一種抗氧化劑及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明一種抗氧化劑及其應(yīng)用涉及小球藻多糖在制備植物綠色農(nóng)藥和食品添加劑中的應(yīng)用。所述小球藻多糖是從小球藻水不溶部分（藻渣）經(jīng)酶解、脫蛋白和醇沉后得到的一組分子量在10.6~13.6kDa的多糖，其單糖組成主要為葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖、巖藻糖、鼠李糖。所述小球藻多糖可明顯提高植物細(xì)胞抗氧化酶（SOD、POD和CAT）以及體外羥自由基清除率、還原力、DPPH清除率等活性，可作為一種植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑和天然食品添加劑。
【專利說(shuō)明】一種抗氧化劑及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及到多糖的生物活性研究，詳細(xì)研究了一種海洋藻類中水不溶性多糖的生物活性及其應(yīng)用，屬于糖生物學(xué)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]已有研究結(jié)果表明生物與非生物脅迫可引起植物體內(nèi)抗逆反應(yīng)，如抗病、抗寒、抗旱和抗氧化等。其中，氧化反應(yīng)在高等植物中主要表現(xiàn)在活性氧ROS(reactive oxygenspecies)的產(chǎn)生，主要種類有超氧陰離子(02_)、單線態(tài)氧(1O2)、羥基自由基(H0.)、過(guò)氧化氫(H2O2)等。這些自然狀態(tài)下的ROS是植物生長(zhǎng)發(fā)育以及對(duì)環(huán)境脅迫的第二信使，可以引起細(xì)胞保護(hù)反應(yīng)、種子萌發(fā)、根向重力性和氣孔關(guān)閉等生理效應(yīng)。而過(guò)量的ROS能夠?qū)е碌鞍踪|(zhì)、DNA以及脂類的氧化傷害，并最終引起細(xì)胞死亡。抗氧化酶[主要包括超氧化物歧化酶(S0D)、過(guò)氧化物酶(POD)和過(guò)氧化氫酶(CAT)]是植物體內(nèi)主要的ROS清除系統(tǒng)，可將過(guò)量的ROS最終降解為水，起到保護(hù)機(jī)體正常生理功能的作用。
[0003]已有的天然抗氧化劑主要為維生素類物質(zhì)，如維生素A/C/E，類胡蘿卜素等，但其價(jià)格較貴，應(yīng)用范圍受限；而人工合成的抗氧化劑，雖然價(jià)格有優(yōu)勢(shì)但在食品、藥品、飼料、綠色農(nóng)藥等方面應(yīng)用時(shí)存在安全隱患。因此，尋找一種具有天然、無(wú)毒、價(jià)格低廉的抗氧化劑作為一種添加劑或佐劑，并應(yīng)用于綠色農(nóng)藥、食品添加劑等領(lǐng)域，有助于實(shí)現(xiàn)生態(tài)綠色環(huán)保、食品安全無(wú)毒的社會(huì)發(fā)展目標(biāo)。
[0004]小球藻(Chlorella)是單細(xì)胞藻類，是一類普生性單細(xì)胞綠藻，其種類多，生態(tài)分布廣，易于培養(yǎng)，生長(zhǎng)速度快，含有大量的生物活性物質(zhì)，如碳水化合物、蛋白質(zhì)和維生素等。此外，小球藻具有強(qiáng)大的產(chǎn)油脂能力，目前作為一種能源微藻受到了廣泛的關(guān)注。已有的研究表明，小球藻水溶性多糖具有良好的抗氧化和抗衰老作用，而對(duì)于小球藻產(chǎn)油后殘余藻渣中多糖的相關(guān)研究尚未見報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的在于小球藻藻渣多糖抗氧化活性的開發(fā)及其應(yīng)用，可為食品行業(yè)和種植業(yè)提供一種經(jīng)濟(jì)、有效的抗氧化劑、和生物農(nóng)藥，同時(shí)有利于微藻多糖的高值化利用。
[0006]為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為:
[0007]1.所述小球藻藻渣多糖經(jīng)酶解得到，采用氣相色譜法測(cè)定其主要由鼠李糖、巖藻糖、葡萄糖和半乳糖等7種單糖組成，摩爾比為Rha:Fuc:Arb:Xyl:Man:Glc:Gal=7.03:1
5.23:6.34:1:3.276:17.23:16.54 ;采用高效凝膠過(guò)濾色譜法測(cè)得其相對(duì)分子質(zhì)量范圍是:10.6~13.6kDa。
[0008]2.所述細(xì)胞抗氧化活性以小麥、水稻、擬南芥等植株為研究對(duì)象，測(cè)定小球藻藻渣多糖對(duì)不同植株及同一植株不同組織中抗氧化酶(SOD、POD和CAT)活性的影響，發(fā)現(xiàn)該多糖能明顯提高小麥和擬南芥兩種植物細(xì)胞的抗氧化活性，在0-200 μ g -mr1范圍濃度內(nèi)，小麥S0D、P0D和CAT三種酶活較對(duì)照組提高5%~30% ;而擬南芥中三種酶活分別提高5~25%，具有良好的體內(nèi)抗氧化效果。
[0009]3.所述的體外抗氧化活性，是以體外羥自由基清除率、還原力、DPPH清除率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，考察了不同濃度小球藻藻渣多糖的抗氧化效果，篩選了最佳作用濃度，實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn):在該多糖體外抗氧化效果呈現(xiàn)濃度依賴型，羥自由基清除率和DPPH清除率在5%~70%范圍內(nèi)，還原力(0D700nm)在0.θ1-1.70之間，具有良好的體外抗氧化效果。
[0010]4.所述應(yīng)用其特征在于:小球藻藻渣多糖具有良好的植物細(xì)胞抗氧化活性，能提高植物體內(nèi)抗氧化酶活性，從而改變植物體內(nèi)ROS的含量。而已有的研究發(fā)現(xiàn)，ROS在植物體內(nèi)可作為第二信使，對(duì)植物的生長(zhǎng)、發(fā)育以及對(duì)環(huán)境脅迫的反應(yīng)起重要作用。因此，可作為一種有效的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑。此外，小球藻藻渣多糖具有良好的體外抗氧化活性，能防止食品中油脂自動(dòng)氧化酸敗和食品酶促氧化褐變等，還可用作天然食品添加劑。
[0011]本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn):
[0012]I本發(fā)明表明小球藻藻渣多糖具有抗氧化活性，是小球藻的主要功效成分，具有多種生物活性，來(lái)源天然，無(wú)副作用，可開發(fā)成植物綠色農(nóng)藥或食品添加劑。
[0013]2小球藻水不溶性多糖原料來(lái)源廣泛、價(jià)格低廉，本發(fā)明有利于小球藻藻渣的綜合利用并提高其附加值。
[0014]3本發(fā)明所述技術(shù)操作簡(jiǎn)單，只需將小球藻藻渣多糖與肥料或食品按一定比例混合，就可以起到增強(qiáng)抗氧化作用。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0015]圖1不同濃度小球藻藻渣多糖對(duì)小麥、擬南芥SOD活性的影響；*表示處理組與對(duì)照組在Ρ〈0.05水平顯著差異；
[0016]圖2不同濃度小球藻藻渣多糖對(duì)還原力的影響；
[0017]圖3不同濃度小球藻藻渣多糖對(duì)羥自由基清除能力的影響；
[0018]圖4不同濃度小球藻藻渣多糖對(duì)DPPH清除能力的影響。
【具體實(shí)施方式】
[0019]本發(fā)明采用的小球藻藻渣多糖是由小球藻水不溶部分經(jīng)酶法提取得到的一組多糖。
[0020]采用中性蛋白酶A對(duì)藻渣(5.0g)進(jìn)行水不溶性多糖提取，提取條件為:底物濃度為10%，酶添加量1%，溫度55°C，提取時(shí)間24h ；
[0021]將上述提取液在50°C,轉(zhuǎn)速60rpm的條件下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至原溶液體積的1/4,加入5倍體積95%乙醇，靜置過(guò)夜，然后5000rpm離心15min，得到沉淀部分，最后直接進(jìn)行干燥，得到小球藻水不溶性多糖固體。
[0022]采用高效凝膠過(guò)濾色譜法測(cè)定該多糖相對(duì)分子質(zhì)量為10.6^13.6kDa，采用氣相色譜法測(cè)定其單糖組成及摩爾比為 Rha:Fuc:Arb:Xyl:Man:Glc:Gal=7.03:15.23:6.34:1:3.276:17.23:16.54，并通過(guò)植物細(xì)胞抗氧化實(shí)驗(yàn)和體外抗氧化實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)小球藻多糖具有抗
氧化活性。
[0023]本發(fā)明通過(guò)測(cè)定小麥細(xì)胞抗氧化酶(SOD、POD和CAT)和體外羥自由基清除率、還原力、DPPH清除率等活性來(lái)評(píng)價(jià)該多糖抗氧化活性，從而為該多糖在方面的應(yīng)用提供一定依據(jù)。
[0024]所述細(xì)胞抗氧化活性以小麥、水稻、擬南芥等植株為研究對(duì)象，測(cè)定小球藻藻渣多糖對(duì)不同植株及同一植株不同組織中抗氧化酶(SOD、POD和CAT)活性的影響，發(fā)現(xiàn)該多糖能明顯提高小麥和擬南芥兩種植物細(xì)胞的抗氧化活性，在0-200 μ g -mr1范圍濃度內(nèi)，小麥SOD,POD和CAT三種酶活較對(duì)照組提高5%~30% ;而擬南芥中三種酶活分別提高5~25%，具有良好的體內(nèi)抗氧化效果。
[0025]所述的體外抗氧化活性，是以體外羥自由基清除率、還原力、DPPH清除率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，考察了不同濃度小球藻藻渣多糖的抗氧化效果，篩選了最佳作用濃度，實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn):在該多糖體外抗氧化效果呈現(xiàn)濃度依賴型，羥自由基清除率和DPPH清除率在5%~70%范圍內(nèi)，還原力(0D700nm)在0.01~1.70之間，具有良好的體外抗氧化效果。
[0026]實(shí)施例1植物細(xì)胞抗氧化實(shí)驗(yàn)一
[0027](1)植株浸種實(shí)驗(yàn):采用小麥西農(nóng)“9871”進(jìn)行抗氧化實(shí)驗(yàn):
[0028]a)分別將種粒飽滿，大小均勻的小麥種子包在紗布中，流水沖洗lOmin，可以除掉種子表面的雜質(zhì)和阻止發(fā)芽的物質(zhì)。
[0029]b)將種子浸入質(zhì)量濃度75%乙醇中浸泡5min，除掉種子表面的蛋白質(zhì)、脂質(zhì)，同時(shí)對(duì)種子表面進(jìn)行消毒防止霉菌的污染。
[0030]c)以5，50，200 μ g.mL—1的小球藻藻渣多糖溶液、去離子水分別對(duì)消毒好的種子進(jìn)行浸種處理，室溫下浸泡10h。
[0031]d)將浸中后膨脹的種子放入下鋪2層濾紙的培養(yǎng)皿中進(jìn)行培養(yǎng)，每個(gè)培養(yǎng)皿中放大約30粒種子，每個(gè)濃度做三個(gè)平行，培養(yǎng)lid。培養(yǎng)條件:培養(yǎng)溫度25°C，光照強(qiáng)度2000-25001ux，光暗比 12h:12h。
[0032](2)小麥細(xì)胞抗氧化酶制備:將每個(gè)處理的小麥植株，隨機(jī)選取15株并用去離子水沖洗干凈，吸水紙吸干表面水分，稱取葉面中段約0.5g樣品，剪碎，于研缽中加入預(yù)冷的3mL0.05mol/L(pH7.8)磷酸鈉緩沖液(PBS)，冰浴研磨呈勻漿，轉(zhuǎn)入到IOmL刻度離心管中，定容到5mL,在lOOOOr/mirTHO下離心20min,取上清液,分成3份,于_2(TC保存?zhèn)溆谩?br> [0033](3)酶活性的測(cè)定:S0D活性采用氯化硝基四氮唑藍(lán)(NBT)光化學(xué)還原法進(jìn)行測(cè)定，以抑制NBT光化學(xué)還原的50%作為I個(gè)酶活力單位⑶，單位為U.g^Fff.；P0D活性采用愈創(chuàng)木酚-過(guò)氧化氫法進(jìn)行測(cè)定，以每分鐘0D470nm增加I為I個(gè)酶活力單位(U)，單位為U.g^Fff.；CAT活性采用過(guò)氧化氫分解法進(jìn)行測(cè)定，以每分鐘內(nèi)0D240nm減少I為I個(gè)酶活力單位(U)，單位為U.g^Fff.h-1。
[0034]實(shí)施例2植物細(xì)胞抗氧化實(shí)驗(yàn)二
[0035](1)植株噴施培養(yǎng):采用擬南芥進(jìn)行抗氧化實(shí)驗(yàn):
[0036]a)擬南芥種子從4°C冰箱取出后放入2ml離心管中加入無(wú)菌水；
[0037]b)然后栽種于土壤中，蓋上保鮮膜放入培養(yǎng)箱中(光暗比為12/12，溫度22±2。0。
[0038]c)大約4d萌發(fā)揭膜，21d左右可長(zhǎng)出2片真葉(與光照時(shí)間有關(guān))，在31、33、35d噴施3次濃度為O、5、50、200 μ g.πm-1試驗(yàn)多糖，第38d取樣并進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。
[0039](2)擬南芥細(xì)胞抗氧化酶制備:參照“小麥細(xì)胞抗氧化酶制備”。
[0040](3)酶活性的測(cè)定:同“植物細(xì)胞抗氧化實(shí)驗(yàn)一”中所述操作。[0041](4)結(jié)果:小球藻藻渣多糖對(duì)植物抗氧化酶的影響:從圖1可以看出與空白對(duì)照組相比，小球藻藻渣多糖對(duì)植物抗氧化酶有明顯影響，且對(duì)不同的植物作用效果不同:在濃度為50 μ g -mr1時(shí)對(duì)小麥SOD活性提高最大，達(dá)22.51% ;對(duì)擬南芥SOD活性呈現(xiàn)出濃度依賴性變化，在200 μ g.mL—1提高15.23% ；P0D和CAT測(cè)定數(shù)據(jù)未列出。
[0042]圖1不同濃度小球藻藻渣多糖對(duì)小麥、擬南芥SOD活性的影響；*表示處理組與對(duì)照組在P〈0.05水平顯著差異；
[0043]實(shí)施例3體外抗氧化實(shí)驗(yàn)
[0044](I)還原力測(cè)定:取一定濃度的小球藻藻渣多糖溶液ImL與ImL0.2mol.l-'ρΗΘ.6的磷酸鹽緩沖液混勻，然后加入ImL0.1%的鐵氰化鉀，在50°C的條件下水浴20min。反應(yīng)結(jié)束后急速冷卻，以lmllO%TCA終止反應(yīng)。取2ml此反應(yīng)液加2ml蒸餾水以及0.8ml0.l%FeCl3混勻，IOmin后測(cè)定混合液在700nm條件下的吸光值A(chǔ)。以Iml蒸餾水代替樣品做空白對(duì)照，以QOyg^mL-1Vc做陽(yáng)性對(duì)照。每個(gè)試樣作三個(gè)平行樣，取平均值。A7tltl越大，表明樣品的還原力越強(qiáng)。測(cè)定結(jié)果如圖2所示:圖2不同濃度小球藻藻渣多糖對(duì)還原力的影響；(2)羥自由基清除能力測(cè)定:取lmL9m mo I.L1FeSO4溶液、lmL9mmol.L—1水楊酸-乙醇溶液以及ImL 一定濃度樣品溶液于試管中混勻，然后再加入0.8mL8.8m mo I.T1H2O2啟動(dòng)反應(yīng)，將混合液置于37 °C反應(yīng)30min。以等體積蒸餾水代替樣品做空白對(duì)照，以等體積蒸餾水代替H2O2做樣品本底顏色的影響，同時(shí)以蒸餾水做參比，測(cè)定反應(yīng)液在510nm條件下的吸光值A(chǔ)s。以250 Ug^r1Vc代替樣品做陽(yáng)性對(duì)照。每個(gè)試樣作三個(gè)平行樣，取平均值。As越小，表明樣品的羥自由基能力越強(qiáng)。測(cè)定結(jié)果如圖3所示:
[0045]
【權(quán)利要求】
1.一種抗氧化劑，其以小球藻水不溶性多糖為活性成份。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗氧化劑，其制備過(guò)程: 首先將小球藻進(jìn)行破壁，并用熱水提取法將其水溶性多糖進(jìn)行充分提取，并離心得到沉淀，然后利用水對(duì)該沉淀進(jìn)行反復(fù)清洗以去除殘余其中的可溶性多糖，再用中性蛋白酶和糖苷水解酶中的一種或二種以上對(duì)其進(jìn)行水不溶性多糖的提取，最后經(jīng)過(guò)濃縮、醇沉和冷凍干燥得到小球藻水不溶性多糖。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的抗氧化劑，其特征在于: 熱水提取小球藻水溶性多糖的過(guò)程，首先將小球藻進(jìn)行破壁，再用4(T90°C熱水提取小球藻中水溶性多糖，提取后100(T5000rpm離心1~3次，每次l(T20min，收集沉淀并用去離子水洗滌3次，烘干后得到小球藻水不溶性沉淀； 所述采用酶對(duì)水不溶性多糖的提取的過(guò)程，將上述沉淀與酶進(jìn)行混合，在酶與底物質(zhì)量比例為1:10~100 (m/m)，底物濃度為I~50%，加酶量(與底物量之比)為0.01~10% (m/m),溫度為4(T120°C，時(shí)間為0.5^24h的條件下進(jìn)行小球藻水不溶性多糖的提取，然后離心收集上清； 所述多糖提取液濃縮和醇沉的過(guò)程，將上述提取液在3(T60°C，轉(zhuǎn)速4(Tl20rpm的條件下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至原溶液體積的1/3~1/8，加入濃縮液3、倍體積95%乙醇，5000rpm離心15min，得到沉淀部分，最后直接進(jìn)行干燥，得到小球藻水不溶性多糖固體。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的抗氧化劑，其特征在于: 小球藻與水的質(zhì)量比1:5~50(m/v)。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于: 所述糖苷水解酶為纖維素酶、果膠酶中的一種或二種以上。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗氧化劑，其特征在于: 所述小球藻水不溶性多糖采用氣相色譜法測(cè)定:其由鼠李糖、巖藻糖、葡萄糖和半乳糖7 種單糖組成，摩爾比為 Rha:Fuc:Arb:Xyl:Man:Glc:Gal=7.03:15.23:6.34:1:3.276:17.23:16.54 ;采用高效凝膠過(guò)濾色譜法測(cè)得其相對(duì)分子質(zhì)量范圍是:10.6^13.6kDa。
7.—種權(quán)利要求1所述抗氧化劑的應(yīng)用，其特征在于: 所述抗氧化劑可作為植物生物農(nóng)藥或食品添加劑。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的應(yīng)用，其特征在于: 小球藻藻渣多糖具有良好的植物細(xì)胞抗氧化活性，能提高植物體內(nèi)抗氧化酶活性，從而改變植物體內(nèi)ROS的含量；而已有的研究發(fā)現(xiàn)，ROS在植物體內(nèi)可作為第二信使，對(duì)植物的生長(zhǎng)、發(fā)育以及對(duì)環(huán)境脅迫的反應(yīng)起重要作用；因此，可作為一種有效的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑； 此外，小球藻藻渣多糖具有良好的體外抗氧化活性，能防止食品中油脂自動(dòng)氧化酸敗和食品酶促氧化褐變，還可用作天然食品添加劑。
【文檔編號(hào)】A01P21/00GK103875667SQ201210562694
【公開日】2014年6月25日 申請(qǐng)日期:2012年12月21日 優(yōu)先權(quán)日:2012年12月21日
【發(fā)明者】杜昱光, 陳瑋, 劉啟順, 彭強(qiáng), 孟彥羽, 拓亞琴 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所