK的1.81倍，地上部分與地下部分各生物量指標較對照的增幅至少達到45%以上，因此，菌株17號對木麻黃苗木的生物量促進作用最明顯；說明內(nèi)生真菌的接種對木麻黃水培苗地上和地下部分的生物量分配產(chǎn)生了極大的影響，能夠促使苗木更好地進行光合作用，從而使得地上部分的生長發(fā)育更加發(fā)達，因此，同樣的外界光照條件下，接菌苗木有可能對光照的利用和競爭能力更強。表明其對于增加木麻黃的干物質(zhì)積累具有極顯著效果。
具體實施例方式1、水培繁殖中的應(yīng)用
取配制好的木麻黃根際真菌17 (菌株17)應(yīng)用菌液，制成5.0X105cfu/ml菌液，在水培苗栽植前蘸根lOmin?？商岣咧裁绯苫盥?0%以上。2、根際土壤澆施應(yīng)用
試驗材料為惠安一號水培苗，苗木于2011年7月盆栽于福建農(nóng)林大學森林生態(tài)研究所田間試驗地。水培苗根系長齊后，將其移入黃心壤土和沙以3:1的比例混合的土壤，并分裝于約500個直徑22cm，高15cm的花盆中。每盆放入相等質(zhì)量的3.36KG混合土壤，為了保證后期苗木接菌的準確性，往每盆土壤中滴入1(Γ15滴甲醛(福爾馬林)消毒液，并用塑料薄膜封蓋盆口，消毒時間為24h。待土壤內(nèi)甲醛滲透消毒完全，除去塑料薄膜，將剩余的甲醛蒸發(fā)，以免影響幼苗的移植成活率。經(jīng)過一個月的恢復性生長，在木麻黃根際施入菌株濃度為
9.0X 105cfu/ml的菌液100ml，重復3次，用蒸餾水溶液處理作為空白對照。菌液的制備:將該株內(nèi)生菌接入液體培養(yǎng)基，培養(yǎng)基為改良馬丁培養(yǎng)基，每L含蛋白胨5.0g、酵母浸出粉2.0g、葡萄糖20.0g、磷酸氫二鉀1.0g、硫酸鎂0.5g,其它為無菌水，pH值6.4±0.2。經(jīng)過24h的培養(yǎng)，利用血球計數(shù)板計算菌液濃度，將菌液用超純水稀釋成
1.0X 106cfu/ml至9.0X 106cfu/ml備用。接種后30天后進行生物量等指標的測定，檢測方法和結(jié)果如下:
2.1菌株浸泡后木麻黃生物量參數(shù)分析 每個菌株處理隨機抽取3株木麻黃水培幼苗，分別用游標卡尺和鋼尺進行地徑、苗高的測量，將整株苗木完整地挖出，洗凈根部的泥土并晾干，分地上部分和地下部分將其剪斷，記下鮮重，裝入信封并分別標號，放入烘箱設(shè)置85°C殺青30min后，設(shè)置60°C烘干至恒重，記下干重，試驗測定的相關(guān)生物量指標還包括:植株根冠比、含水率和總生物量(鮮重和干重)。所有數(shù)據(jù)處理以及圖表制作均采用Excel和SPSS軟件處理。結(jié)果分析
1.1菌株17處理對木麻黃水培苗株高、地徑的影響
株高比較顯示，菌株17號處理較對照株高促生效果良好，分別為對照苗木株高的2.04倍；不同處理下的苗木地徑，其中菌株17號處理與對照苗木相比增加了 72.88%，表明接種菌株17號能夠促進木麻黃苗粗生長，有利于培育壯苗。不同處理對木麻黃水培苗生物量的影響
生物量是反映苗木生產(chǎn)力水平的重要指標，它與苗木地上與地下部分的生長發(fā)育之間有著極為密切的關(guān)系；植物的根冠比是指植物地下部分與地上部分的干重的比值，它的大小能夠表征苗木對土壤養(yǎng)分或光照的需求與競爭能力，若根冠比值越大，則說明苗木對養(yǎng)分的需求和競爭能力越強，相反根冠比值越小，則說明苗木對光照的需求和競爭能力越強。用SPSS 18.0統(tǒng)計分析軟件對木麻黃苗木的各生物量指標進行方差分析，結(jié)果表明菌株17處理下木麻黃苗木的各生物量指標與對照植株相比的sig均為0.000,即差異均達到顯著水平(顯著水平為0.05)，各指標的多重比較見表I。表I不同處理對木麻黃苗木生物量的影響
權(quán)利要求
1.一株能促進木麻黃生物量增長的內(nèi)生真菌，其特征在于:所述內(nèi)生真菌為曲霉{Aspergillus sp.)木麻黃根際真菌17,已于2012年6月28日在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心登記保藏，保藏編號為CGMCC N0.6309。
2.一種如權(quán)利要求1所述的內(nèi)生真菌的應(yīng)用菌液，其特征在于:所述應(yīng)用菌液的制備方法，是將所述的曲霉{Aspergillus sp.)木麻黃根際真菌17接入液體培養(yǎng)基,搖床振蕩培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為28°C，培養(yǎng)時間48 72h，利用血球計數(shù)板計算菌液濃度，將菌液用超純水稀釋成1.0-9.0X106cfu/ml，備用；液體培養(yǎng)基:為改良馬丁培養(yǎng)基，其中蛋白胨5.0g/L、酵母浸出粉2.0g/L、葡萄糖20.0g/L、磷酸氫二鉀1.0g/L、硫酸鎂0.5g/L、其它為無菌水、pH 值 6.4±0.2。
3.—種如權(quán)利要求2所述的應(yīng)用菌液的用途，其特征在于:所述應(yīng)用菌液用于林地澆根或苗木栽植前期 蘸根。
全文摘要
本發(fā)明涉及一株能促進木麻黃生物量增長的內(nèi)生真菌。所述內(nèi)生真菌為曲霉(Aspergillussp.)木麻黃根際真菌17，已于2012年6月28日在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心登記保藏，保藏編號為CGMCC No.6309。將木麻黃根際真菌17接種于木麻黃水培苗，根據(jù)各項指標綜合評判，進一步證實其對生物量增長具有促進作用以及實際對木麻黃的干物質(zhì)的增效作用，尋找到對生物量增長有益的功能內(nèi)生真菌可應(yīng)用于生產(chǎn)。
文檔編號A01G1/00GK103173364SQ201310069028
公開日2013年6月26日 申請日期2013年3月5日 優(yōu)先權(quán)日2013年3月5日
發(fā)明者謝安強, 洪偉, 吳承禎, 林燕青, 洪滔 申請人:福建農(nóng)林大學