專利名稱：韭菜組織培養(yǎng)快繁的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及植物組織培養(yǎng)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及利用根外植體進(jìn)行韭菜組織培養(yǎng)高效快繁的方法。
背景技術(shù)：
韭菜C477i應(yīng)tuberosum Rottl. Ex Spreng)別名草鐘乳、起陽草,屬百合科蔥屬，是一種多年生的宿根草本植物，主要以葉片、假莖供食，具有一種特殊而且強(qiáng)烈的韭香氣味，為我國(guó)特有的蔬菜品種。韭菜含豐富的維生素C、碳水化合物及硫、磷、鐵等礦物質(zhì)。 韭菜不僅營(yíng)養(yǎng)豐富，而且具有多方面的保健功能，其獨(dú)特的揮發(fā)性芳香物，可促進(jìn)食欲；所含蒜素、硫化物對(duì)人體有興奮作用，在腸道中具殺菌效果；富含的胡蘿卜素，對(duì)夜盲癥和皮膚粗裂有療效；而膳食纖維能明顯促進(jìn)消化、預(yù)防癌癥。韭菜的葉、根、種子均可入藥，祖國(guó)醫(yī)學(xué)認(rèn)為韭菜性溫、昧辛、入肝；可溫中、下氣、補(bǔ)虛、調(diào)和脾胃、益陽、散瘀、解毒。
韭菜種質(zhì)資源豐富，栽培面積大，年產(chǎn)量高，在蔬菜生產(chǎn)和供應(yīng)中占有很重要的位置，尤其是反季節(jié)韭菜，栽培面積逐年上升。隨著栽培技術(shù)和人們生活水平的提高，韭菜的標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)及品質(zhì)優(yōu)化將越來越重要。現(xiàn)在韭菜的繁殖方法主要有兩種一種是種子繁殖法，播種當(dāng)年植株進(jìn)行營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)，第二年秋季才抽薹、開花、收獲種子，但植株積累養(yǎng)分較少，種植時(shí)間短、分蘗少，收獲種子量較少，3 4年進(jìn)入植株旺盛生長(zhǎng)期，采種量有所提高， 而五年后植株逐漸進(jìn)入衰老期，抽薹減少、花序變小、產(chǎn)種量降低。第二種是分根繁殖法，即用韭菜的分蘗苗進(jìn)行擴(kuò)繁，韭菜單株平均年分蘗4 5個(gè)。一個(gè)新品種選育成功后，需要繁殖大量種子進(jìn)行大面積生產(chǎn)，而上述兩種方法的繁殖速度均比較緩慢，這就影響到新品種培育的速度和生產(chǎn)。因此，利用現(xiàn)代生物技術(shù)手段，在較短時(shí)間內(nèi)繁殖大量材料，縮短優(yōu)良品種的擴(kuò)繁時(shí)間，獲得優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)的韭菜新品種，是育種的主要目標(biāo)。
隨著轉(zhuǎn)基因育種技術(shù)的逐步發(fā)展和完善，蔥蒜類植物的大蒜和洋蔥等植物的遺傳轉(zhuǎn)化系統(tǒng)已經(jīng)建立，而且還獲得了抗蟲的轉(zhuǎn)基因植物。在韭菜方面，雖然有成功建立轉(zhuǎn)化系統(tǒng)的報(bào)道，但是還沒有成功轉(zhuǎn)化的實(shí)例。而前述的蔥蒜類植物的遺傳轉(zhuǎn)化均是采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方式取得成功，而該方法的建立需要高效的 再生系統(tǒng)作為前提，因此也需要進(jìn)行韭菜的再生研究。目前在韭菜的組織培養(yǎng)研究中，通過莖尖、未成熟胚和未受精的子房均可進(jìn)行韭菜的離體繁殖，但是效率不是很高。在根外植體研究方面，Shuto和張松等均通過根尖誘導(dǎo)愈傷組織，進(jìn)而分化為植株，其后也有一些相關(guān)的報(bào)道，但是在激素配方的使用方面相差很大，研究結(jié)果不系統(tǒng)，可以看到叢生芽的照片，但是沒有帶有假莖的單個(gè)植株的照片。 因此進(jìn)行再生體系的完善還需要進(jìn)一步進(jìn)行。
植物組織培養(yǎng)具有繁殖能力強(qiáng)、繁育速度快、生產(chǎn)周期短，重復(fù)性強(qiáng)，且周年循環(huán)生產(chǎn)，不受季節(jié)限制，節(jié)約繁殖材料、利于工廠化生產(chǎn)和自動(dòng)化控制等特點(diǎn)。因此，研究韭菜的組織培養(yǎng)再生技術(shù)也非常必要。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，完善組織培養(yǎng)相關(guān)因素，提供一種韭菜組織培養(yǎng)快繁的方法，采用該方法縮短韭菜優(yōu)良品種的擴(kuò)繁時(shí)間，加速了優(yōu)良品種的推廣，還可以得到無菌優(yōu)質(zhì)的韭菜幼苗，為豐產(chǎn)豐收和通過遺傳轉(zhuǎn)化進(jìn)行品種改良奠定了基礎(chǔ)。
本發(fā)明的目的是通過如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的。
本發(fā)明的韭菜組織培養(yǎng)高效快繁的方法，步驟如下(1)將韭菜種子沖洗干凈，在75%乙醇中消毒30S，用無菌水沖洗3-5次，再在含O.1 %升萊和O.1 % Tween-20的混合溶液中消毒10 min,用無菌水沖洗3_5次,備用；(2)將消毒后種子接種在1/2MS固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，在24-26°C黑暗培養(yǎng)2天后，轉(zhuǎn)移到24-26°C、光照度為1500-25001x、光照時(shí)間及周期為光照培養(yǎng)16h、黑暗培養(yǎng)8h的環(huán)境中培養(yǎng)5-7天，獲得無菌胚根，經(jīng)過7-10天培養(yǎng)，無菌胚根達(dá)到10_左右長(zhǎng)；(3)在無菌條件下將(2)培養(yǎng)的無菌胚根切取1-2mm的胚根尖，接種到MS+ 2 mg/L 6-BA + I mg/L NAA的培養(yǎng)基上,誘導(dǎo)形成愈傷組織,培養(yǎng)溫度、光照強(qiáng)度和光周期與(2)相同，培養(yǎng)13-15天，在相同培養(yǎng)基上轉(zhuǎn)接一次，在相同條件下繼續(xù)培養(yǎng)14-16天，愈·傷組織的直徑達(dá)到5mm左右；(4)將(3)形成的愈傷組織轉(zhuǎn)接到MS+1 mg/L 6-BA + O. 5 mg/L NAA + O. 5 mg/L KT 的培養(yǎng)基上，促進(jìn)不定芽分化，在與(2)相同的培養(yǎng)條件下培養(yǎng)9-11天時(shí)可見明顯的不定芽，28-30天不定芽生長(zhǎng)至3cm左右高度；(5)將(4)培養(yǎng)的含不定芽的愈傷組織切成盡可能含較少芽體的小塊，接種于MS+1 mg/L GA + O. 5 mg/L KT的培養(yǎng)基中，使不定芽伸長(zhǎng)，培養(yǎng)溫度、光照強(qiáng)度和光周期與(2)相同，培養(yǎng)20天后韭菜的芽體基部形成鱗莖，成為易于從愈傷組織分離的獨(dú)立的韭菜苗；(6)將(5)培養(yǎng)的獨(dú)立韭菜苗轉(zhuǎn)移到1/2MS +0.2 mg/L IAA的生根培養(yǎng)基中培養(yǎng)生根，在24-26°C、光照度為1500-25001x、光照時(shí)間及周期為光照培養(yǎng)16h、黑暗培養(yǎng)8h的條件下，培養(yǎng)15-20天韭菜苗生根數(shù)達(dá)到5-7條，根長(zhǎng)達(dá)到2cm左右；(7)將(6)培養(yǎng)的生根組培苗在20-25°C的組培環(huán)境中敞開瓶口煉苗2天后，移植到帶蓋的穴盤中，等植株完全成活后逐漸地移除穴盤的蓋子，6-7天后可完全移除穴盤的蓋子， 生長(zhǎng)到IOcm左右高度可移栽到土壤中進(jìn)行栽培。
所述的MS固體培養(yǎng)基配方包括MS基礎(chǔ)配方的無機(jī)與有機(jī)營(yíng)養(yǎng)成分、MS基礎(chǔ)配方質(zhì)量3%的蔗糖和O. 65%-0. 75%的瓊脂粉。
所述的1/2 MS培養(yǎng)基即將MS基礎(chǔ)配方的大量無機(jī)營(yíng)養(yǎng)成分減半。
所述的各種激素的名稱6_BA是6-節(jié)氨基嘌呤(6-benzylaminopurine), KT是激動(dòng)素(Kinetin),NAA 是萘乙酸(Naplylene acetic acid),GA 是赤霉素(gibberellin), IAA 是口引哚乙酸(Indole-3-acetic acid)。
培養(yǎng)基配制后加入不同種類及比例的植物激素，用1.0 M NaOH調(diào)節(jié)pH到5.8， 121°C高壓滅菌20 min，凝固后備用。
本發(fā)明的有益效果(I)本發(fā)明應(yīng)用韭菜胚根作為外植體，不僅節(jié)約外植體得到的時(shí)間，而且形態(tài)一致，更重要的是愈傷組織誘導(dǎo)率得到很大提高。試驗(yàn)證明，從韭菜種子得到的胚根，胚根尖飽滿、可以明顯區(qū)分其分生組織，愈傷組織的誘導(dǎo)率達(dá)到80%以上，比現(xiàn)有技術(shù)采用根系根尖愈傷組織的誘導(dǎo)率提高了 20%以上；芽誘導(dǎo)率達(dá)到73%，比根系根尖提聞了 30%左右。
(2)本發(fā)明經(jīng)過韭菜不定芽伸長(zhǎng)這一過程，不定芽形成鱗莖的速度加快，進(jìn)而形成獨(dú)立植株，可以很明顯與愈傷組織分離，取下獨(dú)立的韭菜苗進(jìn)行生根；而現(xiàn)有技術(shù)只進(jìn)行到不定芽分化后，沒有形成帶有假莖的單獨(dú)的不定芽，難以生根，只能將含有多個(gè)不定芽的愈傷組織塊一起生根，這樣不易獲得獨(dú)立的植株，因此，繁殖系數(shù)較低、成活率也低。本發(fā)明方法較現(xiàn)有技術(shù)的繁殖系數(shù)和成活率分別提高了 15%和10%以上。
(3)本發(fā)明將組培生根苗移栽到栽培基質(zhì)時(shí)，先在組培環(huán)境中敞開瓶口煉苗兩天， 再將其移植到可保持小環(huán)境濕度的帶蓋穴盤中，用6-7天的時(shí)間逐漸地移除穴盤的蓋子， 使組培生根苗往大棚移栽的成活率較現(xiàn)有技術(shù)又提高了 12%以上。
(4)本發(fā)明也為韭菜進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化提供了更加完善的方法，通過一系列的分化過程，從愈傷組織分化出不定芽，經(jīng)過伸長(zhǎng)生長(zhǎng)形成獨(dú)立的植株，進(jìn)而進(jìn)行生根。前人所做的遺傳轉(zhuǎn)化研究存在這樣的問題，轉(zhuǎn)化后的愈傷組織形成叢生芽，但并不是所有的芽體都為轉(zhuǎn)基因植株，生根過程可以進(jìn)一步的篩選轉(zhuǎn)化植株，叢生芽生根不能確定是否為真正的轉(zhuǎn)化體，可能增加假陽性的比例，也可能遺失真正的轉(zhuǎn)基因植株，通過形成單獨(dú)植株進(jìn)行生根就大大減少了這些現(xiàn)象。
具體實(shí)施方式
一種韭菜組織培養(yǎng)高效快繁的方法，首先按1/2 MS固體培養(yǎng)基配方稱取各種試劑，制備成培養(yǎng)基母液，用1.OM NaOH溶液調(diào)節(jié)培養(yǎng)基母液的pH到5. 8，然后在121°C高壓滅菌20 min，冷卻凝固。取韭菜種子沖洗干凈，在75%乙醇中消毒30 S，用無菌水沖洗3 次，再在O.1 %升萊和O.1 % Tween-20混合溶液中消毒10 min,用無菌水沖洗5次,然后將消毒后種子接種在上述培養(yǎng)基中培養(yǎng)，在24-26°C黑暗培養(yǎng)2天后，轉(zhuǎn)移到24-26°C、光照度為1500-25001x、光照時(shí)間及周期為光照培養(yǎng)16h、黑暗培養(yǎng)8h的環(huán)境中培養(yǎng)5_7天，獲得無菌胚根，繼續(xù)培養(yǎng)7-10天、無菌胚根達(dá)到IOmm左右長(zhǎng)。
按MS+ 2 mg/L 6-BA + I mg/L NAA的培養(yǎng)基配方稱取各種試劑,制備成培養(yǎng)基母液，用1. OM NaOH溶液調(diào)節(jié)培養(yǎng)基母液的pH到5. 8，然后在121°C高壓滅菌20 min，冷卻凝固。在無菌條件下將無菌胚根切取1-2 mm的胚根尖，接種到按MS+ 2 mg/L 6-BA + I mg/L NAA的培養(yǎng)基 上，誘導(dǎo)形成愈傷組織，培養(yǎng)溫度、光照強(qiáng)度和光周期同上，培養(yǎng)13-15天，在相同培養(yǎng)基上轉(zhuǎn)接一次，在相同條件下繼續(xù)培養(yǎng)14-16天，愈傷組織的直徑達(dá)到5_左右。
按MS+1 mg/L 6-BA + 0.5 mg/L NM + O. 5 mg/L KT的培養(yǎng)基配方稱取各種試劑， 制備成培養(yǎng)基母液，用1. OM NaOH溶液調(diào)節(jié)培養(yǎng)基母液的pH到5. 8，然后在121°C高壓滅菌 20 min,冷卻凝固。將愈傷組織轉(zhuǎn)接到該培養(yǎng)基上，促進(jìn)不定芽分化，培養(yǎng)條件同上，9-11天時(shí)可見明顯的不定芽，28-30天不定芽可長(zhǎng)至3 cm左右高。
按MS+1 mg/L GA + O. 5 mg/L KT的培養(yǎng)基配方稱取各種試劑，制備成培養(yǎng)基母液，用1. OM NaOH溶液調(diào)節(jié)培養(yǎng)基母液的pH到5. 8，然后在121°C高壓滅菌20 min，冷卻凝固。將不定芽愈傷組織切成盡可能含較少芽體的小塊，接種于該培養(yǎng)基上，使不定芽伸長(zhǎng)， 培養(yǎng)條件同上，20天后成為獨(dú)立的韭菜苗。
按1/2 MS +0.2 mg/L IAA的生根培養(yǎng)基配方稱取各種試劑，制備成培養(yǎng)基母液， 用1. OM NaOH溶液調(diào)節(jié)培養(yǎng)基母液的pH到5. 8，然后在121°C高壓滅菌20 min，冷卻凝固。 將獨(dú)立韭菜苗轉(zhuǎn)接到該培養(yǎng)基上培養(yǎng)生根，培養(yǎng)條件同上，15-20天韭菜苗生根數(shù)達(dá)到5-7條,根長(zhǎng)達(dá)到2cm左右。
將生根組培苗在20_25°C的組培環(huán)境中敞開瓶口煉苗2天后，移植到帶蓋的穴盤中，等植株完全成活后逐漸地移除穴盤的蓋子，6-7天后可完全移除穴盤的蓋子，生長(zhǎng)到 IOcm左右可移栽到土壤中進(jìn)行栽培。
按照本發(fā)明的韭菜組織培養(yǎng)快繁的方法，愈傷組織誘導(dǎo)率達(dá)到81. 4%，芽誘導(dǎo)率達(dá)到73. 3%。繁殖系數(shù)達(dá)到20以上，單株移栽的成活率 達(dá)到98%以上。
權(quán)利要求
1.韭菜組織培養(yǎng)高效快繁的方法，步驟如下 (1)將韭菜種子沖洗干凈，在75%乙醇中消毒30S，用無菌水沖洗3-5次，再在含O.1%升萊和O.1 % Tween-20的混合溶液中消毒10 min,用無菌水沖洗3_5次,備用； (2)將消毒后種子接種在1/2MS固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，在24-26°C黑暗培養(yǎng)2天后，轉(zhuǎn)移到24-26°C、光照度為1500-25001x、光照時(shí)間及周期為光照培養(yǎng)16h、黑暗培養(yǎng)8h的環(huán)境中培養(yǎng)5-7天，獲得無菌胚根，經(jīng)過7-10天培養(yǎng)，無菌胚根達(dá)到IOmm左右長(zhǎng)； (3)在無菌條件下將(2)培養(yǎng)的無菌胚根切取1-2mm的胚根尖，接種到MS+ 2 mg/L6-BA + I mg/L NAA的培養(yǎng)基上,誘導(dǎo)形成愈傷組織,培養(yǎng)溫度、光照強(qiáng)度和光周期與(2)相同，培養(yǎng)13-15天，在相同培養(yǎng)基上轉(zhuǎn)接一次，在相同條件下繼續(xù)培養(yǎng)14-16天，愈傷組織的直徑達(dá)到5mm左右； (4)將(3)形成的愈傷組織轉(zhuǎn)接到MS+1 mg/L 6-BA + O. 5 mg/L NAA + O. 5 mg/L KT的培養(yǎng)基上，促進(jìn)不定芽分化，在與(2)相同的培養(yǎng)條件下培養(yǎng)9-11天時(shí)可見明顯的不定芽，28-30天不定芽生長(zhǎng)至3cm左右高度； (5)將(4)培養(yǎng)的含不定芽的愈傷組織切成盡可能含較少芽體的小塊，接種于MS+1mg/L GA + O. 5 mg/L KT的培養(yǎng)基中，使不定芽伸長(zhǎng)，培養(yǎng)溫度、光照強(qiáng)度和光周期與(2)相同，培養(yǎng)20天后韭菜的芽體基部形成鱗莖，成為易于從愈傷組織分離的獨(dú)立的韭菜苗； (6)將(5)培養(yǎng)的獨(dú)立韭菜苗轉(zhuǎn)移到1/2MS +0.2 mg/L IAA的生根培養(yǎng)基中培養(yǎng)生根，在24-26°C、光照度為1500-25001x、光照時(shí)間及周期為光照培養(yǎng)16h、黑暗培養(yǎng)8h的條件下，培養(yǎng)15-20天韭菜苗生根數(shù)達(dá)到5-7條，根長(zhǎng)達(dá)到2cm左右； (7)將(6)培養(yǎng)的生根組培苗在20-25°C的組培環(huán)境中敞開瓶口煉苗2天后，移植到帶蓋的穴盤中，等植株完全成活后逐漸地移除穴盤的蓋子，6-7天后可完全移除穴盤的蓋子，生長(zhǎng)到IOcm左右高度可移栽到土壤中進(jìn)行栽培。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的韭菜組織培養(yǎng)高效快繁的方法，其特征在于，所述的MS固體培養(yǎng)基配方包括MS基礎(chǔ)配方的無機(jī)與有機(jī)營(yíng)養(yǎng)成分、MS基礎(chǔ)配方質(zhì)量3%的蔗糖和O.65%-0. 75%的瓊脂粉。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的韭菜組織培養(yǎng)高效快繁的方法，其特征在于，所述的1/2MS培養(yǎng)基即將MS基礎(chǔ)配方的大量無機(jī)營(yíng)養(yǎng)成分減半。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的韭菜組織培養(yǎng)高效快繁的方法，其特征在于，所述的6-BA 是 6-節(jié)氨基嘌呤(6-benzylaminopurine), KT 是激動(dòng)素(Kinetin), NAA 是萘乙酸(Naplylene acetic acid), GA 是赤霉素(gibberellin), IAA 是卩引哚乙酸(Indole-3-acetic acid)。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的韭菜組織培養(yǎng)高效快繁的方法，其特征在于，所述的培養(yǎng)基配制后加入不同種類及比例的植物激素，用1.0 M NaOH調(diào)節(jié)pH到5. 8，121 °C高壓滅菌20min,冷卻凝固。
全文摘要
本發(fā)明公開了韭菜組織培養(yǎng)快繁的方法，首先將消毒后種子接種在1/2MS固體培養(yǎng)基上，在一定條件下培養(yǎng)得無菌胚根，然后切取胚根尖，接種到MS+2mg/L6-BA+1mg/LNAA的培養(yǎng)基，誘導(dǎo)形成愈傷組織，再將愈傷組織轉(zhuǎn)接到MS+1mg/L6-BA+0.5mg/LNAA+0.5mg/LKT培養(yǎng)基，促進(jìn)不定芽分化，將帶不定芽的愈傷組織切成盡可能含較少芽體的小塊，接種于MS+1mg/LGA+0.5mg/LKT培養(yǎng)基上，使不定芽伸長(zhǎng)成為獨(dú)立的韭菜苗，最后將獨(dú)立韭菜苗轉(zhuǎn)接到1/2MS+0.2mg/LIAA培養(yǎng)基上培養(yǎng)生根，再經(jīng)煉苗后移栽到土壤。本發(fā)明方法較現(xiàn)有技術(shù)愈傷組織的誘導(dǎo)率提高了20%以上，芽誘導(dǎo)率提高了30%以上，繁殖系數(shù)和成活率分別提高了15%和10%以上。縮短了品種擴(kuò)繁時(shí)間，并為通過遺傳轉(zhuǎn)化進(jìn)行品種改良奠定了基礎(chǔ)。
文檔編號(hào)A01H4/00GK103039360SQ20121055428
公開日2013年4月17日 申請(qǐng)日期2012年12月19日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月19日
發(fā)明者李梅蘭, 高行英, 侯雷平, 王婷婷, 張學(xué)智 申請(qǐng)人:山西農(nóng)業(yè)大學(xué)