專利名稱：一種快速打破南方紅豆杉種子休眠的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于植物組織培養(yǎng)領(lǐng)域，具體涉及一種快速打破南方紅豆杉種子休眠的方法。
背景技術(shù)：
紫杉醇(Paclitaxel,商品名Taxol)是20世紀(jì)六七十年代從紅豆杉科(Taxaceae)紅豆杉屬(Taxus L.)植物樹(shù)皮中分離出來(lái)的一種天然的四環(huán)二萜類生物堿，其在治療宮頸癌、乳腺癌、小細(xì)胞肺癌、黑素瘤和結(jié)腸癌等方面有顯著的療效。紫杉醇首先在太平洋短葉紅豆杉的樹(shù)皮和形成層中提取出來(lái)。按照目前的純化技術(shù)，生產(chǎn)Ikg的紫杉醇大約需要10噸紅豆杉樹(shù)皮。這大約需要從2000到4000棵60-70年生的紅豆杉中才能獲得。據(jù)相關(guān)資料介紹，每年全球大約需要消耗250kg紫杉醇純品。這需要從250萬(wàn)千克樹(shù)皮或者75萬(wàn)棵紅豆杉中提取才能滿足這一市場(chǎng)的需要。隨著對(duì)紫杉醇需求量的日益遞增，目前僅僅從天 然的紅豆杉林樹(shù)體中提取分離紫杉醇的產(chǎn)量已經(jīng)不能滿足醫(yī)藥市場(chǎng)需要，加之大肆的開(kāi)采使紅豆杉自然資源日趨枯竭、紅豆杉資源自然更新能力差、生長(zhǎng)緩慢、瀕危滅絕，各國(guó)政府已明文規(guī)定禁止砍伐野生紅豆杉資源。因此紫杉醇其他途徑的開(kāi)發(fā)就顯得極為重要，其中利用人工栽培的紅豆杉中提取分離紫杉醇是目前獲取紫杉醇及半合成前體的一條重要途徑，這可以加強(qiáng)對(duì)紅豆杉野生種質(zhì)資源及其生態(tài)環(huán)境的保護(hù)。紅豆杉種子具有較長(zhǎng)的休眠期，采收后必須在低溫下用濕沙層積貯藏，春季播種后，其發(fā)芽期可延至第二年，紅豆杉種子的這種發(fā)芽特性嚴(yán)重影響了其種苗的生產(chǎn)。植物組織培養(yǎng)技術(shù)是一種不依賴于環(huán)境條件進(jìn)行生產(chǎn)的技術(shù)，通過(guò)紅豆杉種胚離體培養(yǎng)，即可以獲得更多的紅豆杉種苗，可以克服生產(chǎn)中種子萌發(fā)率不高的特性，也可以將種胚直接或者間接的誘導(dǎo)成細(xì)胞系生產(chǎn)紫杉醇。紅豆杉種子中含有較多抑制種子萌發(fā)的物質(zhì)。南方紅豆杉種子中含有正庚酸、壬酸、乙酸等發(fā)芽抑制物質(zhì)，其種皮、內(nèi)種皮和胚乳的浸泡液對(duì)白菜種子發(fā)芽率和幼苗的生長(zhǎng)、根生長(zhǎng)均有抑制作用，并且與浸提液濃度呈正比(張艷杰等，南方紅豆杉種子種發(fā)芽抑制物的研究，南京林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)，2007，4 (31) :51-58).成熟的種子較未成熟的種子萌發(fā)率高(Yang F, et al, In vitro embryo culture ofTaxus chinensis var. mairei, Journal of Anhui Normal University(NaturalScience), 2010, 3(33):262-269)。影響紅豆杉種胚萌發(fā)的因素很多，除了遺傳因素外，很多的環(huán)境因素如基本培養(yǎng)基種類、光照、環(huán)境溫度、適當(dāng)?shù)念A(yù)處理等。南方紅豆杉種胚離體培養(yǎng)萌發(fā)率顯著受培養(yǎng)基類型和光照的影響，在B5培養(yǎng)基上10小時(shí)的光周期種胚離體培養(yǎng)萌發(fā)率高達(dá) 96% (Yang F, et al, In vitro embryo culture of Taxus chinensis var. mairei,Journal of Anhui Normal University(Natural Science)，2010，3 (33):262-269)。云南紅豆杉種胚離體培養(yǎng)萌發(fā)率在MS培養(yǎng)基上較高，達(dá)到80%左右，胚乳可以促進(jìn)種胚的萌發(fā)，幼苗中紫杉醇含量低于成年樹(shù)皮中紫杉醇的含量(趙沛基等，云南紅豆杉離體胚的培養(yǎng)，植物生理學(xué)通訊，2003，4 (39) :327-330)。Hector等對(duì)短葉紅豆杉種胚的離體研究表明White’ s和MS培養(yǎng)基可以再離體培養(yǎng)2周后獲得70%左右的萌發(fā)率，低溫貯藏可以顯著降低短葉紅豆杉種子的萌發(fā)(Hector EF, In vitro culture and precociousgermination of Taxus embryos, In Vitro Cell. Dev. Biol. ,1991，27P:139-142)。Chee對(duì)短葉紅豆杉、東北紅豆杉、歐洲紅豆杉和歐洲紅豆杉另一個(gè)品種成熟離體胚研究表明，B5培養(yǎng)基為其萌發(fā)的最佳基本培養(yǎng)基,外源BA在低濃度處理時(shí)對(duì)種胚萌發(fā)無(wú)顯著的影響，但高濃度的 BA 抑制種胚的萌發(fā)(Chee PP, In Vitro Culture of Zygotic Embryosof Taxus Species, Hortscience, 1994，29 (6) : 695-697)。Zhiri 等利用流動(dòng)的自來(lái)水沖洗短葉紅豆杉的種子7天，在改良后的MS培養(yǎng)基上離體培養(yǎng)得到了 100%的萌發(fā)率(ZhiriA, et al, Factors affecting the in vitro rapid germination of Taxus embryos andthe evaluation of taxol content in the plantlets, Plant Cell, lissue and OrganCulture, 1994, 39:261-263)。Zarek將歐洲紅豆杉種子在4°C條件下至少浸泡48h后,分離種胚在MS培養(yǎng)(附加5g/L活性炭)離體培養(yǎng)在黑暗條件下可獲得100%的萌發(fā)率(Zarek M，A practical method for overcoming the dormancy of Taxus baccata isolated embryosunder in vitro conditions,In Vitro Cell. Dev. Biol. 2007, (43):623-630)。種胚的離體再生與增殖也受紅豆杉種類、植物激素種類和濃度、培養(yǎng)條件等因素的影響。Wann等以歐洲短葉紅豆杉成熟種胚為材料，在BLCG培養(yǎng)基上附加2mg/L的2，4-D和lmg/L的BA,6周后獲得可連續(xù)培養(yǎng)的紅豆杉胚狀體細(xì)胞(Wann. Induction ofsomatic embryo genesis in Taxus, and the production of Taxane—ring containingalkaloids therefrom, US, Patent No. 5310672, 1994-3-10)。Chee 描述了一種短葉紅豆杉種苗的方法，他將短葉紅豆杉種胚接種在1/2B5培養(yǎng)(附加IOiiM BA) 14天后再轉(zhuǎn)接到McCown’ s基本培養(yǎng)基上(附加I. 0%)的活性炭，大約有5%的外植體發(fā)生了體細(xì)胞體細(xì)胞胚胎(Chee PP, Organogenesis in Taxus brevifolia tissue cultures, Plant CellReports, 1995，14:560-565)。Chee于1996年再次建立了短葉紅豆杉未成熟種胚體細(xì)胞胚月臺(tái)發(fā)生途徑(Chee, Plant regeneration from somatic embryos of Taxus brevifolia,Plant Cell Reports, 1996,16:184-187)。Majada等建立了歐洲紅豆杉種胚離體培養(yǎng)的再生體系，他們將種胚離體接種到WP培養(yǎng)基上(附加22. 19mM的BAP，0. 5%的活性炭和2%的蔗糖)培養(yǎng)30天，在轉(zhuǎn)接到無(wú)激素培養(yǎng)基上，總共70天后可見(jiàn)到再生從芽的出現(xiàn)(MajadaJP, One step more towards taxane production through enhanced Taxus propagation,Plant Cell Reports, 2000，19:825-830)。Datta等報(bào)道了西藏紅豆杉的合子胚愈傷組織再生的研究報(bào)道，試驗(yàn)結(jié)果表明西藏紅豆杉的種胚接種到Lloyd and McCown’ s基本培養(yǎng)基，并附加SH有機(jī)物、0. 5mg/L的BA、I. 0-2. 0mg/L的2，4-D或者NAA，2個(gè)月后將愈傷組織轉(zhuǎn)接到1/2WPMSH培養(yǎng)基上并附加2. 5mg/L的BA，4個(gè)月后可以獲得再生苗(Datta MM，etal,Organogenesis and plant regeneration in Taxus wallichiana(Zucc. ),Plant CellRep, 2006，25:11 - 18)?？梢?jiàn)紅豆杉的不同種類，以及處理方法，培養(yǎng)條件等的不同都是影響其種胚萌發(fā)的重要因素。目前為止，還沒(méi)有關(guān)于快速，簡(jiǎn)便的種胚離體再生獲取南方紅豆杉種苗的方法報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種快速打破南方紅豆杉種子休眠的方法，為快速打破南方紅豆杉種子休眠，獲取整齊一致的南方紅豆杉種苗打下基礎(chǔ)。本發(fā)明的目的是通過(guò)以下方式實(shí)現(xiàn)的。一種快速打破南方紅豆杉種子休眠的方法，其特征在于，包括以下步驟(I)種子種胚的剝離將南方紅豆杉(Taxales chinensis var. mairei)種子從外種皮中剝離出來(lái)；(2)外植體消毒取步驟(I)得到的種子用70%的酒精和0. 1%的氯化汞表面消毒，再用無(wú)菌水清洗；(3)種子的預(yù)處理將步驟(2)得到的種子用無(wú)菌水浸泡1-5天； (4)種子合子胚的分離在無(wú)菌條件下剝?nèi)》N子的合子胚或帶部分胚乳組織的合子胚；(5)試管苗的誘導(dǎo)將步驟(4)剝離的合子胚或帶部分胚乳組織的合子胚接種到試管苗誘導(dǎo)培養(yǎng)基上誘導(dǎo)試管苗；誘導(dǎo)培養(yǎng)基為BLCG培養(yǎng)基(該培養(yǎng)基配方見(jiàn)Wannet al., induction of somatic embryogenisis in taxus, and the production oftaxane-ring containing alkaloids therefrom, United States Patent, US005310672A)+活性炭5g/L+蔗糖20g/L+瓊脂7g/L，培養(yǎng)基pH值5. 8 ;培養(yǎng)條件為經(jīng)過(guò)30天的暗培養(yǎng)后轉(zhuǎn)入14h光照,光照強(qiáng)度44001x和IOh暗培養(yǎng)的光周期條件下培養(yǎng),溫度均為24±1°C。所述步驟(I)中的南方紅豆杉種子為當(dāng)年生或者4°C保存1-2年的南方紅豆杉種子。所述步驟(2)清洗消毒過(guò)程具體如下先將去除外種皮的種子放入無(wú)菌的容器中，在超凈工作臺(tái)內(nèi)依次經(jīng)70%酒精消毒90s和0. 1%氯化汞消毒12min，無(wú)菌水沖洗5次后備用。所述步驟(3)種子預(yù)處理具體過(guò)程如下將去掉外種皮的種子經(jīng)過(guò)步驟(2)的表面消毒處理后，用無(wú)菌的蒸餾水在室溫條件下無(wú)菌密封浸泡1-5天。該發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)(1)外植體采集時(shí)期集中，污染率極低；(2)相比現(xiàn)有的其他種類的紅豆杉種子復(fù)雜的預(yù)處理過(guò)程，本發(fā)明針對(duì)南方紅豆杉種子的預(yù)處理過(guò)程則簡(jiǎn)單的多，而且用靜水處理可以大量節(jié)約水資源，并且適合大批量的種子處理；(3)通過(guò)一步培養(yǎng)可以獲得整齊一致的南方紅豆杉種苗；種子萌發(fā)率達(dá)到99. 9%。


圖I是采用本發(fā)明方法快速打破南方紅豆杉種子休眠的過(guò)程，其中A.紅豆杉種子及去種皮的種子；B.離體培養(yǎng)0天的紅豆杉種胚；C.離體培養(yǎng)7天的紅豆杉種胚；D.離體培養(yǎng)10天的紅豆杉種胚；E.離體培養(yǎng)15天的紅豆杉種胚；F.暗培養(yǎng)30天后轉(zhuǎn)入14h光照和IOh暗培養(yǎng)的光周期條件下培養(yǎng)10天后的試管苗。
具體實(shí)施例方式以下實(shí)施例旨在進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明，而不會(huì)限制本發(fā)明。實(shí)施例I(I)種子種胚的剝離收集當(dāng)年生的南方紅豆杉種子，使用機(jī)械結(jié)合手工方法破殼，將種子從外種皮中剝離出來(lái)；(2)外植體消毒先將去外種皮的種子放入無(wú)菌的容器中，在超凈工作臺(tái)內(nèi)經(jīng)70%酒精消毒90s和0. 1%氯化汞消毒12min，無(wú)菌水沖洗5次后備用，清洗時(shí)每次浸種5分鐘左右。(3)種子的預(yù)處理將去掉外種皮的種子經(jīng)過(guò)步驟(2)的表面消毒處理后，用無(wú)菌 的蒸餾水在室溫條件下密封浸泡3-5天。(4)種子合子胚的分離在無(wú)菌條件下剝?nèi)》N子的合子胚或帶少量胚乳組織，其他部分棄除；(5)試管苗的誘導(dǎo)將剝離的種胚接種到誘導(dǎo)培養(yǎng)基上進(jìn)行誘導(dǎo)，誘導(dǎo)培養(yǎng)基為BLCG培養(yǎng)基+活性炭5g/L+蔗糖20g/L+瓊脂7g/L，培養(yǎng)基pH值5. 8 ;培養(yǎng)溫度為24± 1°C，經(jīng)過(guò)30天的暗培養(yǎng)后將離體培養(yǎng)的種胚轉(zhuǎn)入14h光照(光照強(qiáng)度44001x)和IOh暗培養(yǎng)的光周期條件下培養(yǎng)10天，即可獲得健壯的試管苗。種子萌發(fā)率達(dá)到99. 9%。
權(quán)利要求
1.一種快速打破南方紅豆杉種子休眠的方法，其特征在于，包括以下步驟 (1)種子種胚的剝離將南方紅豆杉(Taxaleschinensis var. mairei)種子從外種皮中剝離出來(lái)； (2)外植體消毒取步驟(I)得到的種子用70%的酒精和O.1%的氯化汞表面消毒，再用無(wú)菌水清洗； (3)種子的預(yù)處理將步驟(2)得到的種子用無(wú)菌水浸泡1-5天； (4)種子合子胚的分離在無(wú)菌條件下剝?nèi)》N子的合子胚或帶部分胚乳組織的合子胚； (5)試管苗的誘導(dǎo)將步驟(4)剝離的合子胚或帶部分胚乳組織的合子胚接種到試管苗誘導(dǎo)培養(yǎng)基上誘導(dǎo)試管苗；誘導(dǎo)培養(yǎng)基為=BLCG培養(yǎng)基+活性炭5g/L+蔗糖20g/L+瓊脂7g/L，培養(yǎng)基pH值5. 8 ;培養(yǎng)條件為經(jīng)過(guò)30天的暗培養(yǎng)后轉(zhuǎn)入14h光照，光照強(qiáng)度為44001x和IOh暗培養(yǎng)的光周期條件下培養(yǎng)，溫度均為24±1°C。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于， 所述步驟(I)中的南方紅豆杉種子為當(dāng)年生或者4°C保存1-2年的南方紅豆杉種子。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于， 所述步驟(2)清洗消毒過(guò)程具體如下先將去除外種皮的種子放入無(wú)菌的容器中，在超凈工作臺(tái)內(nèi)依次經(jīng)70%酒精消毒90s和O. 1%氯化汞消毒12min，無(wú)菌水沖洗5次后備用。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于， 所述步驟(3)種子預(yù)處理具體過(guò)程如下將去掉外種皮的種子經(jīng)過(guò)步驟(2)的表面消毒處理后，用無(wú)菌的蒸餾水在室溫條件下無(wú)菌密封浸泡1-5天。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種快速打破南方紅豆杉種子休眠的方法。包括(1)種子外種皮剝離利用機(jī)械破殼，手工剝離外種皮；(2)外植體消毒依次經(jīng)70%酒精消毒90s和0.1%氯化汞消毒12min，無(wú)菌水沖洗5次后備用；(3)種子預(yù)處理用無(wú)菌水密封常溫浸種1-5天；(4)分離合子胚；(5)試管苗的離體培養(yǎng)將種胚接種到試管苗誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，可以獲得99.9%的種子萌發(fā)率。本發(fā)明提供了一種簡(jiǎn)便、快速打破南方紅豆杉種子休眠的方法，為獲取整齊一致的南方紅豆杉種苗打下基礎(chǔ)，能節(jié)省大量的人力、物力、提高勞動(dòng)效率。
文檔編號(hào)A01H4/00GK102726292SQ201210201360
公開(kāi)日2012年10月17日 申請(qǐng)日期2012年6月19日 優(yōu)先權(quán)日2012年6月19日
發(fā)明者張家銀, 李炎林, 熊興耀, 石夢(mèng)蝶, 秦宇 申請(qǐng)人:湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)