專利名稱：結球甘藍組織培養(yǎng)方法
技術領域：
本發(fā)明屬于組織培養(yǎng)，特別是指一種結球甘藍組織培養(yǎng)方法。
背景技術：
結球甘藍種子昂貴，又具有較長的苗齡期，為提高土地利用率，實踐中多采用先育苗然后移栽定植的方法。由于結球甘藍的幼苗為直根系，須根較少，不利于根部對營養(yǎng)物質和水分的吸收，移栽定植后生長緩慢，不耐水澇及根部病害，產量也不高。近年來，隨著農業(yè)機械化的快速發(fā)展，精量播種、穴盤育苗、移栽機定植已引入結球甘藍栽培，如何消除其上述的栽培缺陷、提高結球甘藍產量，成為人們亟待解決的技術難題。目前，結球甘藍的組織培養(yǎng)技術在甘藍雄性不育系無性快繁、優(yōu)異稀有種質資源離體繁殖與保存、游離小孢子培養(yǎng)、細胞及原生質體培養(yǎng)中發(fā)揮重要的作用，尤其在結球甘 藍組培苗快速繁殖過程中應用居多。但利用目前結球甘藍組織培養(yǎng)常用技術及在現(xiàn)有的結球甘藍組織培養(yǎng)基上長期培養(yǎng)組培苗，容易造成組培苗逐漸衰退、喪失形態(tài)發(fā)生能力，表現(xiàn)為植株弱小、生長不良、增殖率下降。甚至部分組培苗出現(xiàn)玻璃化現(xiàn)象，嫩莖葉柄葉片出現(xiàn)半透明狀和水潰狀，使試管苗生長緩慢，且因其嫩莖不易誘導生根，使繁殖系數(shù)大為降低，玻璃化組培苗莖葉表面無蠟質，體內的極性化合物水平較高，細胞持水力差，植株蒸騰作用強，無法進行正常移栽。長期以往不利于結球甘藍組培苗的繼代培養(yǎng)、長期保存及生根移栽利用。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的在于提供一種結球甘藍組織培養(yǎng)方法，以達到提高組培苗增殖率和生根率的目的。本發(fā)明的整體技術構思是
結球甘藍組織培養(yǎng)方法，包括如下工藝步驟
A、無菌苗的培養(yǎng)將去雜后選出的優(yōu)質結球甘藍種子消毒，將消毒后的種子接種于MS培養(yǎng)基中進行暗培養(yǎng)后制成無菌苗，按照48ml-52ml培養(yǎng)基接種8_10顆種子的接種量接種，培養(yǎng)溫度22°C -26°C，培養(yǎng)濕度70%-80%，培養(yǎng)周期9_12天；
B、誘導培養(yǎng)將暗培養(yǎng)后的無菌苗子葉切成4mmX4mm的塊,將胚軸切成3.6-4. 2 mm,接種在誘導分化培養(yǎng)基上進行誘導培養(yǎng)，觀察外植體在誘導培養(yǎng)過程中的變化和不定芽的誘導情況；誘導分化培養(yǎng)基的組成為
MS+6-BA 2. 0-3. Omg/L, NAA O. 1-0. 2mg/L,蔗糖 25_30g/L，瓊脂 6. 5_7g/L，pH 值=5. 8 ；
誘導培養(yǎng)的培養(yǎng)條件為溫度24°C _26°C，光照強度1000-2000LX，光照時間12小時/天，培養(yǎng)濕度70%-80%，培養(yǎng)周期25-35天；
C、增殖培養(yǎng)將誘導的不定芽接種按照每瓶接種3-4個的接種量接種于體積為48ml-52ml增殖培養(yǎng)基上進行增殖培養(yǎng)制成不定苗，25天繼代I次，連續(xù)繼代3次；增殖培養(yǎng)培養(yǎng)基的組成為
MS+6-BA I. 0-2. Omg/L, NAA O. 1-0. 2mg/L,蔗糖 25_30g/L,瓊脂 6. 5_7g/L，pH 值=5. 8 ； 增殖培養(yǎng)的培養(yǎng)條件為溫度24°C _26°C，光照強度1000-2000LX，光照時間12小時/天，培養(yǎng)濕度70%-80% ；
D、生根培養(yǎng)將不定苗分切后按照每瓶接種3-4個的接種量接種于體積為48ml-52ml生根培養(yǎng)基上進行生根培養(yǎng)，14天后觀察生根情況；生根培養(yǎng)培養(yǎng)基的組成為
1/2MS+NAA O. 1-0. 2mg/L 或 1/2MS+IBA O. 2-0. 3mg/L,蔗糖 15_20g/L，瓊脂 5. 5_6g/L, pH 值=5. 8 ;
生根培養(yǎng)的培養(yǎng)條件為溫度24°C _26°C，光照強度2200-2500 Lx，光照時間10-12小時/天，培養(yǎng)濕度70%-80% ；
E、再生苗的移植
當甘藍組培苗產生根系并形成完整植株后，置于溫室中煉苗，培養(yǎng)條件為溫度200C -25 V，3天后將三角瓶或組培瓶的瓶塞打開，7天后取出，洗去根部瓊脂，將其栽植于培養(yǎng)介質中，濕度為80%-90%，溫度20°C -23°C, 14天后定植于土壤進行正常管理。培養(yǎng)介質選用選用無土材質，一般選用蛭石，也可選用按一定比例復配的沙子、珍珠巖等材質，因其屬于現(xiàn)有技術，申請人再次不再贅述。本發(fā)明的具體技術方案還有
步驟A中所述的去雜是將甘藍種子在流水下沖洗，去掉雜質及灰塵。選種的方式可以采用多種技術方案，并不影響本發(fā)明的實施，其中優(yōu)選的技術方案是，步驟A中所述的選出優(yōu)質結球甘藍種子的步驟為將去雜后的結球甘藍種子浸泡于水中，沉于水底的為優(yōu)質結球甘藍種子。步驟A中所述的消毒是將選出的優(yōu)質結球甘藍種子先用質量百分比為70%的酒精浸泡30秒，再用質量百分比為O. 1%的氯化汞消毒8分鐘，然后無菌水沖洗3-4次。為進一步增強培養(yǎng)的效果，優(yōu)選的技術方案是，步驟A-D中所述的暗培養(yǎng)、誘導培養(yǎng)、增殖培養(yǎng)、生根培養(yǎng)過程中培養(yǎng)室每周在外界空氣質量良好情況下進行3-4小時短時通風。上述短時通風技術手段的采用并不影響本發(fā)明的實現(xiàn)。本發(fā)明所具備的實質性特點和取得的顯著技術進步在于
經實驗表明，采用本發(fā)明的方法在結球甘藍誘導培養(yǎng)基上子葉可長出愈傷組織，胚軸可直接分化不定芽；組培苗增殖倍數(shù)3. 8-4. 6 ;組培苗生長勢強，玻璃化苗數(shù)少，增殖率高；組培苗生根率可達100%。
具體實施例方式以下結合實施例對本發(fā)明做進一步描述，但不作為對本發(fā)明的限定，本發(fā)明的保護范圍以權利要求記載的內容為準，任何依據本說明書所作出的等效技術手段替換，均不脫離本發(fā)明的保護范圍。實施例I
結球甘藍組織培養(yǎng)方法，包括如下工藝步驟
A、無菌苗的培養(yǎng)將去雜后選出的優(yōu)質結球甘藍種子消毒，將消毒后的種子接種于MS培養(yǎng)基中進行暗培養(yǎng)后制成無菌苗，按照48ml培養(yǎng)基接種8顆種子的接種量接種，培養(yǎng)溫度22°C，培養(yǎng)濕度70%，培養(yǎng)周期9-12天；
B、誘導培養(yǎng)將暗培養(yǎng)后的無菌苗子葉切成4mmX4mm的塊,將胚軸切成3.6mm,接種在誘導分化培養(yǎng)基上進行誘導培養(yǎng)，觀察外植體在誘導培養(yǎng)過程中的變化和不定芽的誘導情況；誘導分化培養(yǎng)基的組成為
MS+6-BA 2. Omg/L，NAA O. lmg/L，蔗糖 25g/L,瓊脂 6. 5g/L, pH 值=5. 8 ;
誘導培養(yǎng)的培養(yǎng)條件為溫度24°C，光照強度lOOOLx，光照時間12小時/天，培養(yǎng)濕度70%，培養(yǎng)周期25-35天；
C、增殖培養(yǎng)將誘導的不定芽接種按照每瓶接種3-4個的接種量接種于體積為48ml增殖培養(yǎng)基上進行增殖培養(yǎng)制成不定苗，25天繼代I次，連續(xù)繼代3次；
增殖培養(yǎng)培養(yǎng)基的組成為
MS+6-BA I. Omg/L, NAA O. lmg/L，蔗糖 25g/L,瓊脂 6. 5g/L, pH 值=5. 8 ;
增殖培養(yǎng)的培養(yǎng)條件為溫度24°C，光照強度lOOOLx，光照時間12小時/天，培養(yǎng)濕度
70% ；
D、生根培養(yǎng)將不定苗分切后按照每瓶接種3-4個的接種量接種于體積為48ml-52ml生根培養(yǎng)基上進行生根培養(yǎng)，14天后觀察生根情況；生根培養(yǎng)培養(yǎng)基的組成為
1/2MS+NAA O. lmg/L 或 1/2MS+IBA O. 2mg/L，蔗糖 15g/L,瓊脂 5. 5g/L, pH 值=5. 8 ;
生根培養(yǎng)的培養(yǎng)條件為溫度24°C，光照強度2200LX，光照時間10小時/天，培養(yǎng)濕度
70% ；
E、再生苗的移植
生根20天左右，當甘藍組培苗產生根系并形成完整植株后，置于溫室中煉苗，培養(yǎng)條件為溫度20°C，3天后將三角瓶或組培瓶的瓶塞打開，7天后取出，洗去根部瓊脂，將其栽植于培養(yǎng)介質中，培養(yǎng)介質選用蛭石，濕度為80%，溫度20°C，14天后定植于土壤進行正常管理。實施結果在結球甘藍誘導培養(yǎng)基上子葉可長出愈傷組織，胚軸可直接分化不定芽；組培苗增殖倍數(shù)3.8 ;組培苗生長勢強，玻璃化苗數(shù)少，增殖率高；組培苗生根率可達
100% O實施例2
結球甘藍組織培養(yǎng)方法，包括如下工藝步驟
A、無菌苗的培養(yǎng)將去雜后選出的優(yōu)質結球甘藍種子消毒，將消毒后的種子接種于MS培養(yǎng)基中進行暗培養(yǎng)后制成無菌苗，按照52ml培養(yǎng)基接種10顆種子的接種量接種，培養(yǎng)溫度26°C，培養(yǎng)濕度80%，培養(yǎng)周期9-12天；
B、誘導培養(yǎng)將無菌苗的子葉切成4mmX4mm的塊,將胚軸切成4.2 mm,接種在誘導分化培養(yǎng)基上進行誘導培養(yǎng)，觀察外植體在誘導培養(yǎng)過程中的變化和不定芽的誘導情況；誘導分化培養(yǎng)基的組成為
MS+6-BA 3. 0mg/L, NAA 0. 2mg/L，蔗糖 30g/L,瓊脂 7g/L, pH 值=5. 8 ;
誘導培養(yǎng)的培養(yǎng)條件為溫度26°C，光照強度2000Lx，光照時間12小時/天，培養(yǎng)濕度80%，培養(yǎng)周期25-35天；
C、增殖培養(yǎng)將誘導的不定芽接種按照每瓶接種3-4個的接種量接種于體積為52ml增殖培養(yǎng)基上進行增殖培養(yǎng)制成不定苗，25天繼代I次，連續(xù)繼代3次；
增殖培養(yǎng)培養(yǎng)基的組成為
MS+6-BA 2. Omg/L, NAA O. 2mg/L，蔗糖 30g/L,瓊脂 7g/L, pH 值=5. 8 ;
增殖培養(yǎng)的培養(yǎng)條件為溫度24-26°C，光照強度1000-2000LX，光照時間12小時/天，培養(yǎng)濕度70-80% ；
D、生根培養(yǎng)將不定苗分切后按照每瓶接種3-4個的接種量接種于體積為48ml-52ml生根培養(yǎng)基上進行生根培養(yǎng)，14天后觀察生根情況；生根培養(yǎng)培養(yǎng)基的組成為
1/2MS+NAA O. 2mg/L 或 1/2MS+IBA O. 3mg/L,蔗糖 20g/L,瓊脂 6g/L, pH 值=5. 8 ;
生根培養(yǎng)的培養(yǎng)條件為溫度26°C，光照強度2500 Lx，光照時間12 hr/d，培養(yǎng)濕度
80% ；
E、再生苗的移植
當甘藍組培苗產生根系并形成完整植株后，置于溫室中煉苗，培養(yǎng)條件為溫度25V,3天后將三角瓶或組培瓶的瓶塞打開，7天后取出，洗去根部瓊脂，將其栽植于培養(yǎng)介質中，培養(yǎng)介質選用蛭石，濕度為90%，溫度23°C，14天后定植于土壤進行正常管理。其余步驟同實施例I。實施結果在結球甘藍誘導培養(yǎng)基上子葉可長出愈傷組織，胚軸可直接分化不定芽；組培苗增殖倍數(shù)4.6 ;組培苗生長勢強，玻璃化苗數(shù)少，增殖率高；組培苗生根率可達
100% O實施例3
結球甘藍組織培養(yǎng)方法，包括如下工藝步驟
A、無菌苗的培養(yǎng)將去雜后選出的優(yōu)質結球甘藍種子消毒，將消毒后的種子接種于MS培養(yǎng)基中進行暗培養(yǎng)后制成無菌苗，按照50ml培養(yǎng)基接種8-10顆種子的接種量接種，培養(yǎng)溫度25°C，培養(yǎng)濕度70%-80%，培養(yǎng)周期9-12天；
B、誘導培養(yǎng)將暗培養(yǎng)后的無菌苗的子葉切成4mmX4mm的塊,將胚軸切成4mm,接種在誘導分化培養(yǎng)基上進行誘導培養(yǎng)，觀察外植體在誘導培養(yǎng)過程中的變化和不定芽的誘導情況；誘導分化培養(yǎng)基的組成為
MS+6-BA 2. 5mg/L, NAA O. 15mg/L，蔗糖 28g/L,瓊脂 7g/L, pH 值=5. 8 ；
誘導培養(yǎng)的培養(yǎng)條件為溫度25°C，光照強度1000-2000LX，光照時間12小時/天，培養(yǎng)濕度70%-80%，培養(yǎng)周期30天；
C、增殖培養(yǎng)將誘導的不定芽接種按照每瓶接種3-4個的接種量接種于體積為50ml增殖培養(yǎng)基上進行增殖培養(yǎng)制成不定苗，25天繼代I次，連續(xù)繼代3次；
增殖培養(yǎng)培養(yǎng)基的組成為
MS+6-BA I. 5mg/L, NAA O. 2mg/L,蔗糖 28g/L,瓊脂 7g/L, pH 值=5. 8 ;
增殖培養(yǎng)的培養(yǎng)條件為溫度24-26°C，光照強度1000-2000LX，光照時間12小時/天，培養(yǎng)濕度70%-80% ；
D、生根培養(yǎng)將不定苗分切后按照每瓶接種3-4個的接種量接種于體積為50ml生根培養(yǎng)基上進行生根培養(yǎng)，14天后觀察生根情況；生根培養(yǎng)培養(yǎng)基的組成為
1/2MS+NAA O. 15 mg/L 或 1/2MS+IBA O. 25 mg/L，蔗糖 18g/L,瓊脂 6g/L，pH 值=5. 8 ;生根培養(yǎng)的培養(yǎng)條件為溫度25°C，光照強度2200-2500 Lx,光照時間10-12小時/天，培養(yǎng)濕度70%-80% ；
E、再生苗的移植
當甘藍組培苗產生根系并形成完整植株后，置于溫室中煉苗，培養(yǎng)條件為溫度25°C，3天后將三角瓶或組培瓶的瓶塞打開，7天后取出，洗去根部瓊脂，將其栽植于培養(yǎng)介質中，濕度為80%-90%，溫度20°C -23°C, 14天后定植于土壤進行正常管理。
其余內容同實施例I。實施結果在結球甘藍誘導培養(yǎng)基上子葉可長出愈傷組織，胚軸可直接分化不定芽；組培苗增殖倍數(shù)4. 2 ;組培苗生長勢強，玻璃化苗數(shù)少，增殖率高；組培苗生根率可達
100% O
權利要求
1.結球甘藍組織培養(yǎng)方法，其特征在于，包括如下工藝步驟 A、無菌苗的培養(yǎng)將去雜后選出的優(yōu)質結球甘藍種子消毒，將消毒后的種子接種于MS培養(yǎng)基中進行暗培養(yǎng)后制成無菌苗，按照48ml-52ml培養(yǎng)基接種8_10顆種子的接種量接種，培養(yǎng)溫度22°C -26°C，培養(yǎng)濕度70%-80%，培養(yǎng)周期9_12天； B、誘導培養(yǎng)將暗培養(yǎng)后的無菌苗子葉切成4mmX4mm的塊,將胚軸切成3.6-4. 2 mm,接種在誘導分化培養(yǎng)基上進行誘導培養(yǎng)，觀察外植體在誘導培養(yǎng)過程中的變化和不定芽的誘導情況；誘導分化培養(yǎng)基的組成為MS+6-BA 2. 0-3. Omg/L, NAA O. 1-0. 2mg/L,蔗糖 25_30g/L，瓊脂 6. 5_7g/L，pH 值=5. 8 ； 誘導培養(yǎng)的培養(yǎng)條件為溫度24°C _26°C，光照強度1000-2000LX，光照時間12小時/天，培養(yǎng)濕度70%-80%，培養(yǎng)周期25-35天； C、增殖培養(yǎng)將誘導的不定芽接種按照每瓶接種3-4個的接種量接種于體積為48ml-52ml增殖培養(yǎng)基上進行增殖培養(yǎng)制成不定苗，25天繼代I次，連續(xù)繼代3次； 增殖培養(yǎng)培養(yǎng)基的組成為MS+6-BA I. 0-2. Omg/L, NAA O. 1-0. 2mg/L,蔗糖 25_30g/L,瓊脂 6. 5_7g/L, pH 值=5. 8 ； 增殖培養(yǎng)的培養(yǎng)條件為溫度24V -26°C，光照強度1000-2000LX，光照時間12小時/天，培養(yǎng)濕度70%-80% ； D、生根培養(yǎng)將不定苗分切后按照每瓶接種3-4個的接種量接種于體積為48ml-52ml生根培養(yǎng)基上進行生根培養(yǎng)，14天后觀察生根情況；生根培養(yǎng)培養(yǎng)基的組成為1/2MS+NAA O. 1-0. 2mg/L 或 1/2MS+IBA O. 2-0. 3mg/L，蔗糖 15_20g/L，瓊脂 5. 5_6g/L，pH 值=5. 8 ; 生根培養(yǎng)的培養(yǎng)條件為溫度24V -26°C，光照強度2200-2500LX，光照時間10-12小時/天，培養(yǎng)濕度70%-80% ； E、再生苗的移植 當甘藍組培苗產生根系并形成完整植株后，置于溫室中煉苗，煉苗條件為溫度200C -25 V，3天后將三角瓶或組培瓶的瓶塞打開，7天后取出，洗去根部瓊脂，將其栽植于培養(yǎng)介質中，濕度為80%-90%，溫度20°C -23°C, 14天后定植于土壤進行正常管理。
2.根據權利要求I所述的結球甘藍組織培養(yǎng)方法，其特征在于，步驟A中所述的去雜是將甘藍種子在流水下沖洗，去掉雜質及灰塵。
3.根據權利要求2所述的結球甘藍組織培養(yǎng)方法，其特征在于，步驟A中所述的選出優(yōu)質結球甘藍種子的步驟為將去雜后的結球甘藍種子浸泡于水中，沉于水底的為優(yōu)質結球甘藍種子。
4.根據權利要求2所述的結球甘藍組織培養(yǎng)方法，其特征在于，步驟A中所述的消毒是將選出的優(yōu)質結球甘藍種子先用質量百分比為70%的酒精浸泡30秒，再用質量百分比為O.1%的氯化汞消毒8分鐘,然后無菌水沖洗3-4次。
5.根據權利要求I所述的結球甘藍組織培養(yǎng)方法，其特征在于，步驟A-D中所述的暗培養(yǎng)、誘導培養(yǎng)、增殖培養(yǎng)、生根培養(yǎng)過程中培養(yǎng)室每周在外界空氣質量良好情況下進行3-4小時短時通風。
全文摘要
本發(fā)明屬于組織培養(yǎng)，特別是指一種結球甘藍組織培養(yǎng)方法。包括無菌苗的培養(yǎng)、誘導培養(yǎng)、增殖培養(yǎng)、生根培養(yǎng)、再生苗的移植等工藝步驟，本發(fā)明解決了現(xiàn)有技術存在的不利于結球甘藍組培苗的繼代培養(yǎng)、長期保存及生根移栽利用等問題，具有采用本方法在結球甘藍誘導培養(yǎng)基上子葉可長出愈傷組織，胚軸可直接分化不定芽；組培苗增殖倍數(shù)3.8-4.6；組培苗生長勢強，玻璃化苗數(shù)少，增殖率高；組培苗生根率可達100%等優(yōu)點。
文檔編號A01H4/00GK102805035SQ20121030836
公開日2012年12月5日 申請日期2012年8月28日 優(yōu)先權日2012年8月28日
發(fā)明者申志彬, 申志恒, 王僧虎, 石曉云 申請人:邢臺市蔬菜種子公司