專利名稱：枯草芽孢桿菌has及其在防治甘蔗黑穗病中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬微生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一株菌株及其應(yīng)用，具體是一株枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis) HAS及其在防治甘鹿黑穗病中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
甘蔗黑穗病最早是在1877年南非納塔爾被發(fā)現(xiàn)，隨后在其它國家、地區(qū)也相繼有該病害發(fā)生的報道。中國于1932年在廣州發(fā)現(xiàn)該病害，之后各地也都出現(xiàn)該病。近年來，隨著蔗種無性繁殖栽培技術(shù)的推廣，蔗種頻繁引進(jìn)調(diào)運(yùn)，蔗田長期連作同一品種以及宿根 蔗年限的逐漸延長，造成甘蔗黑穗病在我國廣西、云南、廣東、福建、海南等省蔗區(qū)發(fā)生日趨嚴(yán)重，造成的損失多達(dá)10-30%，嚴(yán)重的甚至導(dǎo)致宿根蔗幾乎絕收。甘鹿黑穗病是由Ustilago scitaminea Sydow.(屬擔(dān)子菌綱黑粉菌屬)引起的一種真菌病害，該病菌營養(yǎng)菌絲無色，具分隔分枝功能，在甘蔗的分生組織細(xì)胞中生長，菌絲成熟后，形成厚膜孢子堆(冬孢子)。甘蔗黑穗病最明顯特征是病蔗梢頭具一條向下卷內(nèi)的黑色鞭狀物，長幾厘米至數(shù)十厘米不等，鞭中央是由薄壁組織或維管束組織構(gòu)成的心柱，夕卜圍包著一層厚垣孢子。染病蔗株的黑穗長短因品種而異，短為幾厘米，直或彎曲，長至幾十厘米，向下彎曲成圈，有些品種可達(dá)I米多。在適宜的環(huán)境條件下，感染蔗株在病菌侵染2-4個月開始形成黑穗，在病菌侵染6-7個月黑穗長度可達(dá)到頂峰。甘蔗黑穗病危害嚴(yán)重，但對其的防治效果不理想。目前，控制甘蔗黑穗病的措施主要有抗病品種、輪作、人工拔除發(fā)病蔗株、溫水處理種蔗及種苗消毒等。生產(chǎn)上栽培的甘蔗品種抗病性較差，有限的抗性基因材料也相當(dāng)缺乏，而且該病菌致病性存在分化，即有生理小種分化，致使同一抗病品種在一地抗病，在另一地抗性較差。有效的防治措施——輪作卻因為對于甘蔗這一作物卻難以實施，一是甘蔗種植一般為新植一年，宿根2年或更長，二是甘蔗主要在我國南部熱帶、亞熱帶地區(qū)生長，多栽種在山地、坡地和旱地，適宜輪作的作物范圍有限，因此，輪作很難被完全采用。常用的化學(xué)防治(種苗消毒)對新植蔗有一定的防治效果，但隨著甘蔗宿根時間的延長，病害的發(fā)生越來越嚴(yán)重。生物防治因?qū)Νh(huán)境友好和易于使用而在其它作物病害上已部分地發(fā)揮作用，但用于甘蔗黑穗病病害的防治一直停滯不前。國內(nèi)外也有利用微生物對甘蔗黑穗病菌孢子進(jìn)行防治的報道。國外，Sinha 和 Singh 報道四種真菌(Fusarium moniliforme [Gibberellafujikuroi] var. subglutinans, Aspergillus niger, A. flavus and Penicillium sp.)具有對甘蔗黑穗病的黑鞭的產(chǎn)生和對冬孢子萌發(fā)的抑制作用。國內(nèi)，廣西大學(xué)廖詠梅等采集甘蔗苗期、生長期的甘蔗土壤、健株及病株的種蔗、葉、莖、芽、根和土壤中分離篩選到一些對黑穗病菌有抑制作用的菌株，并利用相關(guān)基因序列設(shè)計特異性引物，探討得到相關(guān)抑制因子的基因。但未見用生物防治措施有效控制黑穗病的系統(tǒng)報道。經(jīng)檢索，尚未見到利用微生物及其生防制劑成功用于防治甘蔗黑穗病的報導(dǎo)
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一株枯草芽孢桿菌HAS及其在防治甘蔗黑穗病中的應(yīng)用。一株枯草芽孢桿菌菌株，命名為枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis) HAS，已于2012年9月19日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號；保藏編號CGMCC NO. 6590。本發(fā)明所提供的枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis) HAS菌株，分離自我國海南省蔗區(qū)的甘蔗根際土壤，經(jīng)形態(tài)學(xué)、培養(yǎng)性狀、常規(guī)生理生化和16S rDNA序列鑒定，該菌株為枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)的一個新菌株，命名為枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis) HAS。本發(fā)明所提供的枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis) HAS的基本生物學(xué)特性為革蘭氏陽性短桿菌，菌體大小約O. 7 O. 9X I. 8 2. 4μ m之間，產(chǎn)生芽孢，芽孢中生，圓形，周生鞭毛、具運(yùn)動性。在LB培養(yǎng)基上初期菌落淺白色，圓形，表面濕潤，膿狀，難挑起；后期菌落淡黃色，邊緣不整，表面褶皺，挑起褶皺帶起膿狀絲。·
本發(fā)明所提供的枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis) HAS的用途是其在防治甘蔗黑穗病中的應(yīng)用。以本發(fā)明所提供的枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis) HAS為活性成分的生物制劑也屬本發(fā)明的保護(hù)范圍。需要的時候，該制劑可以包含生物制劑制備的常用載體和輔料。本發(fā)明通過盆栽試驗的方法研究枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis) HAS對黑穗病菌孢子的抗性，實驗結(jié)果表明枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)HAS對甘蔗黑穗病的發(fā)生有很好的抑制作用，通過浸種，其防效可達(dá)100%。表明該菌株是一株在防治甘蔗黑穗病菌上具有潛在意義的生防菌株。本發(fā)明通過對蔗區(qū)甘蔗根際土壤中微生物的篩選分離，獲得枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis) HAS，經(jīng)過盆栽試驗表明該菌株對甘蔗黑穗病的發(fā)生有很好的抑制作用，可以有效地控制甘蔗黑穗病的發(fā)生，減少損失，是一株在防治甘蔗黑穗病菌上具有潛在意義的生防菌株，為我國甘蔗產(chǎn)業(yè)的發(fā)展提供幫助。
具體實施例方式下面結(jié)合實施例，對本發(fā)明的具體實施方式
作進(jìn)一步詳細(xì)描述。以下實施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，或按照制造廠商所建議的條件。實施例一、植物病原真菌拮抗菌的篩選及其鑒定菌株篩選稱取5克根際土壤(我國海南省臨高縣甘蔗黑穗病發(fā)生嚴(yán)重的地塊中甘蔗植株的根際土壤)，放入有IOOml無菌水的三角瓶中，在搖床上劇烈振蕩30min后，靜置15min。取Iml稀釋至10_4、10_5、10_6濃度梯度，從各濃度梯度懸浮液中取O. 1ml，用無菌涂棒涂于LB培養(yǎng)基(配方為每升含有蛋白胨10g，酵母粉5g，NaCl 10g，瓊脂粉12g，pH7.0 7. 2)平板上，30°C恒溫培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng)，連續(xù)觀察3天，挑取菌落形態(tài)不同的菌株再次劃線純化保存?zhèn)溆?。在倒好的PDA平板表面涂布甘蔗黑穗病菌冬孢子，在超凈工作臺內(nèi)晾干后，用無菌牙簽點(diǎn)接篩選純化后的菌株進(jìn)行對峙培養(yǎng)，篩選抑菌作用最強(qiáng)(抑菌活性最強(qiáng))的菌株，結(jié)果得到一株對甘蔗黑穗病菌有很強(qiáng)拮抗作用的菌株，將該菌株命名為枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)HAS。已于2012年9月19日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址中國北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號，保藏編號=CGMCC No. 6590。菌株的基本生物學(xué)特性革蘭氏陽性短桿菌，菌體大小約O. 7 O. 9 X I. 8 2.4 μ m之間，產(chǎn)生芽孢，芽孢中生，圓形，周生鞭毛、具運(yùn)動性。在LB培養(yǎng)基上初期菌落淺白色，圓形，表面濕潤，膿狀，難挑起；后期菌落淡黃色，邊緣不整，表面褶皺，挑起褶皺帶起膿狀絲。菌株16S rDNA保守序列的測定將篩選得到的菌株(枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis) HAS)的基因組DNA為模板，以細(xì)菌16S rDNA序列通用引物PQ、P6作為引物，PCR擴(kuò)增出約I. 5kb左右的產(chǎn)物片段，測序結(jié)果表明擴(kuò)增出的序列長度為1518個堿基；將該序列通過互聯(lián)網(wǎng)比對(http: / /www. ncbi. nlm. nih. gov/blast/B last, cgi),擴(kuò)增的片段序列與枯草芽孢桿菌的16S rDNA部分序列的同源性達(dá)99%以上，確定該菌株歸屬為枯草芽抱桿菌(Bacillus subtilis)。實施例二、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis) HAS對甘蔗盆栽苗黑穗病防效的測定以枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)HAS為菌種培養(yǎng)得到生物制劑(以下為重量百分比)I、固體培養(yǎng)將處于保藏狀態(tài)的枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis) HAS接種于固體培養(yǎng)基(1%胰蛋白胨，O. 5%酵母萃取物，l%NaCl, I. 2%瓊脂粉，pH7. O.)中，于37°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)I天，使菌株活化。2、液體培養(yǎng)將活化的枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis) HAS接種于裝有液體培養(yǎng)基(黃豆粉 2. 0%,玉米粉 I. 0%,蔗糖 O. 5%,蛋白胨 O. 3%, CaCO3 O. 2%, (NH4) 2S04 O. 05%,MgSO4- 7H20 O. 02%, KH2PO4 O. 1%, NaOH O. 05%，花生油 O. 2%,消泡劑 O. 02%, ρΗ6· 8-7. 2.)的500ml三角瓶中，每瓶裝200ml，在37°C下，轉(zhuǎn)速170rpm的搖床上培養(yǎng)36h，得到液態(tài)生物制齊IJ (生防菌液一)?；?qū)⑸鲜雠囵B(yǎng)液接至發(fā)酵罐中進(jìn)行發(fā)酵生產(chǎn)，獲得液態(tài)生物制劑(生防菌液二 )。盆栽甘蔗黑穗病防效試驗利用遠(yuǎn)離甘蔗田的土壤拌入采集到的黑穗病菌孢子，使土壤含菌量達(dá)到107克，然后裝入塑料盆(上直徑30cm，下直徑20cm，高30cm)。種莖來自健康種苗基地，經(jīng)PCR抽樣檢測沒有檢測到含有黑穗病菌。試驗設(shè)4個處理，4次重復(fù)，每重復(fù)5盆，每個盆內(nèi)植入單芽種莖4段。處理I用生防菌液一稀釋10倍液浸泡種莖10分鐘，處理2用生防菌液二稀釋100倍液浸泡種莖10分鐘，處理3用生防菌液一稀釋500倍液浸泡10分鐘，處理4為對照，用清水浸泡種莖10分鐘，之后分別植入上述塑料盆中，澆入清水后進(jìn)行試驗，其后所有管理一樣。一個月后統(tǒng)計出苗情況，6個月時統(tǒng)計各處理重復(fù)的發(fā)病株數(shù)(以抽出可以觀察到黑穗鞭為準(zhǔn))，計算發(fā)病率及防治效果，結(jié)果見表I。發(fā)病率(％)=發(fā)病總株數(shù)/出苗總株數(shù)X 100防治效果(％)=(對照組發(fā)病率-處理組發(fā)病率)/對照組發(fā)病率X 100表一枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis) HAS對甘蔗盆栽苗黑穗病的防治效果
權(quán)利要求
1.一株枯草芽孢桿菌菌株，命名為枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)HAS，已于2012年9月19日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號CGMCCNO. 6590。
2.權(quán)利要求I所述的枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)HAS在防治甘蔗黑穗病中的應(yīng)用。
3.一種防治甘蔗黑穗病的生物制劑，其活性成分為權(quán)利要求I所述的保藏編號為CGMCC NO. 6590 的枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis) HAS。
全文摘要
本發(fā)明涉及一株枯草芽孢桿菌HAS及其在防治甘蔗黑穗病中的應(yīng)用，該菌株命名為枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)HAS，已于2012年9月19日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號CGMCC NO.6590。本發(fā)明所提供的枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)HAS的用途是其在防治甘蔗黑穗病中的應(yīng)用，盆栽試驗表明，枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)HAS對甘蔗黑穗病的發(fā)生有很好的抑制作用，通過浸種，其防效可達(dá)100%，表明該菌株是一株在防治甘蔗黑穗病菌上具有潛在意義的生防菌株。
文檔編號A01P3/00GK102899280SQ20121045270
公開日2013年1月30日 申請日期2012年11月14日 優(yōu)先權(quán)日2012年11月14日
發(fā)明者熊國如, 伍蘇然, 張樹珍, 楊本鵬, 馮翠蓮, 蔡文偉, 王俊剛, 王文治 申請人:中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶生物技術(shù)研究所