專(zhuān)利名稱(chēng)：中慢生根瘤菌kdrm185及其應(yīng)用的制作方法
中慢生根瘤菌KDRM185及其應(yīng)用技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明屬于應(yīng)用微生物學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一個(gè)從刺槐根瘤中分離的、有ACC脫氨酶能高效結(jié)瘤并促進(jìn)刺槐生長(zhǎng)的中慢生根瘤菌KDRM185及其應(yīng)用。該菌株已保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)，保藏號(hào)為CCTCC NO M 2012329，菌株名為中慢生根瘤菌 KDRM185。
背景技術(shù)：
自然界中有些原核微生物能合成固氮酶，在常溫常壓下，將空氣中的N2還原成 NH3。由固氮微生物固定的氮素約占地表化合態(tài)氮的65% - 70%，其中以根瘤菌與豆科植物共生體系固氮能力最強(qiáng)，占生物固氮量的65%以上。
利用根瘤菌與豆科植物共生固氮提高土壤肥力和農(nóng)作物產(chǎn)量是世界農(nóng)業(yè)的經(jīng)典經(jīng)驗(yàn)。如用豆科植物作綠肥，讓豆科與非豆科作物輪作、間作和套作。通過(guò)接種根瘤菌提高豆科作物的共生固氮效率和產(chǎn)量及土壤肥力已有100多年歷史，廣泛為各農(nóng)業(yè)大國(guó)所用， 是當(dāng)今發(fā)展可持續(xù)農(nóng)業(yè)的重要措施之一。20世紀(jì)80年代以來(lái)，我國(guó)糧食作物的種植面積不斷擴(kuò)大，豆科作物和豆科綠肥的種植面積不斷減少，化肥尤其是氮肥用量不斷增加。由于高水平化合態(tài)氮阻遏根瘤菌結(jié)瘤固氮，接種根瘤菌的結(jié)瘤固氮效應(yīng)在施用大量氮肥的農(nóng)田里急劇下降，根瘤菌接種事業(yè)的發(fā)展隨之被遏制。進(jìn)入21世紀(jì)，中國(guó)實(shí)施西部大開(kāi)發(fā)戰(zhàn)略和退耕還林還草工程，為擴(kuò)大豆科樹(shù)種、牧草的種植面積和加強(qiáng)與之相匹配的根瘤菌接種技術(shù)應(yīng)用提供了契機(jī)。
刺槐(TPoAiflia pseudoacacia L.)又稱(chēng)洋槐,是落葉喬木,高10 - 25米,木質(zhì)堅(jiān)硬，有彈性，抗磨損，是良好礦柱、枕木、建筑用材。刺槐原產(chǎn)美國(guó)東部，引種入歐洲后，于十九世紀(jì)末再?gòu)臍W洲引入中國(guó)。刺槐生長(zhǎng)快，分布越來(lái)越廣，一方面得益于刺槐適應(yīng)性強(qiáng)， 能在酸性土、中性土和含鹽量O. 3%以下的鹽堿土中生長(zhǎng)，有一定的耐旱能力；另一方面刺槐是豆科植物，可以與根瘤菌共生固氮而獲取生長(zhǎng)所必需的氮素，從而適于在貧瘠的土地生長(zhǎng)。種植刺槐的生態(tài)效應(yīng)，如保持水土、改良土壤等，也非常顯著。因此，刺槐成為全世界最重要的速生造林先鋒樹(shù)種之一，也是我國(guó)退耕還林工程的先鋒樹(shù)種。
隨著全球石油、煤炭和天然氣等礦物能源的日益枯竭，開(kāi)發(fā)利用可再生的生物質(zhì)能源以取代礦物能源越來(lái)越為世界各國(guó)政府所關(guān)注。目前，中國(guó)經(jīng)濟(jì)快速增長(zhǎng)，礦物能源消耗量急劇增長(zhǎng)，能源短缺問(wèn)題十分突出，生物質(zhì)能源等可再生能源的開(kāi)發(fā)和利用已成為實(shí)現(xiàn)可持續(xù)發(fā)展的關(guān)鍵。生物質(zhì)能源的開(kāi)發(fā)和利用的基點(diǎn)在于原料生產(chǎn)，原料成本占總成本的60% - 80%，原料成本決定產(chǎn)品的市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)力和利潤(rùn)。
林木是生物質(zhì)能源的重要原料。刺槐憑借其熱值高，生長(zhǎng)速度快和耐瘠抗逆等特點(diǎn)，成為重要的生物質(zhì)能源樹(shù)種。在貧瘠荒地上，用少施肥、低成本的投入產(chǎn)出高的成材生物量是目前我國(guó)刺槐能源林生產(chǎn)的瓶頸問(wèn)題。用高效結(jié)瘤固氮的根瘤菌接種刺槐苗，通過(guò)共生固氮使樹(shù)苗在貧瘠的土地上獲得氮素成材，可能提高刺槐造林效率和降低原料成本。 目前，一方面，在技術(shù)上，現(xiàn)代刺槐造林通過(guò)大規(guī)模苗圃育苗提高造林效率，為刺槐苗人工接種根瘤菌創(chuàng)造了便利條件。另一方面，限于技術(shù)和管理上的制約，我國(guó)的大規(guī)模造林還沒(méi)有向林業(yè)發(fā)達(dá)國(guó)家那樣實(shí)施以氮素為主的大規(guī)模施肥，但不施肥反而為刺槐與根瘤菌的共生固氮?jiǎng)?chuàng)造了沒(méi)有氮阻遏的條件，有利于提高共生固氮的效率。
刺槐適應(yīng)貧瘠土壤能力強(qiáng)的一個(gè)因素是它能與多個(gè)屬種的遺傳多樣的根瘤菌共生固氮。已發(fā)現(xiàn)能與刺槐結(jié)瘤的主要是中慢生根瘤菌屬的根瘤菌,還有中華根瘤菌屬(Sinorhizobia )、根瘤菌屬(/Sizobium )和慢生根瘤菌屬iBradyrhizobium ) 等屬的根瘤菌。根瘤菌與刺槐結(jié)瘤固氮的能力高低不一，利用接種根瘤菌促進(jìn)刺槐生長(zhǎng)需要選擇高效的根瘤菌菌株。通常篩選優(yōu)良根瘤菌菌株是通過(guò)從多個(gè)大且飽滿(mǎn)的刺槐根瘤中分離多個(gè)根瘤菌菌株，逐一接種刺槐苗，培養(yǎng)2個(gè)月或更長(zhǎng)時(shí)間后，檢測(cè)刺槐苗根部的結(jié)瘤數(shù)和苗的生物量；而要從數(shù)量較多的菌株中篩選出高效結(jié)瘤固氮的根瘤菌菌株要靠碰運(yùn)氣，篩選過(guò)程費(fèi)時(shí)費(fèi)力。
根瘤菌侵染豆科植物的根會(huì)引發(fā)植物產(chǎn)生植物激素乙烯及合成乙烯的前體 I-氨基環(huán)丙烷-I羧酸(ACC)，而乙烯會(huì)抑制根瘤菌結(jié)瘤和固氮。近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)有些根瘤菌有ACC脫氨酶。ACC脫氨酶能催化ACC脫氨基反應(yīng)，生成α-酮丁酸和NH3。根瘤菌侵染根時(shí)，根細(xì)胞合成ACC并釋放部分ACC到細(xì)胞外。有ACC脫氨酶的根瘤菌能吸收并降解植物細(xì)胞釋放的ACC，使根細(xì)胞中的ACC不斷釋放而減少，根細(xì)胞合成乙烯的量就相應(yīng)減少，從而降低了乙烯對(duì)根瘤菌侵染結(jié)瘤的抑制作用。如果把根瘤菌的ACC 脫氨酶結(jié)構(gòu)基因CacoSO敲除，根瘤菌的結(jié)瘤能力會(huì)顯著降低(Uchiumi等，Journal of Bacteriology 2004, 186:2439-2448);相反，如果向原本沒(méi)有acoS1的根瘤菌導(dǎo)入acoU, 那根瘤菌工程菌的結(jié)瘤率、占瘤率和固氮效率顯著高于野生型菌株(Ma等，Applied and Environmental Microbiology 2004, 70:5891-5897 ;Conforte 等，Journal of General and Applied Microbiology 2010, 56:331-338; Tittabutr 等，Systematic and Applied Microbiology 2008, 31:141-150; Nascimento Letters in Applied Microbiology 2012，55:15-21)。這表明有ACC脫氨酶的根瘤菌有強(qiáng)的侵染力，能高效結(jié)瘤。根瘤菌調(diào)控 ACC脫氨酶的機(jī)制比較復(fù)雜。研究已發(fā)現(xiàn)很多有^必的中慢生根瘤菌屬的根瘤菌在自由培養(yǎng)狀態(tài)下不表達(dá)aci/S，沒(méi)有ACC脫氨酶活性，但在根瘤中會(huì)高水平地表達(dá)aci/S，發(fā)揮ACC脫氨酶的作用(Ma 等，Antonie van Leeuwenhoek 2003, 83:285-291 ;Nukui 等，Applied and Environmental Microbiology 2006, 72:4964-4969 ;Nascimento 等，F(xiàn)EMS Microbiology Letters 2012, 336:26-37)。因此，篩選有ACC脫氨酶的根瘤菌時(shí)，如果檢測(cè)自由培養(yǎng)狀態(tài)下根瘤菌的ACC脫氨酶活性，對(duì)很多根瘤菌尤其是中慢生根瘤菌會(huì)失效，而用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)檢測(cè)根瘤菌有無(wú)aci/S基因會(huì)更有效。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題在于針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足而提供一個(gè)從刺槐根瘤中分離的、有ACC脫氨酶能高效結(jié)瘤并促進(jìn)刺槐生長(zhǎng)的中慢生根瘤菌KDRM185及其應(yīng)用。
本發(fā)明實(shí)現(xiàn)上述技術(shù)目的所采用的技術(shù)方案如下先用常規(guī)方法從刺槐根瘤中分離和純化根瘤菌，再?gòu)母鼍蚪M中擴(kuò)增基因， 對(duì)擴(kuò)增出的目標(biāo)片段測(cè)序確定菌株有無(wú)基因和ACC脫氨酶，再用有ACC脫氨酶的根瘤菌菌株接種刺槐幼苗，在接種3個(gè)月后檢測(cè)結(jié)瘤數(shù)、植株的株高、地徑和干重，選出能高效結(jié)瘤、顯著促進(jìn)刺槐苗生長(zhǎng)和提高植株生物量的根瘤菌菌株用于育苗造林。另一方面，擴(kuò)增有ACC脫氨酶根瘤菌的16S rRNA基因并測(cè)序，通過(guò)序列比對(duì)和系統(tǒng)發(fā)育分析16S rRNA基因序列確定菌株的分類(lèi)歸屬；同時(shí)對(duì)篩選出的有ACC脫氨酶的根瘤菌與同屬根瘤菌中已知有ACC脫氨酶菌株的aci/S基因序列進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，結(jié)合菌株16S rRNA基因和ac#基因的系統(tǒng)發(fā)育地位，最終確定得到新的有ACC脫氨酶的根瘤菌株系。
本發(fā)明提供的中慢生根瘤菌KDRM185于2012年9月7日保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)為CCTCC NO: M 2012329，保藏地址為中國(guó)，武漢，武漢大學(xué)，分類(lèi)命名為中慢生根瘤菌 KDRM185 ifesorAizoAia sp. KDRM185。
所述的中慢生根瘤菌KDRM185是從在湖北省谷城縣冷集鎮(zhèn)野生刺槐的根瘤中分離到的。
所述的中慢生根瘤菌KDRM185的細(xì)胞呈桿狀，革蘭氏染色陰性，在YMA培養(yǎng)基上生長(zhǎng)形成典型的根瘤菌菌落圓形、乳白色、隆起、邊緣整齊不蔓延、表面光滑且因有豐富的胞外多糖而粘稠、較濕潤(rùn)、稍透明；細(xì)胞的生長(zhǎng)需氧，在28°C和中性pH條件下生長(zhǎng)較快，在 YMA培養(yǎng)基上生長(zhǎng)3 - 5天形成菌落的直徑可達(dá)I - 2 _。
所述的中慢生根瘤菌KDRM185的16S rRNA基因序列(見(jiàn)SEQ ID NO: I)與中慢生根瘤菌屬典型種百脈根中慢生根瘤菌典型菌株ifesorAizoAiw loti ATCC 700743的16S rRNA基因序列一致性為98. 8%,與錦雞兒中慢生根瘤菌典型菌株ifesorAizoAia caraganae CCBAU 11299的16S rRNA基因序列一致性為99. 9%，在系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)上與后者的親緣關(guān)系也最近，處在同一節(jié)點(diǎn)分出的分支上(圖I)。因此，KDRM185菌株屬于中慢生根瘤菌屬，可能屬于錦雞兒中慢生根瘤菌種。
所述的中慢生根瘤菌KDRM185有ACC脫氨酶。它的ac必基因部分序列(見(jiàn)SEQ ID N0:2)與從生長(zhǎng)在甘肅省刺槐的根瘤中分離的紫穗槐中慢生根瘤菌ifesorAizMi amorphae CCNWGS0123的兩個(gè)拷貝acdS中的一今acdS的相應(yīng)序列(可在GenBank登錄號(hào) AGSNO1000010的序列中檢索到)相同，在系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)上處在同一分支，與中慢生根瘤菌屬中其他已知有ACC脫氨酶菌株的ac#序列差異較大(圖2)。這表明在進(jìn)化中屬于不同種的根瘤菌KDRM185和CCNWGS0123兩者之間可能發(fā)生過(guò)ac必基因的水平轉(zhuǎn)移或者通過(guò)水平轉(zhuǎn)移的方式從其他根瘤菌獲得了相同的ac#基因。
上述中慢生根瘤菌KDRM185的16S rRNA基因和ac必基因的分析結(jié)果結(jié)合表明 KDRM185的基因型不同于已知的中慢生根瘤菌。
所述中慢生根瘤菌KDRM185能在刺槐根上高效結(jié)瘤固氮，促進(jìn)刺槐苗生長(zhǎng)和成材。
本發(fā)明的有益效果本發(fā)明所述的中慢生根瘤菌KDRM185有ACC脫氨酶，能將ACC分解成α -酮丁酸和NH3, 降低植物細(xì)胞合成乙烯的水平，減輕乙烯對(duì)根瘤菌侵染的抑制作用，提高根瘤菌與刺槐的結(jié)瘤率和共生固氮的水平，為刺槐在不施肥的貧瘠荒地上生長(zhǎng)提供高水平的氮素，促進(jìn)刺槐苗生長(zhǎng),增加刺槐成材的生物量,從而用低成本的接種投入讓刺槐成材高產(chǎn),在刺槐育苗造林上發(fā)揮作用。


圖I為中慢生根瘤菌菌株KDRM185 (·)與中慢生根瘤菌屬)現(xiàn)有 25個(gè)種的典型菌株的16S rRNA基因的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。圖中■指示中慢生根瘤菌屬典型種百脈根中慢生根瘤菌典型菌株ifesorAizoAiw loti ATCC 700743, ▲指示錦雞兒中慢生根瘤菌典型菌株ifesorAizoAiw caraganae CCBAU 11299,菌株名后括號(hào)內(nèi)是16S rRNA基因核苷酸序列在GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中的登錄號(hào)。
圖2為中慢生根瘤菌菌株KDRM185 (·)和中慢生根瘤菌屬(ifesorAizoAia ) 中有ACC脫氨酶菌株的acoi 基因的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。圖中■指示紫穗槐中慢生根瘤菌 Mesorhi zobi um amorphae CCNWGS0123,菌株名后括號(hào)內(nèi)是acoS1基因核昔酸序列在GenBank 數(shù)據(jù)庫(kù)中的登錄號(hào)。
具體實(shí)施方式
I.根瘤菌的分離、純化和保存從在湖北省谷城縣冷集鎮(zhèn)野生刺槐中選擇健壯刺槐根上大且飽滿(mǎn)的根瘤，用剪刀小心將根瘤連部分根剪下，將同一刺槐根部獲得的5 - 15個(gè)根瘤放入裝有干燥變色硅膠并覆有脫脂棉的小管中。然后將采集的根瘤用無(wú)菌水充分浸泡吸脹后，用95%的酒精浸泡30 S， 接著用0.1%的升汞表面滅菌5 min，再用無(wú)菌水沖洗6次，將每個(gè)根瘤編號(hào)后分別放入一個(gè)無(wú)菌的2-ml離心管中，用無(wú)菌的研磨棒將根瘤研碎，用移液器加入I ml無(wú)菌水并吸排3 次懸浮勻漿液，將懸浮液系列稀釋10倍，100倍和1000倍，然后分別吸取100 μ I懸浮液涂布在YMA固體培養(yǎng)基(每升含I g酵母粉，10 g甘露醇，0.5 g K2HPO4, 0.2 g MgSO4,0.1g NaCl, l.Og CaCO3, pH 6.8，15 g瓊脂粉)上，將培養(yǎng)平板放在28°C暗培養(yǎng)。培養(yǎng)3 - 5天后挑取有典型根瘤菌菌落形態(tài)(圓形、乳白色、隆起、邊緣整齊不蔓延、表面光滑且因有豐富的胞外多糖而粘稠、較濕潤(rùn)、稍透明)的菌落，在YMA平板上劃線培養(yǎng)，重復(fù)3次劃線純化菌落。將純化的單菌落在無(wú)菌水中懸浮，經(jīng)革蘭氏染色后鏡檢，選出革蘭氏染色陰性、細(xì)胞呈桿狀且形態(tài)一致的細(xì)菌作為純化的根瘤菌菌株。所述純化的根瘤菌菌株可接種在TY培養(yǎng)液(每升含5 g胰蛋白胨，3 g酵母粉，0.33 g CaCl2, pH 6. 8)中培養(yǎng)至對(duì)數(shù)后期或穩(wěn)定期，與30% (v/v)的甘油溶液等體積混勻，冷凍于_80°C長(zhǎng)期保存。
2.根瘤菌ac必基因的擴(kuò)增和鑒定將根瘤菌菌株接種到TY培養(yǎng)液中培養(yǎng)至對(duì)數(shù)后期或穩(wěn)定期的100 μ I菌液移至1.5-ml離心管中，8000 rpm離心5 min,吸去上清液,用0. 5 ml滅菌雙蒸水清洗2次,用100 μ I滅菌雙蒸水重新懸浮菌體，取I μ I菌懸液進(jìn)行PCR擴(kuò)增；模板是菌體經(jīng)pcr預(yù)變性反應(yīng)加熱裂解后釋放的 DNA ;引物是 acdSf3 :5’-ATCGGCGGCATCCAGWSNAAYCANAC_3’和 acdSr3 5’-GTGCATCGACTTGCCCTCRTANACNGGRT-3’，使用濃度為0. 4 μ Μ。反應(yīng)體系用天根生化科技 (北京)有限公司生產(chǎn)的2XTaq PCR MasterMix0 PCR擴(kuò)增在Bio-Rad S1000型PCR儀上進(jìn)行。擴(kuò)增程序?yàn)?4°C預(yù)變性4 min;94°C變性45 s，53°C退火45 s，72°C延伸I min, 35個(gè)循環(huán)；72°C延伸7 min。擴(kuò)增產(chǎn)物用1% (w/v)的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，然后送至英濰捷基(上海)生物技術(shù)有限公司用引物acdSf3和acdSr3進(jìn)行測(cè)序。
從菌株KDRM185擴(kuò)增得到的DNA片段在去除引物后的序列見(jiàn)SEQ ID NO: 2。將序列SEQ ID NO: 2在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行BLAST檢索，結(jié)果顯示SEQ ID NO: 2與中慢生根瘤菌屬根瘤菌的acoi 相似，其中與從生長(zhǎng)在甘肅省刺槐的根瘤中分離的紫穗槐中慢生根瘤IMesorhizobium amorphae CCNWGS0123 的兩個(gè)拷貝 acdS 中的一個(gè) acoS1 的相應(yīng)序列(可在GenBank登錄號(hào)AGSN01000010的序列中檢索到)相同。這表明擴(kuò)增得到的序列是ac必序列，菌株KDRM185有ACC脫氨酶。
3.用有ACC脫氨酶的根瘤菌接種刺槐苗和檢測(cè)接種效應(yīng)選直徑約O. 8 - I cm的刺槐根，剪成8 - 10 cm的根段，將根段插入苗床的育苗基質(zhì)中，在25 - 28° C，相對(duì)濕度75 - 85%的溫室中培養(yǎng)，每周澆水一次，在約5周后刺槐出苗約5 - 8 cm時(shí)進(jìn)行接種。具體為先將有ACC脫氨酶的根瘤菌在YMA固體培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的新鮮菌落接種至TY培養(yǎng)液中，在28° C和200 rpm培養(yǎng)48 - 72 h至穩(wěn)定期；培養(yǎng)時(shí)每個(gè)500-ml錐形瓶裝100 ml培養(yǎng)液，培養(yǎng)后每毫升約含5 X IO9個(gè)細(xì)菌細(xì)胞。然后將菌液用自來(lái)水稀釋500倍后澆灌苗床。對(duì)照幼苗用等量的自來(lái)水代替進(jìn)行澆灌。接種3個(gè)月后檢測(cè)刺槐苗的結(jié)瘤數(shù)、株高、地徑和干重。其中菌株KDRM185的結(jié)果如表I所示。
表I根瘤菌KDRM185接種刺槐苗的效應(yīng)結(jié)瘤數(shù)株高(cm)地徑(mm)地上部干重(g)干重增加(%)不接種的對(duì)照刺槐苗3653. 406. 350接種的刺槐苗471115. 5815. 24140%從表I可以看出接種刺槐后，根瘤菌KDRM185與刺槐共生可形成較多的根瘤，通過(guò)還原空氣中的N2為刺槐生長(zhǎng)提供氮素，能顯著促進(jìn)刺槐苗生長(zhǎng)，增加生物量。
4.細(xì)菌16S rRNA基因的擴(kuò)增和鑒定將菌株接種到TY培養(yǎng)液中培養(yǎng)至對(duì)數(shù)后期或穩(wěn)定期的100 μ I菌液移至I. 5-ml 離心管中，8000 rpm離心5 min,吸去上清液，用O. 5 ml滅菌雙蒸水清洗2次，用100 μ I滅菌雙蒸水重新懸浮菌體，取I μ I菌懸液進(jìn)行PCR;模板是菌體經(jīng)PCR預(yù)變性反應(yīng)加熱裂解后釋放的DNA ;引物是27F :5’ -AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3’和1492R 5’ -GGTTACCTTGTTACGACTT-3’，使用濃度為O. 25 μ Μ。反應(yīng)體系用天根生化科技(北京)有限公司生產(chǎn)的2XTaq PCR MasterMix0 PCR擴(kuò)增在Bio-Rad S1000型PCR儀上進(jìn)行。擴(kuò)增程序?yàn)?4° C預(yù)變性3 min; 94° C變性55 S，50° C退火50 S，72° C延伸I min，35個(gè)循環(huán); 72°C延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物用1% (w/v)的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，然后送至英濰捷基 (上海)生物技術(shù)有限公司用相應(yīng)擴(kuò)增引物進(jìn)行測(cè)序。
從菌株KDRM185擴(kuò)增得到的DNA片段在去除引物后的序列見(jiàn)SEQ ID NO: I。將序列SEQ ID NO: I在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行BLAST檢索，結(jié)果顯示SEQ ID NO: I與中慢生根瘤菌屬根瘤菌的16S rRNA基因序列相似，其中與中慢生根瘤菌屬典型種百脈根中慢生根瘤菌典型菌株JfesorAizoAiws loti ATCC 700743的16S rRNA基因序列一致性為98. 8%，與錦雞兒中慢生根瘤菌典型菌株ifesorAizoAia caraganae CCBAU 11299的16S rRNA基因序列一致性為99. 9%。這表明擴(kuò)增得到的序列是16S rRNA基因序列，菌株KDRM185屬于中慢生根瘤菌屬。
5.根瘤菌16S rRNA基因的系統(tǒng)發(fā)育分析將菌株KDRM185的16S rRNA基因序列SEQ ID NO: I與中慢生根瘤菌屬現(xiàn)有25個(gè)種的各種典型菌株(見(jiàn) the List of Prokaryotic names with Standing in Nomenclature, http://www. bacterio. cict. fr)的16S rRNA基因序列一起進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析。分析時(shí)以根瘤菌屬典型種豆根瘤菌典型菌株·leguminosarum USDA 2370的16S rRNA基因序列為外群。用MEGA 5.0軟件對(duì)163 rRNA基因序列進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，用MEGA 5. O軟件整合的MUSCLE程序以默認(rèn)參數(shù)運(yùn)行序列聯(lián)配，用Neighbor-joining法以Kimura 2-parameter 模型構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)；樹(shù)分支節(jié)點(diǎn)擴(kuò)展值用Bootstrap方法重復(fù)1000次計(jì)算。
所述分析構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)見(jiàn)圖I。圖I顯示菌株KDRM185的16S rRNA基因與錦雞兒中慢生根瘤菌典型菌株ifesorAizoAia caraganae CCBAU 11299的16S rRNA基因處在同一節(jié)點(diǎn)分出的分支上，表明菌株KDRM185屬于中慢生根瘤菌屬，可能屬于錦雞兒中慢生根瘤菌種。
6.根瘤菌acoS1基因的系統(tǒng)發(fā)育分析將菌株KDRM185的ac必基因序列SEQ ID NO: 2與中慢生根瘤菌屬中已發(fā)現(xiàn)有ac必的7個(gè)菌株的acoS1基因序列一起進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析。分析時(shí)以豆根瘤菌 Ieguminosarum bv. viciae 3841 的 acoS1 基因序列為外群。用 MEGA 5. O 軟件對(duì) acoS1 基因序列進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，用MEGA 5. O軟件整合的MUSCLE程序以默認(rèn)參數(shù)運(yùn)行序列聯(lián)配， 用Neighbor-joining法以Kimura 2-parameter模型構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)；樹(shù)分支節(jié)點(diǎn)擴(kuò)展值用Bootstrap方法重復(fù)1000次計(jì)算。
所述分析構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)見(jiàn)圖2。圖2顯不菌株KDRM185的acoS1與從生長(zhǎng)在甘肅省刺槐的根瘤中分離的ifesorAizoAiw amorphae CCNWGS0123的兩個(gè)拷貝acoS1中的一 y^acdS處在系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)上的同一分支,與中慢生根瘤菌屬中其他已知有ACC脫氨酶菌株的 acdS的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。這表明在進(jìn)化中屬于不同種的根瘤菌KDRM185和CCNWGS0123兩者之間可能發(fā)生過(guò)基因的水平轉(zhuǎn)移或者通過(guò)水平轉(zhuǎn)移的方式從其他根瘤菌獲得了相同的acdS基因。
權(quán)利要求
1.中慢生根瘤菌KDRM185，其特征在于它已保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)為 CCTCC NO M 2012329。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的中慢生根瘤菌KDRM185在刺槐育苗造林中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一個(gè)從刺槐根瘤中分離的、有ACC脫氨酶能高效結(jié)瘤并促進(jìn)刺槐生長(zhǎng)的中慢生根瘤菌KDRM185及其應(yīng)用。該中慢生根瘤菌KDRM185菌株已保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)為CCTCCNOM2012329。本發(fā)明所述的中慢生根瘤菌KDRM185有ACC脫氨酶，能將ACC分解成α-酮丁酸和NH3，降低植物細(xì)胞合成乙烯的水平，減輕乙烯對(duì)根瘤菌侵染的抑制作用，提高根瘤菌與刺槐的結(jié)瘤率和共生固氮的水平，為刺槐在不施肥的貧瘠荒地上生長(zhǎng)提供高水平的氮素，促進(jìn)刺槐苗生長(zhǎng)，增加刺槐成材的生物量，從而用低成本的接種投入讓刺槐成材高產(chǎn)，在刺槐育苗造林上發(fā)揮作用。
文檔編號(hào)A01G1/00GK102978138SQ20121047572
公開(kāi)日2013年3月20日 申請(qǐng)日期2012年11月21日 優(yōu)先權(quán)日2012年11月21日
發(fā)明者李江川, 李萬(wàn)里, 張繼泰 申請(qǐng)人:中盈長(zhǎng)江國(guó)際新能源投資有限公司