專利名稱：鐵皮石斛在非無菌條件下無糖微體快繁技術的制作方法
技術領域：
本發(fā)明為生物科技領域的快繁技術，涉及名貴藥材鐵皮石斛在非無菌條件下快速繁殖的方法。
背景技術：
石斛是我國常用中藥，我國藥典2010年版一部已把鐵皮石斛單列為一個品種收藏，因此呈現(xiàn)出其功效或價值比一般石斛更珍貴的獨特療效，鐵皮石斛DendrobiumOfficinale Kimura Et Migo具有滋陰清熱、益胃生津、潤肺止咳等功效,常用于熱病傷津，口干煩渴、病后虛熱等多種病癥。因森林生態(tài)破壞與資源過度開采，野生資源頻臨枯竭，1987年國務院將其列為國家重點保護植物。 為了實現(xiàn)鐵皮石斛資源的可持續(xù)發(fā)展，科研人員自20世紀70年代開始了人工栽培技術的研究工作，直到新世紀，新種子生產(chǎn)、組織培養(yǎng)和設施栽培等人工繁育關鍵技術才得以突破，并迅速推廣應用?，F(xiàn)有的鐵皮石斛組培技術。從種子的萌發(fā)、原球莖及種苗的誘導，種子的生根、再到種苗的增殖及壯苗培養(yǎng)，其時間周期要9-12個月，其整個周期長，耗能大，人工成本高。本發(fā)明使用的培養(yǎng)快繁技術，包括開始的種子無菌萌發(fā)，原球莖及種子的誘導和培養(yǎng)，直到小苗形成后，開始在非無菌條件下繼代快繁，具有出苗時間快，節(jié)約能源和成本，所培育出的壯苗葉大莖粗的優(yōu)質苗，本發(fā)明在近自然的條件下進行可明顯提高其成活率。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種鐵皮石斛在非無菌條件下的繁殖技術，該方法成本低，操作簡便，節(jié)省能源和人力成本，較好的解決了目前存在鐵皮石斛組織培養(yǎng)過程成本高，組培周期長的問題。為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供了以下技術方案I、種子的無菌萌發(fā)采摘鐵皮石斛的果實進行表面消毒處理，將種子播種常規(guī)石斛無菌萌發(fā)培養(yǎng)基上誘導種子無菌萌發(fā)2、原球莖及其種苗的誘導和培養(yǎng)播種后的培養(yǎng)瓶置于原球莖及種幼苗誘導條件下培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為溫度10-30°C，光照為自然光或日光燈500-1500LUX，種子萌發(fā)形成原球莖和種苗3、也可將無菌苗繼續(xù)生根根據(jù)需要將上述條件下培養(yǎng)的種苗轉移到誘導生根的條件下培養(yǎng)以獲得大量形狀優(yōu)良的無菌苗，誘導生根的培養(yǎng)條件為自然光、日光燈、led燈沒日光照12-14小時,光照強度為300-4000LUX，培養(yǎng)溫度為20-35°C鐵皮石斛在非無菌條件下無糖微體繁殖無根或有根的無菌苗洗去培養(yǎng)基晾干待用
將松樹皮自然曬干后打成粗粉(20目)備用可用1/2MS、MS、N6、CHB、B5等培養(yǎng)基，他們中的成分除不加蔗糖、瓊脂、維生素，其他的無機物和有機物均要激素同時加在培養(yǎng)基液體中，包括NAA及6BA，NAA的濃度為O. lmg/L-2mg/L, 6BA0. 2mg/L_2mg/L0配置培養(yǎng)基其固體基質如松樹皮粗粉加培養(yǎng)基液體如1/2MS(含激素)的比例為I : 2-5，以混勻后手抓成團，一壓即散，不宜含過多的水份，一般以I :2. 5-3. 5為好，配置好的培養(yǎng)基 備用。裝并或托盤并子或托盤適當用消毒劑如1/2000高錳酸鉀溶液或1/1000的新潔而滅，擦洗消毒完后可裝入備用的培養(yǎng)基。實施環(huán)境是在密閉的容器(包括各種大小的容器、框架)或房間等，在生產(chǎn)中應用大型容器或房間為宜非無菌條件的快速繁殖將無菌條件下的培養(yǎng)成的幼苗(有2張葉以上)，用常水小心洗去培養(yǎng)基后，晾干即可種入已裝有培養(yǎng)基的容器內(nèi)，并將上述種好苗的容器(并子或托盤)，放置在密封的環(huán)境中，并開始通入二氧化碳氣體，二氧化碳的濃度為O. 1% -20%，其中以O. 5% -5%為好，光照開始5天為3000Lux，5-10天為5000Lux，10天后8000Lux以上，但不超過20000Lux，每天光照12h-14h，密封環(huán)境內(nèi)的溫度20°C -36°C，相對濕度60% -90 %，在上述條件下培養(yǎng)50-80天，待苗有5片以上，莖有以上粗即為大苗。培養(yǎng)出的大苗的馴化將在C02培養(yǎng)器(室)形成上述大苗取出后放置在有遮陰和自然溫度條件下，放置10-15天，保持通風、遮陽，適當淋水，到時即可出苗移栽。
具體實施例方式實施例I下面用實施例來進一步說明本發(fā)明的實質性內(nèi)容。但本發(fā)明的內(nèi)容并不僅僅局限于此。自廣西桂平采集的鐵皮石斛蒴果表面消毒，獲得無菌種子，種子播種在無菌萌發(fā)固體培養(yǎng)基上面，培養(yǎng)基組成為1/2MS，添加蔗糖2%，馬鈴薯提取物20%，煮20分鐘后攪成乳狀加入培養(yǎng)基中，激素O. 5mg/L，瓊脂為0.5%，PH值6. 2。培養(yǎng)瓶置于溫度為20-25°C，光照為自然光或日光燈1500LUX，培養(yǎng)2個月。將萌發(fā)的原球莖進行誘導和繁殖誘導和繁殖的方法為1/2MS，15%馬鈴薯，3%的蔗糖，煮沸半小時，攪成乳狀加入培養(yǎng)基中，另加NAAO. 5mg/L, 6BA0. 5mg/L,活性炭O. 2 %，瓊脂O. 6 %，在上述培養(yǎng)基中培養(yǎng)
一個月。
將上述繁殖的無菌幼苗可移植進行生根培養(yǎng)，培養(yǎng)基為1/2MS，香蕉提取物10%，蔗糖2%，瓊脂為0.5%，NAAO. 5mg/L，活性炭2g/L，PH5. 8，常規(guī)高壓滅菌，培養(yǎng)條件溫度20-32°C，光照度2500-3500Lux。培養(yǎng)時間一個月非無菌條件下快速繁殖，將無菌條件下培養(yǎng)的幼苗(2張葉以上)，包括生根或不生根的均可，用糖水洗去培養(yǎng)基后，即可種入無糖的培養(yǎng)基托盤中，無糖培養(yǎng)基的配方為松樹皮粗粉加1/2MS培養(yǎng)基，含激素，固體更液體的比例為I : 2. 5，以混勻后手抓成團，一壓即散，不宜含過多的水份，裝入托盤，托盤預先用消毒劑抹洗干凈，然后放入密閉的容器內(nèi)，然后通入二氧化碳，二氧化碳濃度為I % -5 %，光照開始5天為3000LUX，5-10天為5000Lux, 10天后8000Lux以上，但不超過20000Lux，每天光照12h_14h，密封環(huán)境內(nèi)的溫度20°C -36°C，相對濕度60% -90%,在上述條件下培養(yǎng)50-80天，待苗有5片以上，莖有3mm-5mm以上粗即為大苗。將在C02培養(yǎng)器(室)形成上述大苗取出后放置在有遮陰和自然溫度條件下，放 置10-15天，保持通風、遮陽，適當淋水，到時即可出苗移栽。實施例2浙江樂親采集的鐵皮石斛蒴果表面消毒，獲得無菌種子，種子播種在無菌萌發(fā)固體培養(yǎng)基上面，培養(yǎng)基組成為1/2MS，添加蔗糖2 %，馬鈴薯提取物20 %，煮20分鐘后攪成乳狀加入培養(yǎng)基中，激素O. 5mg/L，瓊脂為O. 5%，PH值6. 2。培養(yǎng)瓶置于溫度為20_25°C，光照為自然光或日光燈1500LUX，培養(yǎng)2個月。將萌發(fā)的原球莖進行誘導和繁殖誘導和繁殖的方法為1/2MS，15%馬鈴薯，3%的蔗糖，煮沸半小時，攪成乳狀加入培養(yǎng)基中，另加NAAO. lmg/L,6BAl. Omg/L，活性炭O. 2%，瓊脂O. 6%，在上述培養(yǎng)基中培養(yǎng)
一個月。將上述繁殖的無菌幼苗可移植進行生根培養(yǎng)，培養(yǎng)基為MS，香蕉提取物15%，蔗糖3%，瓊脂為0.5%，NAAO. 5mg/L，活性炭2g/L，PH5. 8，常規(guī)高壓滅菌，培養(yǎng)條件溫度20-32°C，光照度2500-3500Lux。培養(yǎng)時間一個月非無菌條件下快速繁殖，將無菌條件下培養(yǎng)的幼苗(2張葉以上)，包括生根或不生根的均可，用常水洗去培養(yǎng)基后，即可種入無糖的培養(yǎng)基托盤中，無糖培養(yǎng)基的配方為松樹皮粗粉加MS培養(yǎng)基，含激素O. 5mg/L,固體與液體的比例為I : 2. 5，以混勻后手抓成團，一壓即散，不宜含過多的水份，裝入托盤，托盤預先用消毒劑抹洗干凈，然后放入密閉的容器內(nèi)，然后通入二氧化碳，二氧化碳濃度為2% -10%，光照開始5天為3000LuX，5-10天為5000Lux，10天后8000Lux以上，但不超過20000Lux，每天光照12h_14h，密封環(huán)境內(nèi)的溫度20V -30V，相對濕度80% -90%,在上述條件下培養(yǎng)60-90天，待苗有5片葉以上，莖有3mm-5mm以上粗即為大苗。將在C02培養(yǎng)器(室)形成上述大苗取出后放置在有遮陰和自然溫度條件下，放置5-10天，保持通風、遮陽，適當淋水，到時即可出苗移栽。
權利要求
1.一種鐵皮石斛在非無菌條件下無糖微體繁殖技術，前期的種子無菌萌發(fā)、圓球莖的繁殖及種苗的誘導和培養(yǎng)直到長成幼苗均為常規(guī)的有糖無菌培養(yǎng)，當鐵皮石斛幼苗有2張葉以上時即可進行非無菌條件下的無糖微體繁殖階段。
(1)其實施環(huán)境 是在密閉的容器(包括各種大小的容器、框架)或房間等，在生產(chǎn)中應用大型容器或房間為宜。
(2)培養(yǎng)基質 采用松樹皮，經(jīng)過天然陽光下曬干，機械打碎成20目粗粉備用，亦可適當添加無機或有機的其他基質，如蛭石、珍珠巖、沙子、塑料泡沫、石棉、纖維素物質，一般添加的比例為0% -50%，還可適當加入活性炭和泥炭。
(3)培養(yǎng)基液體 可用1/2MS、MS、N6、CHB、B5等均可，他們中的成分除不加蔗糖、瓊脂、維生素，其他的無機物和有機物均要。
(4)激素 同時加在培養(yǎng)基液體中，包括NAA及6BA，NAA的濃度為O. lmg/L-2mg/L,6BA0. 2mg/L_2mg/L0 (5)配置培養(yǎng)基 其固體基質如松樹皮粗粉加培養(yǎng)基液體如1/2MS(含激素)的比例為I :2-5，以混勻后手抓成團，一壓即散，不宜含過多的水份，一般以I :2. 5-3. 5為好，配置好的培養(yǎng)基備用。
(6)裝并或托盤 并子或托盤適當用消毒劑如1/2000高錳酸鉀溶液或1/1000的新潔而滅，擦洗消毒完后可裝入備用的培養(yǎng)基。
(7)非無菌條件的快速繁殖 將無菌條件下的培養(yǎng)成的幼苗(有2張葉以上)，用常水小心洗去培養(yǎng)基后，晾干即可種入已裝有培養(yǎng)基的容器內(nèi)，并將上述種好苗的容器(并子或托盤)，放置在密封的環(huán)境中，并開始通入二氧化碳氣體，二氧化碳的濃度為O. 1% -20%，其中以O. 5% -5%為好，光照開始5天為3000Lux，5-10天為5000Lux，10天后8000Lux以上，但不超過20000Lux，每天光照12h-14h，密封環(huán)境內(nèi)的溫度20°C -36°C，相對濕度60% -90%，在上述條件下培養(yǎng)50-80天，待苗有5片以上，莖有以上粗即為大苗。
2.根據(jù)權利要求I所述方法，其特征是培養(yǎng)出的大苗的馴化方法為 將在C02培養(yǎng)器(室)形成上述大苗取出后放置在有遮陰和自然溫度條件下，放置10-15天，保持通風、遮陽，適當淋水，到時即可出苗移栽。
全文摘要
本發(fā)明為生物科技領域新的快繁技術，涉及鐵皮石斛在非無菌條件下的快速繁殖的方法，其主要步序是通過鐵皮石斛種子的無菌萌發(fā)、原球莖及幼苗的形成后，即可開始在非無菌下繼代快繁，用松樹皮粗粉加入1/2MS培養(yǎng)基為基質，不含糖及瓊脂，種植鐵皮石斛幼苗后放入密閉容器，并通二氧化碳，接近自然條件自養(yǎng)生長，相對在較短時間內(nèi)促進幼苗的生根、增長和壯苗，其特點為縮短培苗的時間，在繼代培養(yǎng)時不用高壓滅菌，在常態(tài)下即可進行苗的繁殖生長，且不易污染，培植出的苗葉大莖粗為優(yōu)質苗。與常規(guī)鐵皮石斛的組培相比，有節(jié)省能源消耗和減少人工成本的優(yōu)點，具有快、省、好三大優(yōu)點的好方法。
文檔編號A01H4/00GK102835318SQ20121037426
公開日2012年12月26日 申請日期2012年10月8日 優(yōu)先權日2012年10月8日
發(fā)明者荊樹漢 申請人:荊樹漢