老鴉瓣無性快繁體系的建立方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種老鴉瓣無性快繁體系的建立方法，包括步驟：準(zhǔn)備外植體、外植體消毒、初代誘導(dǎo)、誘導(dǎo)愈傷組織、生成不定芽、叢生芽增殖和壯苗、誘導(dǎo)具鱗莖試管苗、誘導(dǎo)試管鱗莖。本發(fā)明以冷藏芯芽為初始外植體，利用產(chǎn)生的中間繁殖體材料芽莖和鱗芽，分別經(jīng)愈傷組織途徑和器官發(fā)生途徑獲得叢生芽；可以通過愈傷組織和芽的循環(huán)增殖來提高老鴉瓣的繁殖系數(shù)；得到帶根的基部膨大試管苗和試管鱗莖，有利于提高移栽成活率、提高耐貯藏、耐運輸能力和縮短繁殖周期，且方法簡單，成本較低，適宜于生產(chǎn)應(yīng)用，對實現(xiàn)老鴉瓣的可持續(xù)利用具有重要意義。
【專利說明】老鴉瓣無性快繁體系的建立方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于中藥材栽培【技術(shù)領(lǐng)域】，具體地說，本發(fā)明涉及一種老鴉瓣無性快繁體系的建立方法。
【背景技術(shù)】
[0002]老鴉瓣Tulipa edulis (Miq.)Baker.為百合科(Liliaceae)郁金香屬(TulipaL.)藥用植物，分布于江蘇、安徽、浙江、江西、湖北、湖南、遼寧、山東和陜西等省，朝鮮和日本也有分布。其除去膜質(zhì)皮及絨毛后的干燥鱗莖為中藥材光慈菇。據(jù)本草考證，老鴉瓣歷史上曾長期作為中藥材山慈菇的主要基原植物。傳統(tǒng)中醫(yī)認(rèn)為，光慈菇味甘、辛，性寒，有小毒，清熱解毒，散結(jié)消腫，主治咽喉腫痛、瘰疬結(jié)核，瘀滯疼痛，癰癤腫毒，蛇蟲咬傷。目前也是治療多種腫瘤的常用藥，如咽喉癌、淋巴瘤、乳腺癌等。
[0003]野外觀察發(fā)現(xiàn)老鴉瓣生長期短，地上莖葉生長時間IOOd左右。有性繁殖存在“花而不實”現(xiàn)象，種子自然萌發(fā)率低。無性繁殖通過母鱗莖鱗片上的腋芽、母鱗莖基部芽莖等進行，但母鱗莖存在更替現(xiàn)象，當(dāng)年母鱗莖消失，導(dǎo)致繁殖系數(shù)偏低。目前光慈菇藥材主要來源于野生，已滿足不了市場需求，急需一種快速繁殖老鴉瓣的技術(shù)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]基于此，本發(fā)明提供了一種老鴉瓣無性快繁體系的建立方法。
[0005]一種老鴉瓣無性快繁體系的建立方法，包括以下步驟:
[0006](1)外植體準(zhǔn)備
[0007]7月底至8月上旬采集自然休眠的老鴉瓣鱗莖，沖洗，于0~2°C進行濕沙冷藏層積處理，3.5~4.5個月取出作為外植體；
[0008](2)外植體消毒
[0009]取外植體，除去絨毛層，飽和洗衣粉溶液清洗后，剖取保留完整基部的芯芽，先用酒精，再用升汞浸泡消毒，無菌水沖洗，吸干表面水分，備用；
[0010](3)初代誘導(dǎo)
[0011]將消毒后的外植體接種于初代誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，1~2個月后形成鱗芽和芽莖；所述初代誘導(dǎo)培養(yǎng)基為:含蔗糖30g.L_\瓊脂5-7g.\ρΗ5-6的MS培養(yǎng)基；所述初代誘導(dǎo)的培養(yǎng)條件為:光照1500-30001x，溫度22±1°C，光照時間8_16h/d，濕度70%~80% ;
[0012](4)誘導(dǎo)愈傷組織、生成不定芽
[0013]將芽莖切段接種于愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)，30~50天得到愈傷組織；將愈傷組織接種于繼代增殖培養(yǎng)基中進行繼代增殖；1~2個月后將增殖后的芽莖愈傷組織切塊接種于不定芽分化培養(yǎng)基中培養(yǎng)2-3個月，完成不定芽、叢生芽分化，生成不定芽和叢生芽；所述愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基為:含6-BA 0.5-1.0mg.L' NAA1.0-2.0mg.L'蔗糖30g.L—1、瓊脂5-7g.L—1、pH5-6的MS培養(yǎng)基；所述愈傷組織繼代增殖培養(yǎng)基為:含6-BA
0.2-1.0mg.L'NAA 0.5-2.0mg.L'蔗糖 30g.L'瓊脂 5_7g.L'pH5_7 的 MS 培養(yǎng)基；所述愈傷組織不定芽分化培養(yǎng)基為:含6-BA1.0-2.0mg-T1,NAA 0-0.5mg ?Ι/1、蔗糖30g瓊脂5-7g.L-1、pH5-6的MS培養(yǎng)基；
[0014]或者將鱗芽接入不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，直接誘導(dǎo)生成不定芽；所述不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基為:含 6-BA 0.5_2mg.L \ NAA 0.01-0.5mg.L、鹿糖 30g.L \瓊脂 5_7g.L \ pH5-6的MS培養(yǎng)基；
[0015](5)增殖和壯苗
[0016]將步驟(4)獲得的不定芽中的細(xì)弱不定芽轉(zhuǎn)入增殖培養(yǎng)基中增殖，得到再生不定芽，再轉(zhuǎn)入壯苗培養(yǎng)基中壯苗得到生根的基部膨大的試管苗，即為老鴉瓣無性快繁體系；
[0017]將步驟(4)獲得的不定芽中的短壯不定芽直接轉(zhuǎn)入壯苗培養(yǎng)基中進行壯苗，得到生根的基部膨大的試管苗，即為老鴉瓣無性快繁體系；
[0018]所述不定芽增殖培養(yǎng)基為:含6-BA 0.2~1.0mg.L-1、NAA 0-0.2mg.L-1、蔗糖30g 瓊脂5-7g.L'pHS-e的MS培養(yǎng)基；所述壯苗培養(yǎng)基為:含6-BA0-0.2mg.L'NAA0-0.2mg.L-1、蔗糖 30g.L-1、瓊脂 5-7.L-1、pH5_6 的 MS 培養(yǎng)基；
[0019]經(jīng)壯苗后的不定芽或試管苗的根呈黃白色，含白色根毛，根數(shù)一般為6-10條；
[0020](6)誘導(dǎo)基部膨大呈鱗莖狀的試管苗
[0021]將步驟⑶中的鱗芽和芽莖接入含蔗糖30g.ΙΛ瓊脂5_7g.?ΛρΗ5_6的MS培養(yǎng)基中培養(yǎng)，1.5~2.5個月后，芽莖頂端直接形成小鱗莖或芽莖頂端爆開形成粗壯試管苗，鱗芽直接形成試管苗；1.5~2.5個月后形成基部膨大呈鱗莖狀的試管苗，即為老鴉瓣無性快繁體系；
[0022](7)誘導(dǎo)試管鱗莖
[0023]將步驟(4)中增殖得到的叢生芽于3_6°C暗處理1-3個月后，轉(zhuǎn)入含30_90g.L_1鹿糖的無激素MS培養(yǎng)基中，于22-24°C、光照8-16h/d培養(yǎng)2_3個月，得到膨大、成熟的試管鱗莖，即為老鴉瓣無性快繁體系。
[0024]以上經(jīng)步驟(1)-(7)獲得的生根的基部膨大的試管苗、基部膨大呈鱗莖狀的試管苗和典型膨大、成熟的試管鱗莖的方法即為老鴉瓣無性快繁體系的建立過程。
[0025]在其中一個實施例中，步驟(1)中，所述濕沙冷藏層積處理為:將鱗莖與滅過菌的河沙以1: 2-4的體積比混勻后放入不完全密封的自封袋中，所述河沙的含水量為6wt %~8wt%。自封袋不密閉，使鱗莖能透氣。河沙的含水量保持在6wt%~8wt%的范圍，此時，河沙用手攥就成團，手松開沙團就裂開。
[0026]在其中一個實施例中，步驟(3)中，所述初代誘導(dǎo)培養(yǎng)基為:含蔗糖30g 瓊脂6.5g.L' ρΗ5.8 的 MS 培養(yǎng)基。
[0027]在其中一個實施例中，步驟⑷中，所述愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基為:含
6-BA0.5mg.I71、NAA 2.0mg.L'鹿糖 30g.I71、瓊月旨 6.5g.L' pH5.8 的 MS 培養(yǎng)基；所述愈傷組織繼代增殖培養(yǎng)基為:含6-BA 0.5mg.L' NAA 2.0mg.L_\蔗糖30g.L_\瓊脂
6.5g.L' pH5.8的MS培養(yǎng)基；所述愈傷組織不定芽分化培養(yǎng)基為:含6-BA 2mg.L' NAA
0.2mg.L'蔗糖30g.L'瓊脂6.5g.L' pH5.8的MS培養(yǎng)基；所述鱗芽不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基為:含 6-BA Img.I71、NAA 0.01mg.L'鹿糖 30g.I71、瓊月旨 6.5g.I71、pH5.8 的 MS 培養(yǎng)基。
[0028]在其中一個實施例中，所述步驟(4)中用于誘導(dǎo)愈傷組織的芽莖為短縮芽莖的芽莖頂端，用于增殖的愈傷組織為愈傷組織類型II。
[0029]在其中一個實施例中，步驟(5)中，所述不定芽增殖培養(yǎng)基為:含6-BA 0.2~
0.5mg.L' NAA 0.2mg.L'蔗糖 30g.L'瓊脂 6.5g.L' pH5.8 的 MS 培養(yǎng)基；所述壯苗培養(yǎng)基為:含 6-BA Omg.L'NAA 0.2mg.L'鹿糖 30g.I71、瓊月旨 6.5g.L'pH5.8 的 MS 培養(yǎng)基。
[0030]在其中一個實施例中，步驟(6)中所述培養(yǎng)基為含蔗糖30g.L'瓊脂6.5g.L'pH5.8的MS培養(yǎng)基。
[0031]在其中一個實施例中，步驟(7)中所述試管鱗莖誘導(dǎo)的處理方法為:將步驟(4)中增殖得到的叢生芽于5°C暗處理2-3個月后，轉(zhuǎn)入含60g.L-1蔗糖的無激素MS培養(yǎng)基中，于23°C、光照16h/d培養(yǎng)2-3個月，得到膨大、成熟的試管鱗莖。
[0032]本發(fā)明通過快速篩選不同外植體、培養(yǎng)基激素配比和多種誘導(dǎo)途徑，建立老鴉瓣無性快繁體系，使冷藏后的老鴉瓣芯芽外植體在約30-40d誘導(dǎo)出芽莖，芽莖經(jīng)約20-40d誘導(dǎo)出愈傷組織，愈傷組織約1-2個月分化出叢生芽；叢生芽在2-3個月內(nèi)通過增殖和壯苗得到基部膨大的試管苗；增殖后的叢生芽低溫處理2-3個月后，轉(zhuǎn)無激素培養(yǎng)基培養(yǎng)2-3個月形成典型、成熟試管鱗莖。也可通過冷藏芯芽形成的芽莖中間體直接誘導(dǎo)光滑小鱗莖或經(jīng)鱗芽中間體直接長成基部膨大的試管苗。
[0033]本發(fā)明具有以下有益效果:
[0034]本發(fā)明的老鴉瓣無性快繁體系的建立方法是以冷藏芯芽為初始外植體，利用產(chǎn)生的中間繁殖體材料芽莖和鱗芽，分別經(jīng)愈傷組織途徑和器官發(fā)生途徑獲得叢生芽；芽莖的愈傷組織途徑可通過愈傷組織增殖提高繁殖系數(shù)，且芽莖材料可經(jīng)愈傷組織分化重新獲得，減少了初始外植體的嚴(yán)重污染問題；鱗芽的器官發(fā)生途徑可直接再生不定芽，既縮短了芽誘導(dǎo)程序和時間，又避免了愈傷組織途徑可能帶來的變異率高的缺點；通過變溫過程及合適的培養(yǎng)基得到試管鱗莖，提高了耐貯藏、耐運輸能力和移栽成活率。
[0035]本發(fā)明的老鴉瓣無性快繁體系的建立方法可以通過愈傷組織和芽的循環(huán)增殖來提高老鴉瓣的繁殖系數(shù)；得到帶根的基部膨大呈鱗莖狀試管苗和典型、成熟試管鱗莖，有利于提高移栽成活率、提高耐貯藏、耐運輸能力和縮短繁殖周期，且方法簡單，成本較低，適宜于生產(chǎn)應(yīng)用，對實現(xiàn)老鴉瓣的可持續(xù)利用具有重要意義。
【具體實施方式】
[0036]以下通過具體實施例來詳細(xì)說明本發(fā)明。
[0037]實施例1老鴉瓣無性快繁體系的建立方法
[0038]包括以下步驟:
[0039](I)外植體準(zhǔn)備
[0040]7月底至8月上旬采集自然休眠的老鴉瓣鱗莖，洗去泥沙，浙干水分，400倍液50 %多菌靈可稀釋粉劑浸泡20~30min，清水洗去藥液，室內(nèi)晾3~5d，將鱗莖與經(jīng)135°C干熱滅菌4h的濕河沙以體積比1: 3混勻，放于不完全密封的自封袋中在O~2 °C溫度條件下冷藏保存。4個月后取出作為外植體。
[0041](2)外植體消毒
[0042]取冷藏后的老鴉瓣鱗莖外植體，除去絨毛層，飽和洗衣粉溶液清洗3次，剖取保留完整基部的芯芽，飽和洗衣粉溶液清洗3次，自來水沖洗I~2h，超凈工作臺上吸干芯芽表面水分，75%酒精消毒30~40s, 0.1 %升萊消毒18min,無菌水沖洗5~6遍,無菌吸水紙吸干表面水分，備用。
[0043](3)初代誘導(dǎo)
[0044]將消毒后的外植體接種于初代誘導(dǎo)培養(yǎng)基(含蔗糖30g I1、瓊脂6.5g.?ΛρΗ5.8的MS培養(yǎng)基)中，培養(yǎng)條件為光照20001x，溫度22±1°C，光照時間12h/d，濕度70%~80%,40天后形成鱗芽和芽莖；(其他階段如不特殊說明，培養(yǎng)條件均同初代誘導(dǎo)階段)。
[0045](4)誘導(dǎo)愈傷組織、生成不定芽
[0046]取短縮芽莖頂端作為初代誘導(dǎo)外植體，分割成Icm切段接入愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基(含 6-BA 0.5mg.L'NAA 2.0mg.L'鹿糖 30g.L'瓊月旨 6.5g.L'pH5.8 的 MS 培養(yǎng)基)中，40天后得到愈傷組織；將愈傷組織類型II接入繼代培養(yǎng)基(含6-BA 0.5mg.L' NAA
2.0mg.L-1、蔗糖30g.L-1、瓊脂6.5g.L-1、ρΗ5.8的MS培養(yǎng)基)中繼代增殖；1~2個月后再轉(zhuǎn)入不定芽分化培養(yǎng)基(含6-BA 2mg ?L'NAA0.2mg ?Ι/1、蔗糖30g 瓊脂6.5g.?ΛpH5.8的MS培養(yǎng)基)中進行不定芽分化，生成不定芽；
[0047]或者將鱗芽接入不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基(含6-BA Img.L' NAA 0.01mg.L_\蔗糖30g.L-1、瓊脂6.5g.L-1、ρΗ5.8的MS培養(yǎng)基)中，直接誘導(dǎo)生成不定芽；
[0048](5)增殖和壯苗
[0049]將步驟(4)獲得的不定芽中的細(xì)弱不定芽轉(zhuǎn)入增殖培養(yǎng)基(含6-ΒΑ 0.2~
0.5mg.L-1、NAA 0.2mg.L-1、蔗糖 30g.L-1、瓊脂 6.5g.L-1、pH5.8 的 MS 培養(yǎng)基)中增殖，得到叢生不定芽，再轉(zhuǎn)入壯苗培養(yǎng)基(含6-BA Omg.L'NAA 0.2mg.L_\蔗糖30g.L'瓊脂6.5g.L' pH5.8的MS培養(yǎng)基)中壯苗得到生根的基部膨大的試管苗；
[0050]將步驟(4)獲得的不定芽中的短壯不定芽或增殖后的叢生芽直接轉(zhuǎn)入壯苗培養(yǎng)基(含 6-BA Omg.L'NAA 0.2mg.L'鹿糖 30g.I71、瓊月旨 6.5g.L'pH5.8 的 MS 培養(yǎng)基)中壯苗得到生根的基部膨大的試管苗；
[0051]經(jīng)壯苗后的不定芽或試管苗的根呈黃白色，含白色根毛，根數(shù)一般為6-10條；
[0052](6)誘導(dǎo)基部膨大呈鱗莖狀的試管苗
[0053]將步驟⑶中的鱗芽和芽莖接入含蔗糖30g.ΙΛ瓊脂6.5g.?ΛρΗ5.8的MS培養(yǎng)基中培養(yǎng)，1.5~2.5個月后，芽莖頂端直接形成小鱗莖或芽莖頂端爆開形成粗壯試管苗，鱗芽直接形成試管苗；1.5~2.5個月后形成基部膨大呈鱗莖狀的試管苗；
[0054](7)誘導(dǎo)試管鱗莖
[0055]將步驟(4)中增殖得到的叢生芽于5°C暗處理2-3個月后，轉(zhuǎn)入含60g.L-1蔗糖的無激素MS培養(yǎng)基中，于23°C、光照16h/d培養(yǎng)2-3個月，得到膨大、成熟的試管鱗莖，即為老鴉瓣無性快繁體系。
[0056]經(jīng)以上步驟(1)-(7)獲得的生根的基部膨大的試管苗、基部膨大呈鱗莖狀的試管苗和典型膨大、成熟試管鱗莖的過程即為老鴉瓣無性快繁體系的建立方法。
[0057]試驗例I
[0058]以下通過比較不同的外植體、培養(yǎng)基和多種誘導(dǎo)途徑，來篩選老鴉瓣無性快繁體系的最合適的建立方法。
[0059](I)不同外植體愈傷組織和不定芽的誘導(dǎo)情況(篩選芽莖愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基和鱗芽不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基)
[0060]將不同外植體接入不同的培養(yǎng)基中，40天后統(tǒng)計愈傷組織和不定芽誘導(dǎo)率，其中，愈傷組織誘導(dǎo)率)=形成愈傷組織的外植體數(shù)/接種的芽莖切段數(shù)X100;不定芽誘導(dǎo)率(％ )=形成不定芽的外植體數(shù)/接種的鱗芽單芽數(shù)XlOO ;不定芽數(shù)(個/外植體)=形成的不定芽總數(shù)/接種的鱗芽單芽總數(shù)。結(jié)果見表1。
[0061]表1不同外植體愈傷組織和不定芽誘導(dǎo)情況(T =、η = 2)
【權(quán)利要求】
1.一種老鴉瓣無性快繁體系的建立方法，其特征在于，包括以下步驟: (1)外植體準(zhǔn)備 采集自然休眠的老鴉瓣鱗莖，沖洗消毒，于O~2°C進行濕沙冷藏層積處理，3.5~4.5個月取出作為外植體； (2)外植體消毒 除去外植體絨毛層，飽和洗衣粉溶液清洗后，剖取保留完整基部的芯芽，先用酒精，再用升汞浸泡消毒，無菌水沖洗，吸干表面水分； (3)初代誘導(dǎo) 將消毒后的外植體接種于初代誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)，I~2個月后形成鱗芽和芽莖；所述初代誘導(dǎo)培養(yǎng)基為:含蔗糖30g.L_\瓊脂5-7g·L-1、ρΗ5-6的MS培養(yǎng)基；所述初代誘導(dǎo)的培養(yǎng)條件為:光照1500-30001x，溫度22±1°C，光照時間8_16h/d，濕度70%~80% ; (4)誘導(dǎo)愈傷組織、生成不定芽 將芽莖切段接種于愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)，30~50天得到愈傷組織；將愈傷組織接種于繼代增殖培養(yǎng)基中進行繼代增殖；1~2個月后將增殖后的芽莖愈傷組織切塊接種于不定芽分化培養(yǎng)基中培養(yǎng)2-3個月，完成不定芽、叢生芽分化，生成不定芽和叢生芽；所述愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基為:含6-BA 0.5-1.0mg·L-1,NAA1.0-2.0mg.L-1、蔗糖30g 瓊脂5-7g.·L-1、ρΗ5-6的MS培養(yǎng)基；所述愈傷組織繼代增殖培養(yǎng)基為:含6-BA 0.2-1.0mg.L—1、NAA 0.5-2.0mg.L-1、蔗糖30g.L-1、瓊脂5_7g·L-1、ρΗ5_7的MS培養(yǎng)基；所述愈傷組織不定芽分化培養(yǎng)基為:含 6-ΒΑ1.0-2.0mg·L-1NAA 0-0.5mg·L-1、蔗糖 30g·L-1瓊脂 5_7g·L-1、PH5-6的MS培養(yǎng)基； 或者將鱗芽接入不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，直接誘導(dǎo)生成不定芽；所述不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基為:含 6-BA 0.5-2.0mg·L-1、 NAA 0.01-0.5mg·L-1、鹿糖 30g·L-1、瓊脂 5_7g·L-1、 pH5-6 的MS培養(yǎng)基； (5)增殖和壯苗 將步驟(4)獲得的不定芽中的細(xì)弱不定芽轉(zhuǎn)入增殖培養(yǎng)基中增殖，得到再生不定芽，再轉(zhuǎn)入壯苗培養(yǎng)基中壯苗得到生根的基部膨大的試管苗，即為老鴉瓣無性快繁體系； 將步驟(4)獲得的不定芽中的短壯不定芽直接轉(zhuǎn)入壯苗培養(yǎng)基中進行壯苗，得到生根的基部膨大的試管苗，即為老鴉瓣無性快繁體系； 所述不定芽增殖培養(yǎng)基為:含6-BA 0.2~1.0mg·L-1、NAA 0-0.2mg·L-1蔗糖30g 瓊脂5-7g·L-1、pHS-e的MS培養(yǎng)基；所述壯苗培養(yǎng)基為:含6-BA0-0.2mg·L-1、NAAo-0.2mg.L-1、蔗糖 30g.L-1、瓊脂 5-7.L-1、pH5_6 的 MS 培養(yǎng)基； (6)誘導(dǎo)基部膨大呈鱗莖狀的試管苗 將步驟(3)中的鱗芽和芽莖接入含蔗糖30g.L—1、瓊脂5-7g.L—1、pH5-6的MS培養(yǎng)基中培養(yǎng)，1.5~2.5個月后，芽莖頂端直接形成小鱗莖或芽莖頂端爆開形成粗壯試管苗，鱗芽直接形成試管苗；1.5~2.5個月后形成基部膨大呈鱗莖狀的試管苗，即為老鴉瓣無性快繁體系； (7)誘導(dǎo)試管鱗莖 將步驟⑷中增殖得到的叢生芽于3-6°C暗處理1-3個月后，轉(zhuǎn)入含30-90g·L-1蔗糖的無激素MS培養(yǎng)基中，于溫度22-24°C、光照8-16h/d條件培養(yǎng)2_3個月，得到膨大、成熟的試管鱗莖，即為老鴉瓣無性快繁體系。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的老鴉瓣無性快繁體系的建立方法，其特征在于，步驟(4)中，所述愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基為:含6-BA 0.5mg.L-1' NAA 2.0mg.L'蔗糖30g.L'瓊脂6.5g.L' ρΗ5.8 的 MS 培養(yǎng)基。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的老鴉瓣無性快繁體系的建立方法，其特征在于，步驟(4)中，所述愈傷組織繼代增殖培養(yǎng)基為:含6-ΒΑ 0.5mg.L'NAA 2.0mg.L_\蔗糖30g.L_\瓊脂6.5g.L' ρΗ5.8 的 MS 培養(yǎng)基。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的老鴉瓣無性快繁體系的建立方法，其特征在于，步驟(4)中，所述愈傷組織不定芽分化培養(yǎng)基為:含6-BA 2.0mg.L' ΝΑΑ0.2mg.L_\蔗糖30g.L'瓊脂 6.5g.L-1、ρΗ5.8 的 MS 培養(yǎng)基。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的老鴉瓣無性快繁體系的建立方法，其特征在于，步驟(4)中，所述鱗芽不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基為:含6-BA 1.0mg.L' ΝΑΑ0.01mg.L_\蔗糖30g.L_\瓊脂6.5g.L' ρΗ5.8 的 MS 培養(yǎng)基。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的老鴉瓣無性快繁體系的建立方法，其特征在于，步驟(5)中，所述不定芽增殖培養(yǎng)基為:含6-BA 0.2~0.5mg.L'NAA 0.2mg.L_\蔗糖30g.L_\瓊脂6.5g.L' pH5.8的MS培養(yǎng)基；所述壯苗培養(yǎng)基為:含ΝΑΑ0.2mg.L_\蔗糖30g.L'瓊脂6.5g.L' ρΗ5.8 的 MS 培養(yǎng)基。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的老鴉瓣無性快繁體系的建立方法，其特征在于，步驟(J)中，所述試管鱗莖的誘導(dǎo)方法為:將步驟(4)中增殖得到的叢生芽于5°C暗處理2-3個月后，轉(zhuǎn)入含60g.L-1蔗糖的無激素MS培養(yǎng)基中，于23°C、光照16h/d培養(yǎng)2_3個月，得到膨大、成熟的試管鱗莖。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的老鴉瓣無性快繁體系的建立方法，其特征在于，所述步驟(4)中用于誘導(dǎo)愈傷組織的芽莖為短縮芽莖的芽莖頂端，用于增殖的愈傷組織為愈傷組織類型II。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的老鴉瓣無性快繁體系的建立方法，其特征在于，步驟(3)中，所述初代誘導(dǎo)培養(yǎng)基為:含蔗糖30g.L'瓊脂6.5g.L' pH5.8的MS培養(yǎng)基。
10.根據(jù)權(quán)利要求1-9任一項所述的老鴉瓣無性快繁體系的建立方法，其特征在于，步驟(I)中，所述濕沙冷藏層積處理為:將鱗莖與滅過菌的河沙以1: 2-4的體積比混勻后放入不完全密封的自封袋中，所述河沙的含水量為6wt %~8wt %。
【文檔編號】A01H4/00GK103621401SQ201210311564
【公開日】2014年3月12日 申請日期:2012年8月28日 優(yōu)先權(quán)日:2012年8月28日
【發(fā)明者】郭巧生, 徐紅建, 馬宏亮, 朱再標(biāo), 趙桂華, 鄒琦, 蘇碧茹, 鄧慧敏, 賴曉明 申請人:廣州白云山中一藥業(yè)有限公司