專(zhuān)利名稱(chēng)：一種水稻雄性育性可控系的構(gòu)建方法及育種方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及植物基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種條件誘導(dǎo)控制的水稻雄性育性可控系的基因工程育種及其雜交制種的方法。
背景技術(shù)：
作物不同品種間的異花受粉產(chǎn)生的雜種可能在生長(zhǎng)勢(shì)、適應(yīng)性、產(chǎn)量等方面具有優(yōu)勢(shì)。利用這些雜種優(yōu)勢(shì)可以提高農(nóng)作物的產(chǎn)量、質(zhì)量和抗性。水稻是一種雌雄同株的自花授粉植物，要生產(chǎn)雜交水稻種子，必須選育一個(gè)雄性不育的品系，讓雌蕊接受來(lái)自異株的花粉。中國(guó)育種家利用普通野生稻iPryza rufipogon)的天然雄性不育株(稱(chēng)為“野敗”)為不育細(xì)胞質(zhì)的供體，通過(guò)與栽培秈稻(ft sativa ssp.)雜交和回交育出三系雜交稻生產(chǎn)上所需的不育系、保持系和恢復(fù)系。利用不育系和恢復(fù)系做親本雜交可省去除雄的 操作，便于生產(chǎn)高純度的雜交種子，因此有重要的生產(chǎn)應(yīng)用價(jià)值(袁隆平.1977.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)· 1:27-31, Lin, and Yuan 1980. In: IRRI (eds) Innovative approaches to ricebreeding. IRRI, Manila, p35 - 51)。在中國(guó)，已用野敗不育細(xì)胞質(zhì)培育了大量的三系雜交稻品種并大規(guī)模應(yīng)用，產(chǎn)生了巨大的經(jīng)濟(jì)和社會(huì)效益(Cheng等，2007，Am. Bot. , 100，959-966)。多種農(nóng)作物如水稻、小麥、玉米、油菜等關(guān)于雄性不育性及其育性恢復(fù)性的研究已有許多報(bào)道，在生產(chǎn)上已大規(guī)模用于雜交種生產(chǎn)。不育系可分為細(xì)胞質(zhì)不育基因控制的細(xì)胞質(zhì)雄性不育(cytoplasmic male sterility,簡(jiǎn)稱(chēng)為CMS)和核不育基因控制的核不育(genic male sterility,簡(jiǎn)稱(chēng)為GMS)。從近年發(fā)展的基因?qū)W來(lái)說(shuō)細(xì)胞質(zhì)雄性不育系的細(xì)胞質(zhì)通常為攜帶不育基因的線(xiàn)粒體基因組，其不育基因的表達(dá)導(dǎo)致花粉不育；恢復(fù)系的核基因組中攜帶細(xì)胞質(zhì)雄性不育恢復(fù)基因(restorer of fertility),簡(jiǎn)稱(chēng)為恢復(fù)基因或TP/基因，其花粉正常可育，可自交結(jié)實(shí)；保持系具有正常的可育細(xì)胞質(zhì)，但其核基因組不攜帶有恢復(fù)功能的基因，花粉正常可育，可自交結(jié)實(shí)。生產(chǎn)上配套應(yīng)用的“三系”中，保持系和不育系具有相同的核基因組，其差別是細(xì)胞質(zhì)基因組不同。由于不同類(lèi)型的植物細(xì)胞質(zhì)雄性不育是由不育細(xì)胞質(zhì)的線(xiàn)粒體基因組中的特異不育基因產(chǎn)生，其育性的恢復(fù)需要特異的恢復(fù)基因的作用(Schnable and Wise, 1998,Trends Plant Sci. 3 :175_180)。水稻細(xì)胞質(zhì)雄性不育有多種類(lèi)型，主要是(I)野敗型(wild abortive,簡(jiǎn)稱(chēng)WA型)，屬于孢子體不育；(2)包臺(tái)(BT)型，屬于配子體不育；(3)紅蓮(HL)型，屬于配子體不育(朱英國(guó)，2000，水稻雄性不育的生物學(xué)，武漢大學(xué)出版社)。其中野敗型不育系在“三系”雜交稻的應(yīng)用最廣泛。三系雜交稻育種體系對(duì)種質(zhì)的遺傳基礎(chǔ)有特殊的要求，即不育系要有不育細(xì)胞質(zhì)(線(xiàn)粒體基因組含有特別的不育基因)，保持系要完全不含主效和微效恢復(fù)基因，而恢復(fù)系要攜帶主效和微效恢復(fù)基因。因此，三系雜交稻的三系培育所能利用的種質(zhì)資源有限，育種難度較大，雜交配組的自由度不大，不育系和雜交種的繁殖和制種程序較繁瑣。在水稻也成功培育出基于光溫敏不育系的二系雜交稻，并在生產(chǎn)中推廣應(yīng)用(朱英國(guó)，2000，水稻雄性不育的生物學(xué)，武漢大學(xué)出版社；Cheng等，2007，Am. Bot. , 100，959-966)。光溫敏不育系是利用在短日低溫的條件下雄性可育自交繁殖，在長(zhǎng)日高溫的條件下雄性不育，可作為母本與父本雜交制種。任何正?？捎母副镜南嚓P(guān)野生型育性基因都可以抑制光溫敏不育性，雜交種在正常生長(zhǎng)季節(jié)的花粉育性正常。因此二系雜交稻的父本的篩選配組的自由度較大。中國(guó)目前應(yīng)用的二系雜交稻主要是以溫敏不育為主。由于溫敏不育系的雄性育性受溫度控制，不育系繁殖需要在特定區(qū)域的特定季節(jié)(如海南省偏南地區(qū)的冬季)或特定條件(如深水庫(kù)低溫水灌溉)進(jìn)行。更嚴(yán)重的問(wèn)題是在制種季節(jié)的育性轉(zhuǎn)換敏感期(一般是減數(shù)分裂期至小孢子發(fā)育期)遇到異常的低溫天氣(25°C或以下)會(huì)產(chǎn)生部分可育花粉，造成部分自交結(jié)實(shí)而降低雜種純度，嚴(yán)重的情況下使雜交種達(dá)不到純度標(biāo)準(zhǔn)而報(bào)廢。因此，由于溫度變化產(chǎn)生的制種風(fēng)險(xiǎn)是制約二系雜交稻發(fā)展的主要因素。水稻花藥發(fā)育涉及大量核基因的參與，自然突變或理化誘變可以較高頻度產(chǎn)生雄性不育突變。在水稻已經(jīng)報(bào)道了大量的雄性不育突變體，其中已有20多個(gè)雄性育性基因已被克隆(Zhang DB and Wilson ZA, 2009，Chinese Science Bulletin, 2342-2353)。但由于大部分突變體是相關(guān)基因隱性不育突變，它們的純合突變體不能自交繁殖，而用野生型親本與其雜交只能產(chǎn)生相關(guān)基因雜合的可育(或部分可育)的雜種，因此核不育突變系不適宜直接作為商業(yè)化雜交稻制種的不育系親本。 另一方面，也有多種基因工程方案創(chuàng)建植物不育系及其恢復(fù)系的報(bào)道。這些方案歸納起來(lái)主要有2種，一是用花藥或花粉特異表達(dá)啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)細(xì)胞毒素基因的表達(dá)影響花藥或花粉的正常發(fā)育。如用花藥特異表達(dá)啟動(dòng)子TA29控制Barnase基因轉(zhuǎn)化煙草和油菜產(chǎn)生雄性不育(Mariani等，1990)。另一種是用花藥或花粉特異表達(dá)啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的反義RNA或RNA干擾抑制花藥必需基因的表達(dá)。如在玉米中表達(dá)類(lèi)黃酮生物合成關(guān)鍵基因CHS反義RNA產(chǎn)生雄性不育(Cie等1981)。這些方案都需要用基因工程技術(shù)解決不育系的繁殖問(wèn)題和雜種雄性育性的恢復(fù)問(wèn)題。例如在Barnase基因工程不育系統(tǒng)中，需要用篩選標(biāo)記基因篩選不育系，以及用Barster基因轉(zhuǎn)化父本作為恢復(fù)基因(Mariani等，1992)。目前在水稻中還沒(méi)有開(kāi)發(fā)出實(shí)用性的基因工程雜交制種體系。基于以上分析，開(kāi)發(fā)優(yōu)于三系和溫敏二系雜交稻制種技術(shù)體系和現(xiàn)有的基因工程雜交制種體系，對(duì)雜交稻的進(jìn)一步發(fā)展具有重要的意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的第一個(gè)目的是提供一種水稻雄性育性可控系的構(gòu)建方法。本發(fā)明的第二個(gè)目的是利用此水稻雄性育性可控系進(jìn)行雜交制種的方法。本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供以此育種方法的關(guān)鍵材料和元件，即水稻雄性不育突變系、包含誘導(dǎo)型啟動(dòng)子和雄性育性基因的重組基因表達(dá)盒及其載體、以及合適的誘導(dǎo)劑。為此，本發(fā)明的水稻雄性育性可控系的構(gòu)建方法包括(a)獲得水稻雄性育性基因的不育突變系和相應(yīng)的雄性育性基因；(b)構(gòu)建由誘導(dǎo)型啟動(dòng)子控制的雄性育性基因表達(dá)盒轉(zhuǎn)化載體；(C)以所述表達(dá)盒轉(zhuǎn)化載體轉(zhuǎn)化所述不育突變系，獲得水稻雄性育性可控系。上述方法包括獲得一個(gè)水稻雄性育性基因的不育突變系，用分子生物學(xué)方法克隆該雄性育性基因，和篩選出合適的誘導(dǎo)劑(例如化學(xué)誘導(dǎo)劑)和相應(yīng)的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。構(gòu)建此誘導(dǎo)型啟動(dòng)子控制的所述雄性育性重組基因表達(dá)盒載體，轉(zhuǎn)化所述的雄性不育系，獲得水稻雄性育性可控系。本發(fā)明建立的雄性育性可控系優(yōu)選利用化學(xué)誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)重組育性基因表達(dá)使其自交繁殖，而不施加誘導(dǎo)條件的自然生長(zhǎng)條件下表現(xiàn)完全的雄性不育，因而可與父本雜交生產(chǎn)雜交一代(F1)種子。為獲得所述水稻雄性育性基因的不育突變系，本發(fā)明從鈷60-Y射線(xiàn)誘變水稻品系02428的突變體庫(kù)篩選得到I個(gè)孢子體型雄性不育突變系該突變系的保藏編號(hào)為CCTCC P201207，保藏單位為中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，地址為中國(guó)武漢市珞珈山武漢大學(xué)，保藏日期為2012年8月29日，保藏的生物材料拉丁文學(xué)名為Oryza sativa L.，分類(lèi)命名為稻屬水稻。以此突變系與水稻品種黃華占雜交獲得F2遺傳群體，以定位克隆技術(shù)克隆到導(dǎo)致此雄性不育的功能缺失突變基因(SEQ ID No. I)，命名為及其功能型(野生型)基因(SEQ ID No. 2，SEQ ID No. 3)，命名為及7(575"基因編碼一個(gè)688 氨基酸的 ABC 運(yùn)轉(zhuǎn)子蛋白(ATP-binding cassette transporter) (SEQ ID No. 4)。其功能涉及從花藥絨氈層運(yùn)輸脂肪酸到小孢子，合成花粉壁的主要成分花粉素，屬于孢子體育性基因。在此突變系中，該基因缺失了包括一個(gè)外顯子和2個(gè)內(nèi)含子的1479 bp而功能缺失，導(dǎo)致早期小孢子不能正常發(fā)育而退化，產(chǎn)生無(wú)花粉型敗育。本發(fā)明以丙環(huán)唑和腈菌唑?yàn)橛行С煞值膬?nèi)吸性殺菌劑(可在植物組織間傳導(dǎo))混 合溶液施加到孕穗期的水稻葉片，24h后取處理和對(duì)照的花藥提取RNA。利用水稻全基因組表達(dá)芯片(OsAffx)雜交和定量RT-PCR驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)I個(gè)芯片探針(OsAffx. 13615. I. Sl_at)代表的基因在非處理樣品的表達(dá)水平很低，而在處理樣品的表達(dá)水平大大高于非處理對(duì)照。本發(fā)明用PCR技術(shù)擴(kuò)增克隆了這個(gè)基因的啟動(dòng)子序列(SEQ ID No. 5)。本發(fā)明將所述的啟動(dòng)子和功能型育性基因的全長(zhǎng)編碼區(qū)(CDS)序列、或具有編碼該蛋白功能活性序列的部分cDNA序列、或基因組序列在轉(zhuǎn)化載體上構(gòu)建成重組基因表達(dá)盒。如SEQ ID No. 6所示的是用所述的啟動(dòng)子和功能型育性基因的全長(zhǎng)CDS序列構(gòu)建的重組基因表達(dá)盒。將含有此重組基因表達(dá)盒的載體轉(zhuǎn)化導(dǎo)入所述的雄性不育突變系，經(jīng)下述方法誘導(dǎo)育性恢復(fù)，自交繁殖獲得轉(zhuǎn)基因純合的雄性育性可控系。如果在構(gòu)建重組育性基因轉(zhuǎn)化載體時(shí)結(jié)合使用一種篩選標(biāo)記剔除技術(shù)，就可以獲得無(wú)篩選標(biāo)記的雄性育性可控系O所述功能型雄性育性基因是指能夠?qū)崿F(xiàn)雄性可育性的基因，其包括野生型雄性育性基因和雖然發(fā)生突變但仍保持雄性育性功能的基因，或從其它物種分離的具有相同功能活性的同源基因。本發(fā)明育成的水稻雄性育性可控系的自交繁殖方法為，在花藥發(fā)育期為減數(shù)分裂期至單核小孢子發(fā)育期，用丙環(huán)唑或腈菌唑或其混合水溶液噴施葉片或施入土壤，可誘導(dǎo)重組育性基因表達(dá)而恢復(fù)花粉育性，自交獲得種子。本發(fā)明的雜交制種方法為，將所述的水稻雄性育性可控系與正?？捎母副?按適當(dāng)比例)種植在制種田。在不施用化學(xué)誘導(dǎo)劑的正常生長(zhǎng)條件下，由于所述的化學(xué)誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的本底表達(dá)水平低，即重組轉(zhuǎn)基因的表達(dá)水平低，而內(nèi)源突變基因(SEQ ID No. I)是功能缺失的，雄性育性可控系的花藥發(fā)育異常而完全雄性不育，因此可接受父本的花粉受精結(jié)實(shí)，獲得高純度的F1種子。父本來(lái)源的功能型育性基因(SEQ ID No. 2)的正常功能可以使F1植株的花藥和花粉正常發(fā)育，因此雄性育性正常，能產(chǎn)生結(jié)實(shí)種子。用本發(fā)明方法除了利用所述的育性基因(SEQ ID No. 2)及其突變基因(SEQ ID No. I)外，還可以獲得和利用在(包括其啟動(dòng)子區(qū))的任何位置產(chǎn)生的等位性突變不育基因，構(gòu)建具有本實(shí)施例所述類(lèi)似效果的雄性育性可控系。由于通過(guò)各種誘變技術(shù)或從自然突變中可以獲得水稻其它育性基因的雄性不育突變體，并可以用分子生物學(xué)技術(shù)克隆相應(yīng)的野生型育性基因，根據(jù)本發(fā)明的方法，還可以利用水稻其它雄性育性突變基因及其野生型基因，構(gòu)建具有本實(shí)施例所述類(lèi)似效果的雄性育性可控系及其雜交制種系統(tǒng)。類(lèi)似地，也可以用其它誘導(dǎo)型啟動(dòng)子及其合適的誘導(dǎo)劑替代本實(shí)施例所示的啟動(dòng)子(SEQ ID No. 5)及其誘導(dǎo)劑丙環(huán)唑或腈菌唑，構(gòu)建具有類(lèi)似效果的雄性育性可控系及其雜交制種系統(tǒng)。本發(fā)明方法構(gòu)建的雄性育性可控系及其雜交制種方法是一種結(jié)合利用內(nèi)源核不育突變基因和重組轉(zhuǎn)基因的新型二系雜交稻制種系統(tǒng)。它克服了基于細(xì)胞質(zhì)雄性不育基因與恢復(fù)基因的三系雜交稻和基于光溫敏不育基因的二系雜交稻育種方法存在的問(wèn)題，也比其它基因工程方法創(chuàng)制的不育系和恢復(fù)系雜交體系具有更多優(yōu)點(diǎn)(I)其它的基因工程培育植物雄性不育技術(shù)是基于轉(zhuǎn)基因的表達(dá)控制雄性不育的發(fā)生，往往轉(zhuǎn)基因的表達(dá)效果及其作用效應(yīng)不穩(wěn)定，導(dǎo)致不育性不完全或不穩(wěn)定。本發(fā)明產(chǎn)生的雄性育性可控系的花粉不育性由內(nèi)源的功能缺失突變基因決定，因而不育性完全且穩(wěn)定，不受環(huán)境條件如溫度和日長(zhǎng)的影響；(2)不需像其它的基因工程植物雄性不育系方法那樣用基因工程技術(shù)建立不 育系繁殖和雜種育性恢復(fù)體系，本發(fā)明方法對(duì)任何可育品種(系)都是潛在的父本恢復(fù)系，因而雜交組合配對(duì)的自由度大；(3)本發(fā)明只在雄性育性可控系的自交繁殖環(huán)節(jié)才使用化學(xué)誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)重組育性基因的表達(dá)來(lái)恢復(fù)育性，對(duì)育性恢復(fù)程度的要求不高，如40-60%左右的結(jié)實(shí)率即可達(dá)到經(jīng)濟(jì)實(shí)用性；(4)在所有水稻種植區(qū)的水稻生長(zhǎng)季節(jié)都可以繁殖和制種，不必像光溫敏不育系那樣選擇合適日長(zhǎng)或溫度的季節(jié)或地域進(jìn)行繁殖和制種；(5)需要育性操控(施誘導(dǎo)劑)的繁殖田面積最少(是雜交制種田面積的約1/300)，且所用的化學(xué)誘導(dǎo)劑是常用的廉價(jià)的低毒殺菌劑，因而雄性育性可控系的繁殖簡(jiǎn)單，成本低；(6)在結(jié)合使用篩選標(biāo)記剔除技術(shù)的情況下，本方法產(chǎn)生的雄性育性可控系只攜帶植物來(lái)源(如水稻來(lái)源)的轉(zhuǎn)基因組分(啟動(dòng)子和育性基因)，不構(gòu)成超出自然突變事件程度的生物安全性問(wèn)題。


圖I雄性育性可控系創(chuàng)制及其雜交制種方法示意圖-Jns為育性突變基因，M為雄性育性功能型基因；pind為誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。圖2水稻雄性不育突變體的表型A為野生型(WT)和突變體的小花；B為花藥I2_k染色，突變體花藥內(nèi)不含花粉粒；C為野生型和突變體灌漿后的株型；A、B小圖中標(biāo)尺為I _。圖3 (A)雄性不育突變基因座的精細(xì)定位；(B)相關(guān)功能型育性基因i0sABCG15)及其功能缺失突變基因iosabcgl,5)的結(jié)構(gòu)；(C)用定量RT-PCR進(jìn)行OsABCG15在花藥的表達(dá)分析(以O(shè)sActinl為內(nèi)參)；1-5分別為花粉母細(xì)胞期、減數(shù)分裂期，四分體期至單核早期、單核中晚期、二核期；(D)以Pubi: :遺傳轉(zhuǎn)化突變體恢復(fù)雄性育性，以驗(yàn)證其功能。圖4定量RT-PCR檢測(cè)水稻化學(xué)誘導(dǎo)型啟動(dòng)子(SEQ ID No. 4)的本底表達(dá)(對(duì)照)及其受誘導(dǎo)24 h后的相對(duì)表達(dá)水平(以O(shè)sUbiquitin基因?yàn)閮?nèi)參)。
圖5重組基因表達(dá)盒結(jié)構(gòu)，所示位點(diǎn)的堿基位置是根據(jù)SEQ ID No. 5列出。圖6 (A)用所述重組基因轉(zhuǎn)化雄性不育突變體，獲得的雄性育性可控系在不施用誘導(dǎo)劑的情況下產(chǎn)生無(wú)花粉型不育；(B-D)在減數(shù)分裂期至小孢子發(fā)育期施用所示誘導(dǎo)劑的花粉育性和小穗結(jié)實(shí)。圖7 (A)雄性育性可控系與秈稻父本HNL-I雜交獲得的雜種Fl ； (B)Fl的花粉育性和小穗結(jié)實(shí)。所述不育突變系的保藏編號(hào)為CCTCC P201207，保藏單位為中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(簡(jiǎn)稱(chēng)CCTCC)，保藏日期為2012年8月29日。
具體實(shí)施例方式以下實(shí)施例用于進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明，但不限制本發(fā)明的范圍。若未特別指明，所用 的是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)技術(shù)方法。實(shí)施例I水稻雄性不育突變基因及其功能型育性基因的定位克隆和功能驗(yàn)證 用鈷60- Y射線(xiàn)誘變水稻粳稻品種02428，獲得I個(gè)單座位隱性孢子體雄性不育突變
體，命名為(圖2)。將與秈稻品種黃華占雜交獲得F2定位群體。以表I所列的基于PCR的插入/缺失多態(tài)性分子標(biāo)記，利用約10500株F2個(gè)體將定位在第6染色體的一個(gè)43 kb的區(qū)間(圖3A)。該區(qū)間存在2個(gè)預(yù)測(cè)基因(基因號(hào)0s06g006700和0s06g006800\ DNA測(cè)序分析表明，與原親本的基因組序列相比，msll2的0s06g006800沒(méi)有變異，而在0s06g006700缺失了一段包括I個(gè)外顯子和2個(gè)內(nèi)含子的1479 bp片段(圖3B, SEQ ID No. I)。本發(fā)明將該野生型(功能型)基因命名為(SEQ ID No. 2，SEQID No. 3),它編碼一個(gè) 454 氨基酸的 ABC 運(yùn)轉(zhuǎn)子(ATP-binding cassette transporter)蛋白(SEQ ID No. 4)。其功能可能是從花藥絨氈層運(yùn)輸脂肪酸到小孢子，合成花粉壁的主要成分花粉素。用特異引物 5’-CATGTGTGGCCAACCAAAGA-3 和 5’-GTG GTCTTGCCACTGCC AGA-3’對(duì)不同發(fā)育時(shí)期花藥進(jìn)行定量RT-PCR分析表明，0sABCG15主要在四分體期至單核小孢子早期表達(dá)(圖3C)。表I定位所用的插入/缺失(insertion/deletion)分子標(biāo)記引物
標(biāo)記名I引物序列(5’ -一3’)-
623652 GGTGCGTATGTTTGTTCCAGT, GGATAATATCAGGAGACCCCT_
6237l5~TGTAATGAGTATGAGTTGTAG, TTGAGTCGTTGACATGTGGGA 625024~GAGTGAGATTGTCTCCTC, GGCACTAAGGCTTTGCA 62505ΓGTACCCCGAATTCTAGTTTGGA, GACAAATCTATTTATATCCTAC 625067TCCACAAGACTGATACCTG, CAACCTTCACTACCACATG 625070"GCTTACCTAAACTAATAG, GTTCCTAACCAACTATAC 62^939|aCCTAATTTTGGGATTGAGAG, GTGGAATGCAGTTTATCTAAAT
為了驗(yàn)證 OsABCG15 的功能，用特異引物 5’ -TTCTTGGTACCTG ATTAAAAGGAGAG-3’ (下劃
錢(qián)為 Kpn I 切點(diǎn))和 5’ -GCCAAGCTTCGCTTATGCT TACAAGCTGA-3’(下劃線(xiàn)為歷/ d III 切
點(diǎn))以PCR擴(kuò)增OsABCG15全長(zhǎng)cDNA，與玉米泛素基因啟動(dòng)子Pubi連接后克隆到植物轉(zhuǎn)化
雙元載體PCAMBIA1305. I改造的載體。把此載體以農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化方法轉(zhuǎn)化由雜
合體產(chǎn)生的種子(有1/4 H執(zhí)是msll2/msll2純合體)誘導(dǎo)的愈傷組織。從獲得的Ttl轉(zhuǎn)化
體用分子標(biāo)記625051 (表I)篩選出2個(gè)純合體，它們的花藥發(fā)育正常并產(chǎn)生
可育花粉(圖3D)。此結(jié)果證明是具有育性功能的目標(biāo)基因，突變基因osabcgl5(SEQ ID No. I)的功能缺失導(dǎo)致小孢子早期不能正常發(fā)育而退化，產(chǎn)生無(wú)花粉型敗育。實(shí)施例2從水稻分離化學(xué)誘導(dǎo)型基因啟動(dòng)子
本發(fā)明用O. 05%丙環(huán)唑和O. 05%腈菌唑混合水溶液施加到水稻葉片，24h后取處理和對(duì)照的減數(shù)分裂期至小孢子期的花藥，提取RNA。利用水稻全基因組表達(dá)芯片(OsAfTx)雜交(由博奧生物有限公司完成)篩查，發(fā)現(xiàn)I個(gè)基因探針(OsAffx. 13615. I. Sl_at)代表的基因在非處理樣品的表達(dá)水平很低，而在處理樣品的表達(dá)水平大大高于非處理對(duì)照。進(jìn)一步用定量RT-PCR驗(yàn)證，證實(shí)其本底表達(dá)較低，而丙環(huán)唑或腈菌唑可提高其表達(dá)水平，這2種誘導(dǎo)劑共用的表達(dá)水平更高(圖4)。實(shí)施例3水稻雄性育性可控系的構(gòu)建
以特異引物 5 ’ -CTTGAGGCCGGCCTAAATTATTATTTTTCCAATATTTA-3，(下劃線(xiàn)為 Ae I 切點(diǎn))和TCAGGTACCGATCGGTGATCCCTCCTCAA-3> (下劃線(xiàn)為式I切點(diǎn))從水稻基因組PCR擴(kuò)增所述的啟動(dòng)子序列；用5 ’ -GATCGGTACCTGATTAAAAGGAGAGA AG-3 ’(下劃線(xiàn)為Kpn I切點(diǎn))和5 ’ -GGAGGATCCAGACCTCGCGCA-3 ’ (下劃線(xiàn)為BanM I切點(diǎn))PCR擴(kuò)增野生型 OsABCG15 近全長(zhǎng) cDNA 編碼序列；以 5’ -CTCT GGATCCTCCTCGCCATGGC-3，(下劃線(xiàn)為I 切點(diǎn))和 5’ -CCTACTCGAG CTCCCTGCAGGTGAGGA-3’ (下劃線(xiàn)為 Xho I 切點(diǎn))PCR 擴(kuò)增0sABCG15的小部分cDNA編碼序列和3’終止子序列。將這3個(gè)片段用所示的限制性?xún)?nèi)切酶切出粘性末端，連接成重組基因表達(dá)盒結(jié)構(gòu)(圖5)，其DNA序列如SEQ ID No. 6所示。將此表達(dá)盒序列克隆到基于可轉(zhuǎn)化人工染色體載體(Lin等2003，PNAS，100, 5962-5967)的改造載體。將含有此重組基因表達(dá)盒的載體以農(nóng)桿菌介導(dǎo)方法(Hiei等，199A PlantJ. 6，271-282)轉(zhuǎn)化導(dǎo)入所述的雄性不育突變系，獲得轉(zhuǎn)化體。將轉(zhuǎn)化體與I個(gè)秈稻品系TB雜交，并以TB為輪回親本回交3代，選育出偏秈型的雄性育性可控系HNLS-I。每次回交時(shí)以引物組 5’ -CCTGTTCCATCGAGGAGT-3’ /5’ -CTCAACAATGGCCATCTCCA-3’ 以及5’ -CTCGGCCTCCTCTGGTGGAAGT-3’ / 5’ -CGGCTGCCGCAGTTGTAGGT-3 ’ 篩選含有轉(zhuǎn)基因和內(nèi)源突變基因的個(gè)體作為回交的母本。實(shí)施例4水稻雄性育性可控系的繁殖
在雄性育性可控系的花藥減數(shù)分裂期至單核小孢子期，以O(shè). 05%丙環(huán)唑或O. 05%腈菌唑或O. 05%丙環(huán)唑+0. 05%腈菌唑混合水溶液噴施到葉片，3天后重施一次。結(jié)果表明，單獨(dú)使用丙環(huán)唑或腈菌唑的自交結(jié)實(shí)率約為60%，將2種誘導(dǎo)劑混用的自交結(jié)實(shí)率約為86% (圖6)。實(shí)施例5用水稻雄性育性可控系進(jìn)行雜交制種
將本發(fā)明育成的水稻雄性育性可控系與I個(gè)秈稻品系HNLR-I按12:2的比例種植，在抽穗楊花時(shí)輔以人工趕花粉以提高雜交率，獲得Fl雜交種子(結(jié)實(shí)率約55%)。Fl雜種植株的花粉正?？捎越唤Y(jié)實(shí)率達(dá)到約90% (圖7)。
權(quán)利要求
1.一種水稻雄性育性可控系的構(gòu)建方法，包括 Ca)獲得水稻雄性育性基因的不育突變系和相應(yīng)的雄性育性基因； (b)構(gòu)建由誘導(dǎo)型啟動(dòng)子控制的雄性育性基因表達(dá)盒轉(zhuǎn)化載體； (c)以所述表達(dá)盒轉(zhuǎn)化載體轉(zhuǎn)化所述不育突變系，獲得水稻雄性育性可控系。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的構(gòu)建方法，其中所述水稻雄性不育突變系為自然突變或人工誘變產(chǎn)生的隱性不育突變系。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的構(gòu)建方法，其中所述水稻雄性不育突變系為孢子體型雄性不育突變系。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的構(gòu)建方法，其中所述雄性育性基因?yàn)榭苫謴?fù)所述雄性不育系的花粉育性的基因，該基因是所述雄性不育系的突變育性基因的功能型等位基因。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的構(gòu)建方法，所述誘導(dǎo)型啟動(dòng)子是化學(xué)誘導(dǎo)啟動(dòng)子。
6.根據(jù)權(quán)利要求I所述的構(gòu)建方法，其中所述雄性不育突變系為保藏編號(hào)為CCTCCP201207的雄性不育突變系，其功能缺失突變型育性基因的基因組DNA序列如SEQ ID No. I所示。
7.根據(jù)權(quán)利要求I所述的構(gòu)建方法，其中所述雄性育性基因的基因組DNA序列如SEQID No. 2所示，或所述雄性育性基因的cDNA序列如SEQ ID No. 3所示。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其中所述雄性育性基因編碼的蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No. 4 所示。
9.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其中所述化學(xué)誘導(dǎo)啟動(dòng)子的DNA序列如SEQID No. 5所示。
10.一種育種方法，其包括 Ca)向權(quán)利要求I所述的水稻雄性育性可控系施加誘導(dǎo)劑，使得功能型雄性育性基因表達(dá)，以恢復(fù)花粉育性，進(jìn)行自交繁殖；或 (b)在自然條件下將權(quán)利要求I所述的水稻雄性育性可控系與正常可育的父本品系按適當(dāng)比例種植，從而與父本進(jìn)行雜交獲得雜交種子。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的育種方法，其中所述誘導(dǎo)劑含有作為有效成分的丙環(huán)唑或腈菌唑或兩者的組合。
12.根據(jù)權(quán)利要求10所述的育種方法，其中在步驟(a)中，在花藥發(fā)育期向所述水稻雄性育性可控系施加誘導(dǎo)劑。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的育種方法，其中花藥發(fā)育期為減數(shù)分裂期至小孢子發(fā)育期。
14.一種重組基因表達(dá)盒，其核苷酸序列如SEQ ID No. 6所示。
15.一種轉(zhuǎn)化載體，其包含權(quán)利要求14所述的重組基因表達(dá)盒。
全文摘要
本發(fā)明提供一種水稻雄性育性可控系的構(gòu)建方法，包括(a)獲得水稻雄性育性基因的不育突變系和相應(yīng)的功能型雄性育性基因；(b)構(gòu)建由誘導(dǎo)型啟動(dòng)子控制的功能型雄性育性基因表達(dá)盒轉(zhuǎn)化載體；(c)以所述表達(dá)盒轉(zhuǎn)化載體轉(zhuǎn)化所述不育突變系，獲得水稻雄性育性可控系。本發(fā)明創(chuàng)制的雄性育性可控系可利用相應(yīng)的誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)重組育性基因表達(dá)，使其可育自交繁殖；不施加誘導(dǎo)劑時(shí)表現(xiàn)完全雄性不育，因而可與父本雜交生產(chǎn)雜交種子。此育種方法克服了基于細(xì)胞質(zhì)雄性不育的三系雜交稻和基于光溫敏不育系的二系雜交稻育種以及其它基因工程方法創(chuàng)制不育系方法的缺點(diǎn)。
文檔編號(hào)A01H1/02GK102925478SQ201210339978
公開(kāi)日2013年2月13日 申請(qǐng)日期2012年9月14日 優(yōu)先權(quán)日2012年9月14日
發(fā)明者劉耀光, 牛百曉, 王平, 祝欽瀧, 林玉茹 申請(qǐng)人:華南農(nóng)業(yè)大學(xué)