Phacosporacea抗性大豆植物的制作方法
【專利摘要】提供了在轉(zhuǎn)基因植物和/或植物細(xì)胞中，增加對Phacosporaceae科的真菌病原體的抗性的方法。在這些植物中，乙烯信號(hào)傳遞通路和/或乙烯信號(hào)化合物的活性被改變。相比野生型植物和/或野生型植物細(xì)胞，這是通過在這些植物中誘發(fā)乙烯信號(hào)傳遞通路來實(shí)現(xiàn)的。根據(jù)特定信號(hào)傳遞化合物的激活或抑制功能，可以使用關(guān)聯(lián)基因過表達(dá)或敲低。
【專利說明】Phacosporacea抗性大S_植物
[0001]本發(fā)明涉及在轉(zhuǎn)基因植物和/或植物細(xì)胞中，增加對Phacosporaceae科的真菌病原體的抗性的方法。在這些植物中，乙烯信號(hào)傳遞通路和/或乙烯信號(hào)化合物的活性被改變。相比野生型植物和/或野生型植物細(xì)胞，這是通過在這些植物中誘發(fā)乙烯信號(hào)傳遞通路來實(shí)現(xiàn)的。根據(jù)特定信號(hào)化合物的激活或抑制功能，可以使用關(guān)聯(lián)基因過表達(dá)或敲低。
[0002]此外,本發(fā)明涉及具有增加的對Phacosporacea科真菌病原體例如大豆銹菌抗性的轉(zhuǎn)基因植物和/或植物細(xì)胞，以及包含與編碼功能性乙烯信號(hào)化合物的序列或其片段相同或同源的序列的重組表達(dá)載體。
[0003]農(nóng)作物的耕種主要用于生產(chǎn)人和動(dòng)物的食品。特別是當(dāng)今慣例的單種作物栽培對疾病的流行性傳播高度易感。結(jié)果是明顯減少的產(chǎn)量。到目前為止，主要通過用殺蟲劑控制病原生物。目前，直接修飾植物或病原體的遺傳傾向的可能性也對人類開放。
[0004]抗性一般表示植物防止，或至少減少有害病原體的侵?jǐn)_和建群的能力。在植物用于防止植物病原性生物的建群的天然存在的抗性中可以識(shí)別出不同的機(jī)制。這類病原體和宿主之間的特異相互作用確定了感染的過程(Schopfer和Brennicke (1999)Pflanzenphysiologie, Springer Verlag,柏林-海德堡，德國)。
[0005]關(guān)于宗族特異性抗性，又稱為宿主抗性，在相容和不相容相互作用之間有差異。在相容相互作用中，在病毒性病原體和易感植物之間發(fā)生相互作用。病原體存活，并可建立繁殖結(jié)構(gòu)，而宿主大部分先后死去。另一方面，當(dāng)病原體感染植物但在癥狀的弱發(fā)展之前或之后其生長被抑制時(shí)，發(fā)生不相容相互作用。在后一種情況下，植物對相應(yīng)的病原體具有抗性(Schopfer和Brennick,見上)。然而,此類抗性是對于某些株或病原體特異性的。
[0006]在相容和不相容相互作用中，都發(fā)生宿主對病原體的防御性和特異性反應(yīng)。然而，事實(shí)上由于病原體的新病毒性宗族的快速進(jìn)化發(fā)展，此抗性通常被克服(Neu等人，(2003)American Cytopathol.Society, MPMI16N0.7:626-633)。
[0007]大部分病原體是植物物種特異性的。這表示病原體可在某些植物物種中誘導(dǎo)疾病，但不在其他植物物種中誘導(dǎo)疾病(Heath (2002) Can.J.PlantPathol.24:259-264)。某些植物物種中對病原體的抗性稱為非宿主抗性。非宿主抗性提供對植物病原體的強(qiáng)力、廣泛和永久的防護(hù)。提供非宿主抗性的基因在非宿主植物中提供對某些疾病的強(qiáng)力、廣泛和永久的防護(hù)的機(jī)會(huì)。特別地，此類抗性對病原體的不同株系起作用。
[0008]在識(shí)別潛在病原體后不久，植物立即開始觸發(fā)防御反應(yīng)。在絕大部分情況下，通過所謂的PAMP受體感受病原體的存在，這是一類識(shí)別保守的病原體相關(guān)分子(例如，鞭毛蛋白或幾丁質(zhì))的跨膜受體樣激酶。PAMP受體的下游一植物激素水楊酸(SA)、茉莉酮酸酯(JA)和乙烯(ET)在調(diào)控不同的防御反應(yīng)中發(fā)揮關(guān)鍵的作用。根據(jù)不同植物激素的比例，宿主細(xì)胞觸發(fā)不同的防御反應(yīng)。一般而言，SA依賴性防御與對活體營養(yǎng)性病原的抗性相關(guān),而JA/ET依賴性防御反應(yīng)則是抗壞色營養(yǎng)性(necrotrophic)病原體(和昆蟲)活性的。在大部分植物病原體相互作用中，ET表現(xiàn)出與JA協(xié)同作用，拮抗SA的“活體營養(yǎng)性”防御。例如，普遍已知的JA標(biāo)志物蛋白PDF1.2需要同時(shí)激活ET和JA使其在抗壞色營養(yǎng)性病原體的防御過程中被上調(diào)。與JA/ET通路對抗壞色營養(yǎng)性病原體的抗性的關(guān)鍵性參與是由下述事實(shí)所確證的:參與ET信號(hào)傳遞的重要蛋白——ERFl的過表達(dá)(參見圖1)導(dǎo)致增強(qiáng)的抗壞色營養(yǎng)性真菌灰葡萄孢(Botrytis cinerea)、尖孢鐮刀菌(Fusarium oxysporum)和黃 Plectosphaerella cucumerina 的抗性(Berrocal-Lobo 等人，2002, Plant Journal29:23-32 ；Berrocal-Lobo 和 Molina2004, MPMI17:763ff)。另一方面，通過過表達(dá) ERFl 誘發(fā)ET信號(hào)傳遞通路，增加了擬南芥屬對活體營養(yǎng)性病原體丁香假單胞菌(Pseudomonassyringae)的易感性(Berrocal-Lobo 等人，2002, Plant Journal29:23-32),證明了 JA/ET與SA通路負(fù)相互作用，從而根據(jù)攻擊的病原體平衡防御反應(yīng)性質(zhì)使植物能夠調(diào)整其防御應(yīng)答的假設(shè)模型。因此，一般認(rèn)為ET信號(hào)傳遞通路的誘發(fā)導(dǎo)致了對壞色營養(yǎng)性真菌的抗性增加，同時(shí)對活體營養(yǎng)性病原體的易感性增加。
[0009]真菌分布于全世界。到目前為止，已知約100000種不同的真菌種類。銹菌非常重要。它們可具有復(fù)雜的發(fā)育周期，具有多達(dá)5個(gè)不同孢子階段(不動(dòng)精子、銹孢子、夏孢子、冬孢子和擔(dān)孢子)。
[0010]在病原真菌感染植物的過程中，通常觀察到不同的階段。在植物病原性真菌和其潛在宿主植物之間的相互作用的第一階段對于真菌的植物建群是決定性的。在感染的第一階段，孢子附著于植物表面，發(fā)芽，真菌穿透植物。真菌可通過已有的入口例如氣孔、皮孔、排水器和傷口穿透植物，或者它們由于機(jī)械力的作用以及在細(xì)胞壁消化酶的幫助下，直接穿透植物表皮。為了穿透植物，發(fā)育了特異性的感染結(jié)構(gòu)。大豆銹菌豆薯層銹菌(Phakopsora pachyrhizi)直接穿透植物表皮。在穿過表皮細(xì)胞后,真菌到達(dá)葉肉的細(xì)胞內(nèi)空間，在此真菌開始在葉中擴(kuò)散。為獲得營養(yǎng)物，真菌穿透葉肉細(xì)胞并在葉肉細(xì)胞內(nèi)發(fā)育出吸器。在穿透過程中，被穿透的葉肉細(xì)胞的質(zhì)膜保持完整。因此大豆銹菌與大豆建立活體營養(yǎng)型相互作用。
[0011]大豆銹病最近已變得日益重要。此疾病可由活體營養(yǎng)性銹菌豆薯層銹菌(Phakopsora pachyrhizi (Sydow)和山馬蟥層鎊菌(Phakopsora meibomiae (Arthur)導(dǎo)致。它們屬于擔(dān)子菌綱，銹菌目，層銹菌科。兩種銹菌都感染多種豆類宿主植物。豆薯層銹菌也稱為亞洲銹菌， 是對大豆(Glycine max)更具有侵略性的病原體，因此,至少目前,它對農(nóng)業(yè)很重要。豆薯層銹菌可見于世界上幾乎全部熱帶和亞熱帶大豆種植區(qū)域。豆薯層銹菌能在自然條件下感染來自17個(gè)科的31種豆類植物，還能在受控制的條件下在另外60種上生長(Sinclair 等人(編)，Proceedings of the rust workshop (1995), NationalSoyaResearch Laboratory, Publication N0.1 (1996) ；Rytter J.L.等人，Plant Dis.87,818(1984))。山馬蟥層銹菌(P.meibomiae)已見于加勒比海盆地區(qū)和波多黎各，尚未造成實(shí)質(zhì)性破壞。
[0012]豆薯層銹菌目前只能用殺真菌劑的方法在田地中控制。沒有對隔離群的全部譜有抗性的大豆植物。在尋找抗性植物時(shí)，發(fā)現(xiàn)了 4個(gè)介導(dǎo)大豆對豆薯層銹菌抗性的顯性基因Rppl-4?？剐匝杆賮G失，因?yàn)槎故韺愉P菌發(fā)展出新的病毒性宗族。
[0013]最近幾年中，真菌病例如大豆銹病作為病害在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的重要性增加了。因此現(xiàn)有技術(shù)中存在開發(fā)控制真菌和提供真菌抗性植物的方法的需求。
[0014]對感染植物表皮層的白粉菌和霜霉菌進(jìn)行了大量研究。然而，對付感染葉肉的大豆銹菌的問題仍未解決。
[0015]令人驚訝的發(fā)現(xiàn)，可以利用乙烯介導(dǎo)的防御，控制Phacosporaceae科的活體營養(yǎng)性真菌病原體(例如大豆銹菌真菌)，盡管現(xiàn)有技術(shù)教導(dǎo)了誘發(fā)乙烯介導(dǎo)的防御可導(dǎo)致對活體營養(yǎng)性真菌的易感性增加(Berrocal-Lobo等人,2002, Plant Journal29:23-32)。通過過表達(dá)若干參與乙烯信號(hào)傳遞的蛋白質(zhì)，或通過下調(diào)若干參與抑制ET信號(hào)傳遞通路的蛋白質(zhì)，誘發(fā)ET通路。一般而言，應(yīng)預(yù)期誘發(fā)ET信號(hào)傳遞通路將導(dǎo)致對亞洲大豆銹菌(ASR)的易感性增強(qiáng)，因?yàn)镋T信號(hào)傳遞通路與SA通路相關(guān)的活體營養(yǎng)性防御負(fù)相互作用。另一方面，應(yīng)該預(yù)期通過抑制ET信號(hào)傳遞通路可增強(qiáng)對ASR的抗性，因此將SA通路去瓶頸化。令人驚訝的發(fā)現(xiàn)，ET信號(hào)傳遞通路本身增強(qiáng)了對大豆銹菌的抗性。參與ET信號(hào)傳遞通路的若干蛋白質(zhì)(ERFl、ERF2、Pti4、Pti5)的過表達(dá)增加了大豆對Phacosporaceae科的真菌病原體，例如大豆銹菌的抗性。下調(diào)ET信號(hào)傳遞通路的拮抗蛋白(如CTRl和EBF1)也增加了大豆對Phacosporaceae科,例如大豆銹菌的真菌病原體的抗性。反之，過表達(dá)ET信號(hào)傳遞通路的拮抗蛋白(如CTRl和EBF1)增加了大豆對Phacosporaceae科的真菌病原體，例如大豆銹菌的易感性。這明確證實(shí)了 ET介導(dǎo)的防御通路對大豆抗Phacosporaceae科的真菌病原體，例如大豆銹菌抗性的正面影響。
[0016]本發(fā)明的目標(biāo)是提供利用乙烯信號(hào)傳遞通路，尤其是通過誘發(fā)乙烯信號(hào)傳遞通路，增加轉(zhuǎn)基因植物和/或轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞對Phacosporaceae科的真菌病原體，優(yōu)選對Phacospora屬的真菌病原體,最優(yōu)選對豆薯層銹菌(Phakopsora pachyrhizi (Sydow))和山馬蟥層銹菌(Phakopsora meibomiae (Arthur)),也被稱為大豆銹菌的真菌病原體的抗性的方法?？梢匀缦聦?shí)現(xiàn)上述方法:過表達(dá)一種或多種本發(fā)明的核酸從而誘發(fā)乙烯信號(hào)傳遞通路，或下調(diào)一種或多種也將導(dǎo)致誘發(fā)乙烯信號(hào)傳遞通路的本發(fā)明的核酸，或二者的組合，其依次導(dǎo)致對Phacosporaceae科的真菌病原體,例如大豆銹菌的抗性增加。
[0017]為了誘發(fā)乙烯信號(hào)傳遞通路和實(shí)現(xiàn)對Phacosporaceae科的真菌病原體(例如大豆銹菌)的抗性增加而過表達(dá)的本發(fā)明的核酸是Pti4、Pti5、ERFl和/或ERF2，例如SEQID NO:1、3、5或7的任一項(xiàng)定義的，或其任意的同源物、衍生物或直向同源物或旁系同源物。還可以通過下調(diào)任意的Pti4、Pti5、ERFl和/或ERF2的抑制子，實(shí)現(xiàn)誘發(fā)乙烯信號(hào)傳遞通路，所述抑制子例如靶向這些基因的微小RNA或ta-siRNA。
[0018]為了誘發(fā)乙烯信號(hào)傳遞通路和實(shí)現(xiàn)對Phacosporaceae科的真菌病原體(例如大豆銹菌)的抗性增加而下調(diào)的本發(fā)`明的核酸是CTRUEBF1和/或EBF2，例如SEQ ID NO:9、
11、13、15、17、19、21或23的任一項(xiàng)定義的，或其任意的片段、同源物、衍生物或直向同源物或旁系同源物。還可以通過過表達(dá)任意CTRUEBF1和/或EBF2的抑制子，實(shí)現(xiàn)誘發(fā)乙烯信號(hào)傳遞通路，所述抑制子例如靶向這些基因的微小RNA或ta-siRNA。
[0019]另一個(gè)目標(biāo)是提供抗Phacosporaceae科的真菌病原體，優(yōu)選抗Phacospora屬的真菌病原體，最優(yōu)選抗豆薯層銹菌(Phakopsora pachyrhizi) (Sydow)和山馬蟥層銹菌(Phakopsora meibomiae) (Arthur),也稱為大豆銹菌的轉(zhuǎn)基因植物,用于生產(chǎn)這類植物的方法，以及用于上述方法的載體構(gòu)建體。該目標(biāo)是通過獨(dú)立權(quán)利要求的主題實(shí)現(xiàn)的。從屬權(quán)利要求的特征定義了本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案。
[0020]定義:
[0021]參考以下的本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式的詳細(xì)說明以及其中包括的實(shí)例，可更方便地理解本發(fā)明。除非另有注明，本文使用的術(shù)語應(yīng)根據(jù)相關(guān)領(lǐng)域普通技術(shù)人員的慣常使用理解。除了本文提供的術(shù)語的限定，分子生物學(xué)中的常用術(shù)語的定義也可參見Rieger 等人，1991Glossary of genetics !classical and molecular,第 5 版，Berlin:Springer-VerlagjPCurrent Protocols in Molecular Biology, F.M.Ausubel 等人編，Current Protocols, a j oint venture between Greene Publishing Associates, Inc.and John ffiley& Sons, Inc., (1998Supplement)。應(yīng)當(dāng)理解，如說明書和權(quán)利要求書所用，單數(shù)形式“a”或“an”可表示一個(gè)或多個(gè)，取決于其使用的上下文。因此，例如，“細(xì)胞”可表示至少一個(gè)細(xì)胞可被利用。應(yīng)當(dāng)理解，本文所用的術(shù)語只用于說明【具體實(shí)施方式】的目的，并不旨在進(jìn)行限制。 [0022]在本申請中參考了多個(gè)出版物。這些出版物和其中引用的參考文獻(xiàn)的公開內(nèi)容在此以整體并入本申請，以更完整地說明本發(fā)明所屬的現(xiàn)有技術(shù)。用于克隆、DNA分離、擴(kuò)增和純化的、用于涉及DNA連接酶、DNA聚合酶、限制內(nèi)切酶等的酶促反應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)以及多種分離技術(shù)是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知并常用的。在Sambrook等人，1989Molecular Cloning,第 2 版，Cold Spring Harbor Laboratory, Plainview, N.Y.；Maniatis 等人，1982Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory, Plainview,N.Y.；ffu (編)1993Meth.Enzymo1.218, Part I ；ffu (編)1979Meth Enzymo1.68 ；ffu 等人，(編)1983Meth.Enzymo1.100 和 101 ；Grossman 和 Moldave(編)1980Meth.Enzymo1.65 ；Miller編)1972Experiments in Molecular Genetics,Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor, N.Y.；01d and Primrose,1981Principles of Gene Manipulation,Universityof California Press,Berkeley ;Schleif和Wensink, 1982Practical Methodsin Molecular Biology ;Glover(編)1985DNA Cloning Vol.1 and II,IRL Press,Oxford,UK ；Hames 和 Higgins (編)1985Nucleic Acid Hybridization, IRL Press, Oxford, UK ;和Setlow 和 Hollaenderl979Genetic Engineering:Principles and Methods,第 1-4 卷，Plenum Press, New York中說明了多種標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)。在使用時(shí),縮寫和命名法被視為本領(lǐng)域標(biāo)準(zhǔn)并廣泛用于專業(yè)雜志例如本文引用的那些中。
[0023]術(shù)語“誘發(fā)”理解為使植物或其部分對害蟲或病原體的未來攻擊敏化，從而誘導(dǎo)抵抗這類害蟲或病原體的抗性。通過誘發(fā)而誘導(dǎo)的抗性不是基于防御機(jī)制的直接激活，而是基于植物或植物組織的敏化，該敏化導(dǎo)致植物一旦暴露在病原體攻擊下，比未誘發(fā)的植物更快更強(qiáng)的表達(dá)防御機(jī)制?！罢T發(fā)”在本文中指使植物或植物部分敏化，從而能夠在暴露于一種或多種生物脅迫下時(shí)，比未誘發(fā)的對照植物或其部分更快和/或更強(qiáng)的激活防御機(jī)制，所述機(jī)制必須依賴于直接防御應(yīng)答。不作為限制本發(fā)明的范圍，認(rèn)為相比未誘發(fā)的植物或植物組織，誘發(fā)導(dǎo)致誘發(fā)的植物或植物組織的信號(hào)傳遞因子的水平增加，所述信號(hào)傳遞因子例如轉(zhuǎn)錄因子(TF)蛋白或MAP激酶等。在植物或植物組織后續(xù)暴露于脅迫(如害蟲或病原體)攻擊的條件下，這些失活的TF蛋白成為活性的，調(diào)控防御基因的基因表達(dá)，使誘發(fā)的植物或組織比未誘發(fā)的植物或組織產(chǎn)生更快和/或更強(qiáng)的防御應(yīng)答。為了方便應(yīng)用，誘發(fā)還可以理解為組成型的激活各個(gè)的防御機(jī)制。
[0024]術(shù)語“誘發(fā)乙烯信號(hào)傳遞通路”意指誘發(fā)的效應(yīng)是通過圖1所示的乙烯信號(hào)傳遞通路敏化來實(shí)現(xiàn)的，該敏化導(dǎo)致植物或植物組織的乙烯依賴性防御機(jī)制的更快更強(qiáng)的防御應(yīng)答?？梢酝ㄟ^增強(qiáng)Pti4、Pti5、ERFl和/或ERF2蛋白的表達(dá)，和/或通過抑制CTR1、EBF1和/或EBF2蛋白的表達(dá)，實(shí)現(xiàn)乙烯信號(hào)傳遞通路的敏化。
[0025]蛋白質(zhì)的“同源物”涵蓋這樣的肽、寡肽、多肽、蛋白質(zhì)和/或酶，所述肽、寡肽、多肽、蛋白質(zhì)和/或酶相對于未修飾的目標(biāo)蛋白質(zhì)具有氨基酸替換、缺失和/或插入，并與其來源的未修飾的蛋白質(zhì)具有相似的功能活性。
[0026]核酸的“同源物”涵蓋這樣的核苷酸和/或多核苷酸，所述核苷酸和/或多核苷酸相對于未修飾的目標(biāo)核酸具有核酸替換、缺失和/或插入，其中由此類核酸編碼的蛋白質(zhì)與由未修飾的核酸編碼的未修飾的蛋白質(zhì)相比具有類似或更高的功能活性，其中此類核酸源自所述未修飾的核酸。特別地，核酸的同源物涵蓋基于簡并氨基酸編碼的替換。
[0027]“缺失”指從蛋白質(zhì)除去一個(gè)或多個(gè)氨基酸，或從DNA、ssRNA和/或dsRNA除去一個(gè)或多個(gè)核酸。
[0028]“插入”指一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基或核酸殘基被引入蛋白質(zhì)或核酸中預(yù)定的位點(diǎn)。
[0029]“替換”指用具有相似性質(zhì)(例如相似的疏水性、親水性、抗原性、形成或破壞α-螺旋結(jié)構(gòu)或β-片層結(jié)構(gòu)的傾向)的其他氨基酸取代蛋白質(zhì)的氨基酸。
[0030]在核酸水平，替換指用其他核酸取代核酸，其中由修飾的核酸編碼的蛋白質(zhì)具有相似的功能。特別地，核酸的同源物涵蓋基于簡并氨基酸編碼的替換。
[0031]氨基酸替換通常是單個(gè)殘基的替換，但取決于對蛋白質(zhì)的功能性約束可為聚集的殘基，并可在I至10個(gè)氨基酸范圍內(nèi)變化；插入或缺失通常是約I至10個(gè)氨基酸殘基的數(shù)量級(jí)。氨基酸替換優(yōu)選地是保守氨基酸替換。本領(lǐng)域熟知保守替換表(參見例如Creighton (1984) Proteins, ff.H.Freeman and Company (編)和下表 I)。
[0032]表1:保守氨基酸替換的實(shí)例
[0033]
【權(quán)利要求】
1.用于增加植物和/或植物細(xì)胞中的Phacosporacea抗性的方法，其中相比野生型植物和/或植物細(xì)胞，乙烯信號(hào)傳遞通路被誘發(fā)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中乙烯信號(hào)傳遞通路是通過增強(qiáng)Pti4、Pti5、ERFl和/或ERF2蛋白的表達(dá)而誘發(fā)的。
3.根據(jù)權(quán)利要求2的方法，其中Pti4、Pti5、ERFl和/或ERF2蛋白是由 (i)與任意SEQ ID N0.1、3、5或7具有至少60 %同一性的重組核酸、其功能片段和/或能夠在嚴(yán)謹(jǐn)條件下與這類核酸雜交的重組核酸，和/或由 (?)編碼與任意SEQ ID N0.2、4、6或8具有至少60%同一性的蛋白質(zhì)、其功能片段、其直向同源物和/或旁系同源物的重組核酸， 編碼的。
4.根據(jù)權(quán)利要求1至3的任一項(xiàng)的方法，其包括: (a)用表達(dá)盒穩(wěn)定轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞，所述表達(dá)盒包含與啟動(dòng)子功能性連接的: (i)與任意SEQID N0.1、3、5或7具有至少60%同一性的重組核酸、和/或其功能片段和/或能夠在嚴(yán)謹(jǐn)條件下與這類核酸雜交的重組核酸，和/或 (?)編碼與任意SEQ ID N0.2、4、6或8具有至少60%同一性的蛋白質(zhì)、其功能片段、其直向同源物和/或旁系同源物的重組核酸； (b)從植物細(xì)胞再生植物；和 (c)以足以在所述植物中生成或增加大豆銹菌抗性的量和時(shí)間，表達(dá)所述編碼Pti4、Pti5、ERFl和/或ERF2蛋白的重組核酸。
5.重組載體構(gòu)建體，其包含: (a)(i)與任意SEQ ID N0.1、3、5或7具有至少60%同一性的重組核酸、其功能片段和/或能夠在嚴(yán)謹(jǐn)條件下與這類核酸雜交的核酸，和/或 (?)編碼與任意SEQ ID N0.2、4、6或8具有至少60%同一性的蛋白質(zhì)、其功能片段、其直向同源物和/或旁系同源物的重組核酸； 有效連接至 (b)啟動(dòng)子，和 (c)轉(zhuǎn)錄終止序列。
6.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中乙烯信號(hào)傳遞通路是通過抑制CTRUEBF1和/或EBF2蛋白的表達(dá)誘發(fā)的。
7.權(quán)利要求6的方法，其中CTRUEBF1和/或EBF2蛋白是由 ⑴與任意SEQ ID N0.9、11、13、15、17、19、21或23具有至少60%同一性的重組核酸、其功能片段，和/或能夠在嚴(yán)謹(jǐn)條件下與這類核酸雜交的重組核酸，和/或由 (ii)編碼與任意SEQID N0.10、12、14、16、18、20、22或24具有至少60%同一性的蛋白質(zhì)、其功能片段，其直向同源物和/或旁系同源物的重組核酸， 編碼的。
8.權(quán)利要求6或7的方法， 其包含 a)提供包含與靶CTRUEBF1和/或EBF2基因的至少19個(gè)連續(xù)的核苷酸基本相同和/或基本互補(bǔ)的靶核酸的重組核酸， b)將所述重組核酸導(dǎo)入植物和/或其部分中。
9.權(quán)利要求8的方法，其中一旦表達(dá)重組核酸，所述重組核酸能夠在植物、其部分中提供dsRNA和/或siRNA和/或miRNA，其中dsRNA和/或siRNA和/或miRNA的至少19個(gè)連續(xù)的核苷酸與靶CTRl、EBFl和/或EBF2基因基本互補(bǔ)。
10.權(quán)利要求6至9的任一項(xiàng)的方法，其中所述重組核酸包含 在植物細(xì)胞中有功能的啟動(dòng)子，有效連接至 靶核酸，所述靶核酸與靶CTRl、EBFl和/或EBF2基因的至少19個(gè)連續(xù)的核苷酸基本相同和/或基本互補(bǔ)，并且當(dāng)其轉(zhuǎn)錄時(shí)，生成包含第一鏈和第二鏈的RNA，所述第一鏈具有與靶CTRl、EBFl和/或EBF2基因的至少19個(gè)連續(xù)的核苷酸基本互補(bǔ)的序列，所述第二鏈具有與第一鏈或其部分基本互補(bǔ)的序列，和終止子調(diào)控序列。
11.權(quán)利要求6至9的任一項(xiàng)的方法，其中所述重組核酸包含: 在植物細(xì)胞中有功能的啟動(dòng)子，有效連接至 靶核酸，當(dāng)所述靶核酸轉(zhuǎn)錄時(shí)，生成包含第一鏈的RNA，所述第一鏈具有與靶CTR1、EBFl和/或EBF2基因的至少19個(gè)連續(xù)的核苷酸基本相同或基本互補(bǔ)的序列，和終止子調(diào)控序列。
12.包含重組核酸的重組載體構(gòu)建體,所述重組核酸包含在植物細(xì)胞中有功能的啟動(dòng)子，與靶核酸有效連接，所述靶核酸與靶CTRl、EBF1和/或EBF2基因的至少19個(gè)連續(xù)的核昔酸基本相同和/或基本互補(bǔ)，和 終止子調(diào)控序列。
13.權(quán)利要求12的重組載體構(gòu)建體，其包含 在植物細(xì)胞中有功能的啟動(dòng)子，有效連接至 靶核酸，所述靶核酸與靶CTRl、EBFl和/或EBF2基因的至少19個(gè)連續(xù)的核苷酸基本相同和/或基本互補(bǔ)，并且當(dāng)其轉(zhuǎn)錄時(shí)，生成包含第一鏈和第二鏈的RNA，所述第一鏈具有與靶CTR1、EBFl和/或EBF2基因的至少19個(gè)連續(xù)的核苷酸基本互補(bǔ)的序列，所述第二鏈具有與第一鏈或其部分基本互補(bǔ)的序列，和終止子調(diào)控序列。
14.權(quán)利要求12的重組載體構(gòu)建體，其包含 在植物細(xì)胞中有功能的啟動(dòng)子，與靶核酸有效連接，當(dāng)其轉(zhuǎn)錄時(shí)，所述靶核酸生成具有與靶CTRUEBF1和/或EBF2基因的至少19個(gè)連續(xù)的核苷酸基本互補(bǔ)或基本相同的序列的RNA，和 終止子調(diào)控序列。
15.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中乙烯信號(hào)傳遞通路是由應(yīng)用權(quán)利要求2至4的任一項(xiàng)的方法與權(quán)利要求6至11的任一項(xiàng)的方法組合而誘發(fā)的。
16.根據(jù)權(quán)利要求1至4或6至11或15的方法，或權(quán)利要求5或12至14的重組載體構(gòu)建體，其中啟動(dòng)子是組成型的、病原體誘導(dǎo)型的啟動(dòng)子、葉肉特異性啟動(dòng)子和/或表皮特異性啟動(dòng)子。
17.用根據(jù)權(quán)利要求5或12至14的重組載體構(gòu)建體轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)基因植物、轉(zhuǎn)基因植物部分或轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞。
18.用于生產(chǎn)具有增加的Phacosporacea抗性的轉(zhuǎn)基因植物的方法,包括:(a)將根據(jù)權(quán)利要求5或12至14的重組載體構(gòu)建體導(dǎo)入到植物和/或植物細(xì)胞中，和 (B)從植物細(xì)胞再生植物。
19.權(quán)利要求1至4或6至11或15或18的任一項(xiàng)的方法,其中Phacosporacea抗性是抗大豆銹菌的抗性。
20.權(quán)利要求19的方法,其中大豆銹菌是山馬蟥層銹菌(Phakopsorameibomiae)和/或豆薯層鎊菌(Phakopsora pachyrhizi) ?
21.權(quán)利要求1至4或6至11或15或18的方法，或根據(jù)權(quán)利要求17的植物，其中植物選自菜豆、大豆、豌豆、三葉草、葛、紫花苜蓿、小扁豆、羽扇豆、野豌豆和/或落花生。
22.權(quán)利要求21的方法或根據(jù)權(quán)利要求17的植物，其中植物是大豆。
23.根據(jù)權(quán)利要求5或12至14的任一項(xiàng)的重組載體構(gòu)建體的用途，其用于轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞以提供Phacosporacea抗性植物。
24.權(quán)利要求23的用途，其中真菌抗性是抗大豆銹菌的抗性。
25.權(quán)利要求24的用途，其中大豆銹菌是山馬蟥層銹菌和/或豆薯層銹菌。
【文檔編號(hào)】A01H5/00GK103620037SQ201280032245
【公開日】2014年3月5日 申請日期:2012年6月25日 優(yōu)先權(quán)日:2011年6月27日
【發(fā)明者】H·舒爾塞斯 申請人:巴斯夫植物科學(xué)有限公司