專利名稱：油茶組培苗繁殖用繼代培養(yǎng)基及其繁殖方法
技術領域：
本發(fā)明涉及無性繁殖領域，具體涉及一種油茶組培苗繁殖用繼代培養(yǎng)基及其繁殖方法。
背景技術：
油茶是我國特有的優(yōu)質木本油料樹種，在我國油茶已有2300多年的栽培歷史。其榨取的茶油色清味香，營養(yǎng)豐富，對高血壓、高血脂、心臟病等心腦血管疾病具有良好的醫(yī)療保健作用，已被聯(lián)合國列為重點推廣的健康型高級食用植物油。同時，茶油的副產品茶枯和茶殼可通過綜合利用提取茶皂素、磨制拋光粉和發(fā)酵高蛋白飼料等，油茶果殼可生產活性碳和提取鞣料等，因此油茶的附加值高。另外，油茶適應性廣、耐瘠薄，是南方低山、丘陵和崗地很好的經濟林樹種之一，且不與糧棉爭地，具有一年種植，多年收益的特點，被林農稱為“鐵桿莊稼”、“綠色油庫”。因此，發(fā)展油茶產業(yè)不僅有利于緩解我國食用油長期依賴進口、供需緊張的局面，同時油茶的經濟效益高，可增加農民的收益、推動農村經濟的發(fā)展和提高國民的健康水平。油茶種苗的繁育主要采用扦插育苗、芽苗砧嫁接和低產林高頭換接等無性繁殖技術措施。然而，由于受到油茶 優(yōu)良品種無性系繁殖材料資源有限的限制，加上苗木培育時間長、苗木繁殖系數低等因素影響，難以在短時間內快速培育出大量優(yōu)良無性系苗木，以滿足油茶產業(yè)發(fā)展的需求，因此，迫切需求提供一種繁殖系數高、移栽成活率高的油茶組培苗的繁殖方法。目前，關于油茶組培苗的繁殖研究較為前沿的報道有名稱為“油茶離體培養(yǎng)誘導再生植株的研究”(畢方鋮等，經濟林研究，第22卷第2期，第5 9頁，2004年)的科技文獻，其公開了以油茶優(yōu)良無性系湘林4號的莖段、幼胚、子葉在離體條件下進行誘導繁殖，莖段培養(yǎng)以MS為基本培養(yǎng)基，附加6-BA3. Omg/L+NAAl. Omg/L對芽進行誘導，誘導率達到83. 33% ;繼續(xù)原培養(yǎng)基上進行繼代培養(yǎng)得到叢生芽，對于幼胚和子葉，附加激素2，4 D2. Omg/L+KTl. Omg/L誘導，將誘導產生的愈傷組織轉到附加6-BA3. 0mg/L+NAA0. 05mg/L和
6-BA2. 5mg/L+IAAl. 5mg/L的培養(yǎng)基上誘導出不定芽，誘導率達到90%以上，且進一步公開了將無菌苗在MS+NAA7. 0mg/L培養(yǎng)基上誘導生根最適，但采用其公開的培養(yǎng)基進行誘導生根獲得的再生苗大多只有一條主根、須根很少，組培苗移栽后生根困難，難以成活，因此，其實質上并未能獲得能夠移栽成活的組培苗。同時，其所配置的誘導培養(yǎng)基中的6-BA、IAA的濃度較高，在實際操作過程中誘導生芽的效果并不好。另外，名稱為“一種油茶無性系組培苗高效生根方法”(CN102007867A)的中國專利文獻中公開了如下技術方案油茶無性系組培苗高效生根方法，包括初代培養(yǎng)、繼代培養(yǎng)、壯苗培養(yǎng)和生根培養(yǎng)過程，其中壯苗培養(yǎng)后，需在植物激素IBA1000 4000ppm的溶液中浸泡預處理5 10s，然后接種在生根培養(yǎng)基上培養(yǎng)獲得有根系的油茶組培苗。采用該方案雖然能夠獲得油茶組培苗，但是試驗研究表明，每次無菌苗進行生根接種前都必須更換新的IBA溶液對其進行浸泡，用于浸泡無菌苗的溶液不能重復使用，否則無菌苗極容易發(fā)生大面積的感染，造成無菌苗死亡和原料的浪費。同時，其提供的用于繼代培養(yǎng)的培養(yǎng)基只能促進無菌苗進行增殖，而無法促進無菌苗生長(壯苗)，因此在其后續(xù)階段還需要進行壯苗培養(yǎng)，使得整個組培苗繁殖的工時長。另外，其初代培養(yǎng)中的芽誘導率和生根培養(yǎng)過程中的生根率還是比較低。

發(fā)明內容
本發(fā)明的首要目的是提供一種油茶組培苗繁殖用繼代培養(yǎng)基，在繼代培養(yǎng)時可同時實現油茶無菌苗的增殖和壯苗，減少油茶組培苗的繁殖周期。其采取的方案為一種油茶組培苗繁殖用繼代培養(yǎng)基，其特征在于包括MS+6-BA0. 6 3. 0mg/L+IAA0. 06 1. 5mg/L。通過上述方案中對MS基本培養(yǎng)基中添加特定濃度的6-芐氨基嘌呤(6-BA)和吲哚乙酸(IAA)構成的繼代培養(yǎng)基對油茶無菌苗進行繼代培養(yǎng)，40天后油茶無菌苗的增殖倍數可達3. 88 5. 57，同時實現油茶苗的壯苗處理，不需后續(xù)再設置壯苗培養(yǎng)對油茶無菌苗進行培養(yǎng)，減短組培苗的繁殖周期、簡化工藝和節(jié)省配置壯苗培養(yǎng)基的原料。本發(fā)明的另一目的是提供一種油茶組培苗的繁殖方法，一種油茶組培苗的繁殖方法，其特征在于包括對油茶植株上截取消毒得到的莖段進行初代培養(yǎng)、繼代培養(yǎng)和將繼代培養(yǎng)后的無菌苗進行生根培養(yǎng)，所述繼代培養(yǎng)所用的繼代培養(yǎng)基為MS+6-BA0. 6 3. Omg/L+1ΑΑ0. 06 1. 5mg/L。通過上述組培方案和繼代培養(yǎng)基的相配合作用，可在較短的時間內獲得大量的油茶組培苗。本申請中進一步的技術方案為，所述生根培養(yǎng)所用的生根培養(yǎng)基為1/2 1/8MS+IBA2. 4 4. 8mg/L+NAA2. 2 4. 6mg/L。所述初代培養(yǎng)所用的初代培養(yǎng)基為MS+6-BA0. 6 1. 0mg/L+IAA0. 07 1. 3mg/L。采用上述生根培養(yǎng)基進行培養(yǎng)可使得油茶無菌苗的生根率達60 91. 4%，平均每株無菌苗可生1. 5 3. 18根根系，根系長度可達2. 8cm左右，獲得的組培苗的根系質量好，從而提高油茶組培苗的移栽成活率。同時，為實現組培苗的大量繁殖，可進行一次繼代培養(yǎng)，然后再將一次培養(yǎng)的叢生芽分別截取成含有一個嫩芽的無菌苗進行二次繼代培養(yǎng)，以提高繼代培養(yǎng)的增殖系數。其中，MS是指按照相關標準或手冊或教科書配置的常用于植物組培苗繁殖的基本培養(yǎng)基，1/2 1/8MS是指大量元素為按手冊或標準或教科書中配置的標準MS培養(yǎng)基中大量元素濃度的1/2 1/8倍、微量元素與按手冊或標準或教科書中配置的標準MS培養(yǎng)基中微量元素相同的培養(yǎng)基。IBA2. 4 4. 8mg/L是指配置好后的培養(yǎng)基中的IBA的濃度為2. 4 4. 8mg/L,本申請中其他處所采用的上述表述方式均應如此理解。當然,對于本領域技術人員采用常用的無機鹽、有機物對手冊或標準或教科書中配置MS基本培養(yǎng)基所列舉的原料無機鹽、有機物進行等同替換或小范圍改動某種無機鹽的濃度且對MS基本培養(yǎng)基培養(yǎng)性能不發(fā)生大的改變的方案也應屬于本申請中MS基本培養(yǎng)基所指的范圍內。本申請中，優(yōu)選采用硝酸鉀(KNO3)、硝酸銨(NH4NO3)、硫酸鎂(MgSO4. 7H20)、磷酸二氫鉀(KH2PO4)、氯化鈣(GaCl2)、硫酸鋅(ZnSO4 · 7H20)、硼酸(H3BO3)、鑰酸鈉(NaMoO4 · 5H20)、硫酸銅(CuSO4
5H20)、氯化鈷(CoCl2 . 6H20)、碘化鉀(KI)等無機鹽和蔗糖、維生素、氨基酸等有機化合物配置MS基本培養(yǎng)基。
該繁殖方法還包括將生根培養(yǎng)后得到的組培苗移栽至煉苗基質上進行煉苗處理，煉苗基質由28 32重量份鋸屑/稻殼、23 27重量份黃心土、4 6重量份草木灰、28 32重量份東北泥炭、4 6重量份珍珠巖和4 6重量份蛭石混合構成。由于后續(xù)的移栽所選用的基質對組培苗移栽的成活率影響巨大，申請人通過長期試驗發(fā)現，通過將組培苗移栽至上述煉苗基質中進行煉苗，油茶組培苗能夠健壯生長，成活率高，提高后續(xù)油茶苗上山移栽的成活率。具體的截取接種莖段和初代培養(yǎng)、繼代培養(yǎng)、生根培養(yǎng)操作分別為所述的接種莖段是從油茶樹上截取的生長健壯的接種枝，將接種枝上的每片葉片截去3/4 5/6進行清洗消毒后再截去剩余的葉片和接種枝基部，然后按一腋芽一莖段進行截取得到。初代培養(yǎng)將消毒后的接種莖段接種至設有初代培養(yǎng)基的接種瓶內，并將接種瓶用封口膜封口扎緊，再將接種瓶避光處理4 6天，然后進行光照培養(yǎng)30 40天，初代培養(yǎng)基為 MS+6-BA0. 6 1. 0mg/L+IAA0. 07 1. 3mg/L ；繼代培養(yǎng)將初代培養(yǎng)得到的無菌苗轉移至設有繼代培養(yǎng)基的接種瓶內同時進行壯苗和增殖培養(yǎng)，培養(yǎng)35 45天，繼代培養(yǎng)基為MS+6-BA0. 6 3. 0mg/L+IAA0. 06 1. 5mg/L ；生根培養(yǎng)將繼代培養(yǎng)得到的叢生芽切成1. 2 2. Ocm分別含有嫩芽的無菌苗并接種至設有生根培養(yǎng)基的接種瓶內進行培養(yǎng)生根，培養(yǎng)25 35天，生根培養(yǎng)基為1/2 1/8MS+IBA2. 4 4. 8mg/L+NAA2. 2 4. 6mg/L。按上述組合的 參數實施本發(fā)明的技術方案，初代培養(yǎng)的芽誘導率可達93.3%，繼代培養(yǎng)中無菌苗的增殖系數可達5. O以上，生根培養(yǎng)的生根率可達91. 4%，每株組培苗平均具有3. 18根根系，相對于實現本發(fā)明目的的其他技術參數方案在繁殖系數和獲取的組培苗質量上有顯著的提高。


圖la、Ib為初代培養(yǎng)；圖2a、2b為繼代培養(yǎng)；圖3a、3b為生根培養(yǎng)；圖4a、4b、4c為煉苗處理。
具體實施例方式以通過具體實施方式
，來對本發(fā)明作進一步的說明。其中操作I是配置各種培養(yǎng)基和獲取繁殖用接種莖段，操作2是在不同初代培養(yǎng)基中對接種莖段進行初代培養(yǎng)，操作3是在不同繼代培養(yǎng)基中對初代培養(yǎng)后獲得無菌苗進行繼代培養(yǎng)，操作4是在不同生根培養(yǎng)基中對繼代培養(yǎng)后獲得無菌苗進行生根培養(yǎng)，操作5是在不同煉苗基質中對生根培養(yǎng)獲得組培苗進行煉苗處理。操作1:配置培養(yǎng)基和獲取繁殖用莖段(a)配置培養(yǎng)基分別稱取以下無機鹽、有機物、植物激素以及有機附加物待用；
無機鹽大量元素包括硝酸鉀(KNO3)、硝酸銨(NH4NO3)、硫酸鎂(MgSO4. 7H20)、磷酸二氫鉀(ΚΗ2Ρ04)、氯化鈣(GaCl2)等；微量元素包括硫酸鋅(ZnSO4 · 7H20)、硼酸(H3BO3)、鑰酸鈉(NaMoO4 . 5H20)、硫酸銅(CuSO4 · 5H20)、氯化鈷(CoCl2 · 6H20)、碘化鉀(KI)等；有機物包括蔗糖、維生素類和氨基酸等；植物激素有生長素吲哚乙酸(IAA)、吲哚丁酸(IBA)、萘乙酸(NAA)，細胞分裂素
6-芐氨基嘌呤(6-BA)和赤霉素。有機附加物有機附加物包括人工合成或天然的有機物，如果汁、卡拉膠。按相關標準或操作手冊或教科書中記載的方案配置MS基本培養(yǎng)基，然后分別取不同濃度和種類的植物激素與MS基本培養(yǎng)基配置成各種型號的初代培養(yǎng)基、繼代培養(yǎng)基和生根培養(yǎng)基，并殺菌處理后待用。(b)獲取繁殖用接種莖段接種材料采集供試材料取自于安徽黃山市林科所油茶良種基地，品種有黃山I號、2號、4號和長林4號、27號、56號等六個品種。米集時間在4月 8月，選在晴天無露水時間段，以樹體中上部當年生無感染、無病蟲害、生長健壯的嫩梢，作為油茶外植體初代培養(yǎng)材料。將采回的油茶外植體分成四份，三份用塑料保鮮袋裝好封口，貯藏在3 5°C的冰箱里，備不同日期接種成活率對比試驗。接種枝的處理將接種枝(外植體)上的每片葉片剪去3/4 5/6，放入燒杯中用洗衣液泡洗二次，然后再用清水洗去洗衣液，洗凈后用自來水再緩沖lh。將緩沖Ih的油茶接種枝浙凈水放到生物凈化工作臺上，用75%的酒精浸泡30s后倒去酒精，又快速倒入配比1%。的升汞溶液浸泡滅菌10 20min，根據油茶接種枝嫩度來確定滅菌時間。滅菌時將容器輕輕搖晃，使接種枝各個部 位都接觸到升汞溶液，滅菌后即去凈升汞溶液，再用無菌水連續(xù)沖洗8遍以上，每遍晃動沖洗30s左右，然后用無菌吸水紙吸干并剪去剩余的葉片和截去接種枝的基部，然后由接種枝底部至稍部，以一個腋芽為一莖段截取，作為一個接種莖段待用。操作2 :初代培養(yǎng)接種室及設備消毒滅菌先將接種室的紫外燈打開消毒滅菌30min，之后接通凈化工作臺電源，啟動鼓風機、照明開關、紅外接種環(huán)滅菌器，用75%的酒精噴霧凈化工作臺內壁；75%的酒精擦洗剪刀、鑷子，并放入50°C 825°C紅外接種環(huán)滅菌器高溫滅菌，達到滅菌效果后取出冷卻；將消毒好的無菌水、無菌紙、無菌吸水紙擺放在凈化工作臺上備用。接種將截取的接種莖段接種到含有如表I所示的各種型號的初代培養(yǎng)基的接種瓶內，并編號初I組 初6組，每組10瓶，每瓶接種3支接種莖段，封口膜扎緊瓶口，置于培養(yǎng)室培養(yǎng)。初代接種培養(yǎng)需在溫室暗處理5天后啟動光照，培養(yǎng)室溫度25 28°C、濕度60%，每天光照時間10h，光照強度1000 1500LX。觀察各接種瓶內接種莖段的初代培養(yǎng)狀況，培養(yǎng)結果具體如表I所示。表I不同型號的初代培養(yǎng)基對接種莖段初代培養(yǎng)的培養(yǎng)結果
權利要求
1.一種油茶組培苗繁殖用繼代培養(yǎng)基，其特征在于包括MS+6-BA0. 6 3. Omg/L+1ΑΑ0. 06 1. 5mg/L。
2.一種油茶組培苗的繁殖方法，其特征在于包括對油茶植株上截取消毒得到的接種莖段進行初代培養(yǎng)、繼代培養(yǎng)和將繼代培養(yǎng)后的無菌苗進行生根培養(yǎng)，所述繼代培養(yǎng)所用的繼代培養(yǎng)基為 MS+6-BA0. 6 3. 0mg/L+IAA0. 06 1. 5mg/L。
3.如權利要求1所述的油茶組培苗的繁殖方法，其特征在于所述生根培養(yǎng)所用的生根培養(yǎng)基為 1/2 1/8MS+IBA2. 4 4. 8mg/L+NAA2. 2 4. 6mg/L。
4.如權利要求2所述的油茶組培苗的繁殖方法，其特征在于所述初代培養(yǎng)所用的初代培養(yǎng)基為 MS+6-BA0. 6 1. 0mg/L+IAA0. 07 1. 3mg/L。
5.如權利要求2所述的油茶組培苗的繁殖方法，其特征在于該繁殖方法還包括將生根培養(yǎng)后得到的組培苗移栽至煉苗基質上進行煉苗處理，煉苗基質由28 32重量份鋸屑/稻殼、23 27重量份黃心土、4 6重量份草木灰、28 32重量份東北泥炭、4 6重量份珍珠巖和4 6重量份蛭石混合構成。
6.如權利要求2或3或4或5所述的油茶組培苗的繁殖方法，其特征在于所述的接種莖段是從油茶樹上截取的生長健壯的接種枝，將接種枝上的每片葉片截去3/4 5/6進行清洗消毒后再截去剩余的葉片和接種枝基部，然后按一腋芽一莖段進行截取得到。
7.如權利要求2 6中任意一項所述的油茶組培苗的繁殖方法，其特征在于，具體的操作步驟為 初代培養(yǎng)將消毒后的接種莖段接種至設有初代培養(yǎng)基的接種瓶內，并將接種瓶用封口膜封口扎緊，再將接種瓶避光處理4 6天，然后進行光照培養(yǎng)30 40天，初代培養(yǎng)基為 MS+6-BA0. 6 1. 0mg/L+IAA0. 07 1. 3mg/L ； 繼代培養(yǎng)將初代培養(yǎng)得到的無菌苗轉移至設有繼代培養(yǎng)基的接種瓶內同時進行壯苗和增殖培養(yǎng)，培養(yǎng)35 45天，繼代培養(yǎng)基為MS+6-BA0. 6 3. 0mg/L+IAA0. 06 1. 5mg/L ； 生根培養(yǎng)將繼代培養(yǎng)得到的叢生芽切成1. 2 2. Ocm分別含有嫩芽的無菌苗并接種至設有生根培養(yǎng)基的接種瓶內進行培養(yǎng)生根，培養(yǎng)25 35天，生根培養(yǎng)基為1/2 1/8MS+IBA2. 4 4. 8mg/L+NAA2. 2 4. 6mg/L。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種油茶組培苗繁殖用繼代培養(yǎng)基，包括MS+6-BA0.6～3.0mg/L+IAA0.06～1.5mg/L。通過上述方案中對MS基本培養(yǎng)基中添加特定濃度的6-芐氨基嘌呤和吲哚乙酸構成的繼代培養(yǎng)基對油茶無菌苗進行繼代培養(yǎng)，40天后油茶無菌苗的增殖倍數可達3.88～5.57，同時實現油茶苗的壯苗處理，不需后續(xù)再設置壯苗培養(yǎng)對油茶無菌苗進行培養(yǎng)，減短組培苗的繁殖周期、簡化工藝和節(jié)省配置壯苗培養(yǎng)基的原料。
文檔編號A01H4/00GK103039362SQ20131001299
公開日2013年4月17日 申請日期2013年1月14日 優(yōu)先權日2013年1月14日
發(fā)明者劉越秀, 潘新建, 周其新, 張運斌, 趙忠菊 申請人:黃山市林業(yè)科學研究所