專利名稱：一種甘藍型油菜耐濕性改良的方法
技術領域：
本發(fā)明屬于油菜品質(zhì)育種和油菜轉(zhuǎn)基因育種領域，更具體涉及一種甘藍型油菜耐濕性改良的方法，它適用于一種甘藍型油菜耐濕性育種。
背景技術：
土壤水分長時間處于飽和狀態(tài)會極大影響作物生長。長江流域是中國油菜主要產(chǎn)區(qū)，約占全國油菜產(chǎn)量的3/4，但該區(qū)域雨水偏多，常超過油菜正常需水量，加之該地區(qū)油菜生產(chǎn)主要采用水旱輪作尤其是稻茬免耕的種植模式，土壤黏重，透氣性差，排水困難，地下水位高，因此極易產(chǎn)生濕(潰)害，影響油菜正常生長，導致產(chǎn)量下降。前人研究表明，油菜在濕害脅迫下，株高、莖粗、根粗、根長、綠葉數(shù)、葉面積、干重等均明顯降低，有效分枝數(shù)、單株角果數(shù)和粒數(shù)大幅下降，油菜因此可能減產(chǎn)17%-42.4% (Zhouff J, LinXQ(1995)Effects of waterlogging at different growth stages on physiologicalcharacteristics and seed yield of winter rape(Brassica napus L·)· Field CropsResearch, 44:103-110;Gutierrez B F H, Lavado R S,Porcelli C A(1996)Note on theeffects of winter and spring waterlogging on growth, chemical compositionand yield ofrapeseed. Field Crops Research, 47:175-179;Leul M, Zhou W J(1998)Alleviation of waterlogging damage in winter rape by application of uniconazoleeffects on morphological characteristics, hormones and photosynthesis.FieldCrops Research, 59:121-127)。為減輕油菜濕害帶來的產(chǎn)量損失，生產(chǎn)上一般采用開溝排水降低地下水位、土壤翻耕和中耕等農(nóng)藝措施，但需要花費大量的勞動成本，隨著以直播免耕為主的油菜輕簡化栽培技術大力推廣，為降低油菜生產(chǎn)成本，選育耐濕強的直播油菜品種成為重要的育種目標之一。傳統(tǒng)耐濕性育種依賴于準確可靠的耐濕性評價方法及鑒定指標，以分子標記輔助選擇為基礎的耐濕性育種依賴于耐濕性狀的深入研究，包括耐濕性狀遺傳模式分析、定位群體構(gòu)建、分子標記篩選、QTL定位、QTL克隆、候選基因功能分析及耐濕基因應用等。隨著現(xiàn)代農(nóng)業(yè)對油菜品種的要求的多元化，油菜耐濕性育種將成為研究熱點，但是目前油菜耐濕性研究還遠遠不夠，油菜耐濕性育種依然面臨諸多困境，比如發(fā)芽期鑒定油菜耐濕性是否準確，耐濕性鑒定成本較大，QTL定位是否準確，分子標記能否利用等等。轉(zhuǎn)基因技術是現(xiàn)代生物技術的核心，運用該技術能夠培育抗病蟲、抗逆、優(yōu)質(zhì)、高產(chǎn)、高效等新品種。抗病、抗蟲性育種方面，菲律賓國際水稻研究所，已育成一批抗稻瘟病、病毒病、白葉枯病、稻飛虱、稻葉蟬和二化螟等多抗品種，如IR36、IR64，美國孟山都公司通過轉(zhuǎn)基因方法育成抗蟲、抗旱和抗草胺磷玉米品種，我國廣東育成的窄葉青水稻品種高抗稻瘟病，中國農(nóng)科院利用轉(zhuǎn)基因技術育成抗棉鈴蟲棉花品種。品質(zhì)育種方面，美國培育出玉米品種“U-24”，蛋白質(zhì)含量高達20%，賴氨酸含量達5%，菲律賓國際水稻研究所育成IR20、 IR22、IR24等一批高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)品種，蛋白質(zhì)含量比一般品種提高2%，浙江省農(nóng)業(yè)科學院應用反義PEP轉(zhuǎn)基因技術育成雙低、高油油菜新品系超油I號(47.4%)、超油2號(52. 82%)。傳統(tǒng)雜交育種技術只能在相同生物物種內(nèi)進行基因轉(zhuǎn)移，轉(zhuǎn)基因技術則不受生物物種生殖隔離限制，可以在不同物種間轉(zhuǎn)移基因，因此可以借助其他物種的某些特殊基因來改良農(nóng)作物的品質(zhì)，比如將魚的抗寒蛋白基因轉(zhuǎn)到農(nóng)作物中提高抗寒性。透明顫菌血紅蛋白(Vitreoscilla hemoglobin, VHb)是在透明顫菌屬(Vitreoscilla sp. Cl)中產(chǎn)生的一種可溶性血紅蛋白。研究顯示，vgb (編碼透明顫菌血紅蛋白的基因)的表達能增強植株耐濕性。Ma o等(2003)通過農(nóng)桿菌介導方法將vgb轉(zhuǎn)化到矮牽牛中，在大田條件下種植鑒定了轉(zhuǎn)基因的矮牽牛植株，發(fā)現(xiàn)這些植株顯示出了明顯的耐 勞性(Mao Ζ, Hu Y. Zhong J, Wang L, Guo J and Lin Z (2003) Improvement of hydroponicgrowth and water tolerance of Petunia by the introduction of vhb gene. ActaBotanica Sinica 45:205-210) 等(2005)用下胚軸和子葉柄作為浸染外植體，運用農(nóng)桿菌介導法將vgb轉(zhuǎn)移到卷心菜(Brassica oleracea var. Cabitata)中，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因種子比野生對照發(fā)芽快，并且轉(zhuǎn)基因植株在持續(xù)淹水處理下顯示一定忍耐力(Li X, Peng RH, FanHQ, Xiaong AS, Yao QH, Cheng ZM, Li Y(2005)Vitreoscilla hemoglobin overexpressionincreases submergence tolerance in cabbage. Plant Cell Rep 23:710-715)。李義良等(2009)對導入vgb的銀腺雜種楊進行耐 勞性鑒定，結(jié)果表明，淹水脅迫下vgb的表達增強了銀腺雜種楊葉綠素含量的積累，進而促進了轉(zhuǎn)基因植株的生長，提高了轉(zhuǎn)基因株系對淹水環(huán)境的忍受能力(李義良，蘇曉華，張冰玉，黃秦軍，張香華.轉(zhuǎn)vgb銀腺雜種楊的耐澇性·林業(yè)科學，2009, 45(7) :26-31)。Zelasco等(2006)將vgb轉(zhuǎn)到白楊樹中發(fā)現(xiàn)，植株生長、生物總量、淹水忍耐力和氧化壓力、亞硝基應激壓力的忍耐力不完全依賴VHb的特殊功能,于是認為轉(zhuǎn)基因楊樹中vgb表達的影響并不確定(Zelasco S，ReggiS，Calligari P, Balestrazzi A, Bongiorni C，Quattrini E, Delia G, Bisoffi S，F(xiàn)ogherC, Confalonieri M(2006)Expression of the Vitresocilla hemoglobin (VHb) encodinggene in transgenic white poplar:plant growth and biomass production, biochemicalcharacterization and cell survival under submergence, oxidative and nitrosativestress conditions. Mol Breed 17:201-216),因此vgb表達能否增強其他植物(包括油菜)的耐濕性還有待進一步研究。盡管譚小力等曾將藍細菌血紅蛋白基因轉(zhuǎn)入到甘藍型油菜中(譚小力，孔凡明，張麗麗，李娟，陳松，戚存扣.藍細菌血紅蛋白基因的克隆及其向甘藍型油菜中的轉(zhuǎn)化.作物學報，2009，35(1) :66-70)，但并沒有證實該基因能提高甘藍型油菜耐濕性。目前國內(nèi)外還沒有vgb轉(zhuǎn)入甘藍型油菜方面的報道。鑒于油菜耐濕性研究現(xiàn)狀及vgb在其他植物中的表達情況，我們通過農(nóng)桿菌介導法將vgb轉(zhuǎn)入甘藍型油菜R2 (見遺傳資源表)中，對獲得的轉(zhuǎn)基因材料進行分析，結(jié)果證實vgb能明顯提高耐濕性，從而開發(fā)出一種甘藍型油菜耐濕性改良方法，可用于甘藍型油菜耐濕性育種。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的在于提供了一種甘藍型油菜耐濕性改良的方法，方法易行，操作簡便，效果明顯，操作簡便。通過該方法能避開傳統(tǒng)甘藍型油菜耐濕性育種所需的復雜步驟，因而能夠降低成本，縮短育種進程。為了實現(xiàn)上述的，本發(fā)明采用以下技術措施
通過在甘藍型油菜中導入外源基因Vgb可以提高甘藍型油菜耐濕性。通過構(gòu)建含NPT II (卡那霉素抗性基因)表達元件、Bar (草胺膦抗性基因)表達元件和外源基因vgb (編碼透明顫菌血紅蛋白的基因)的表達載體將vgb導入甘藍型油菜可以獲得抗草胺磷耐濕甘藍型油菜恢復系、保持系和不育系，從而實現(xiàn)甘藍型耐濕油菜三系配套。一種甘藍型油菜耐濕性改良的方法，其步驟是A、含Vgb的抗草胺磷表達載體的構(gòu)建I.片段獲得以NCBI網(wǎng)站上公布的序列(Genebank編號GBEU363512. I)為模板設計引物，以質(zhì)粒DNA (pPZV，見遺傳資源表)為底物進行PCR擴增；2. PCR產(chǎn)物回收、轉(zhuǎn)化及測序回收PCR擴增片斷，將片段連入Simple-T vecter(TRANSGENE)中，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a (從北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司購買)感受 態(tài)細胞，通過籃白斑篩選獲得陽性單克隆，挑選陽性克隆，繁殖菌液，送樣測序；3. T-DNA制備與NCBI網(wǎng)站上公布的vgb序列的編碼區(qū)做比較，挑選沒有堿基差異的陽性單克隆菌液，抽取質(zhì)粒DNA，雙酶切后回收酶切片段得到T-DNA。4. Vector制備繁殖大腸桿菌DH5a菌液(P-BAR-F3，含NPT II表達元件和Bar表達元件，見遺傳資源表)，抽取質(zhì)粒DNA，雙酶切后回收酶切片段得到Vector ；5.表達載體制備連接步驟3得到的T-DNA和步驟4得到的Vector,轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 a感受態(tài)細胞(從北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司購買)，挑取單克隆，繁殖菌液，抽取質(zhì)粒DNA ；6.農(nóng)桿菌菌液制備將步驟5得到的質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌LBA4404感受態(tài)細胞(從北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司購買)，挑取單克隆，繁殖菌液，即得到后續(xù)工作中所需要的包含NPT II表達元件、Bar表達元件和vgb的農(nóng)桿菌菌液。B、抗草胺磷耐濕甘藍型油菜恢復系的獲得通過農(nóng)桿菌介導法將vgb轉(zhuǎn)化到R2 (見遺傳資源表)或R6 (見遺傳資源表)中得到T。代植株；室內(nèi)分子標記(vhb5’ 5’CATCATCAAAGCCACTGTTCC3’ ；vhb3’ : 5’ GCAATCACGCCATAAGCCT3’ )鑒定或田間草胺磷鑒定得到陽性單株，自交得到T1代；室內(nèi)功能鑒定后得到具有耐濕功能的T1代單株，自交得到T2代；室內(nèi)分子標記鑒定或田間草胺磷鑒定獲得vgb位點純合的抗草胺磷耐濕甘藍型油菜恢復系。C、抗草胺磷耐濕甘藍型油菜保持系的獲得在農(nóng)桿菌介導法轉(zhuǎn)化效率足夠及人手充足的情況下優(yōu)先采用途徑(a)，或在途徑Ca)無法實施的情況下采用途徑(b)(a)通過農(nóng)桿菌介導法將vgb轉(zhuǎn)化到甘藍型油菜6098B (見遺傳資源表)或8908B(見遺傳資源表)得到Ttl代植株；室內(nèi)分子標記鑒定或田間草胺磷鑒定得到陽性單株，自交得到T1代；室內(nèi)功能鑒定后得到具有耐濕功能的T1代單株，自交得到T2代；室內(nèi)分子標記鑒定或田間草胺磷鑒定獲得vgb位點純合的抗草胺磷耐濕甘藍型油菜保持系。(b)以步驟B中得到的具有耐濕功能的T1代恢復系單株為父本與6098B或8908B雜交得到F1代，再以6098B或8908B為輪回親本，回交至BC3代時可得到具有絕大部分保持系遺傳背景的甘藍型油菜，田間草胺磷篩選、考察中選單株表型、室內(nèi)分析中選單株遺傳背景后選出部分優(yōu)良單株自交并與6098A或8908A雜交，觀察后代育性分離情況，結(jié)合室內(nèi)品質(zhì)分析結(jié)果選出vgb位點雜合的優(yōu)良T1代保持系單株；對T1代保持系單株自交得到的T2代保持系株系進行室內(nèi)分子標記鑒定或田間抗草胺磷鑒定得到vgb位點純合的抗草胺磷耐濕甘藍型油菜保持系。D、抗草胺磷耐濕甘藍型油菜不育系的獲得將步驟C中得到的vgb位點純合的抗草胺磷耐濕甘藍型油菜保持系與6098A或8908A雜交即得到vgb位點純合的抗草胺磷耐濕甘藍型油菜不育系。本發(fā)明與現(xiàn)有技術相比，具有以下優(yōu)點和效果本發(fā)明通過構(gòu)建含NPT II表達元件、Bar表達元件和基因vgb的表達載體，采用農(nóng)桿菌介導法將vgb導入到甘藍型油菜R2 (或R6)、6098B (或8908B)和6098A (或8908A)中，獲得抗草胺磷耐濕甘藍型油菜恢復系、保持系和不育系，從而實現(xiàn)甘藍型耐濕油菜三系配套。傳統(tǒng)甘藍型油菜耐濕育種需要一系列復雜過程(包括耐濕性狀遺傳模式分析、定位群體構(gòu)建、分子標記篩選、QTL定位、QTL克隆、候選基因功能分析及耐濕基因應用等)，耗時長、人 力及經(jīng)濟成本大而且研究結(jié)果具有不確定性。在甘藍型油菜中導入vgb能提高甘藍型耐濕性，該方法易操作，效果明顯，因此能用于甘藍型油菜耐濕性育種。通過本發(fā)明提供的方法完成甘藍型耐濕油菜三系配套只需5或6年時間，能極大縮短育種進程并降低成本。


圖I為一種抗草胺磷耐濕甘藍型油菜三系選育路線示意2為一種引物vhb5’ /vhb3’在vgb/R2_②的Tl代群體中的擴增結(jié)果示意圖。第一排共46個泳道，I 45為T1代群體，46為DL2000 Marker (從下至上共7條帶，依次為 100bp、250bp、500bp、750bp、1000bp、1600bp、2000bp);第二排共 43 個泳道，I 39為T1代群體，40、41、42為:陰性對照R2、陽性對照pPZV、空白對照ddH20，43為DL2000Marker (同上)，有帶無帶=3:1，表明vgb已經(jīng)以單拷貝的形式插入到受體材料基因組中圖3為一種引物vhb5’/vhb3’在①_3 (a)和②-10(b)中的擴增結(jié)果示意圖。圖a共29個泳道，I 25為T2代群體，26、27、28、29為陰性對照R2、陽性對照pPZV、空白對照ddH20和DL2000 Marker (同上)，圖b與圖a相同,表明已經(jīng)得到vgb穩(wěn)定遺傳的轉(zhuǎn)基因材料圖4為一種轉(zhuǎn)基因植株的RT-PCR分析示意圖。從左至右共有6個泳道，依次為DL2000 Marker (同上)、ddH20、pPZV、R2、①_3、②-10，表明vgb能在①-3和②-10中正常表達圖5為一種恢復生長8天(a)、ll天(b)、14天(c)和20天(d)時對照材料(左)、①-3 (中)和②-10 (右)的生長情況示意圖，表明①-3和②-10在淹水處理結(jié)束后顯示出更強的恢復生長的能力(與對照相比)圖6為一種不同淹水時間(21h、24h、27h)處理下幼苗的發(fā)芽情況示意圖，表明①-3和②-10在淹水處理結(jié)束后發(fā)芽更快(與對照相比)
具體實施例方式實施實例根據(jù)圖I可知，對本發(fā)明做進一步詳細描述。一種甘藍型油菜耐濕性改良的方法，具體步驟為
A、構(gòu)建含NPT II (卡那霉素抗性基因)表達元件、Bar (草胺膦抗性基因)表達元件和目的基因vgb (編碼透明顫菌血紅蛋白的基因)的表達載體I.以NCBI網(wǎng)站上公布的vgb序列(Genebank編號GBEU363512. I)為模板設計引物(正向引物5’ GACGAGCTCATGTTAGACCAGCAAACCAT3’ ；反向引物5’GACATCTAGATTAITCAACCGCTTGAGCGT3’)，以質(zhì)粒 DNA (pPZV,見遺傳資源表)為底物進行PCR擴增。PCR 反應體系總體積為 50iiL，其中含 5iiL 底物 DNA (50ng/iiL)，5iiL IOXTaqBuffer (含 Mg2+)，liiL dNTPs (10mmol/L), IU EX-Taq DNA 聚合酶(TaKaRa)，正向及反向引物各IOOng,不足部分用ddH20補足。 PCR 循環(huán)參數(shù)為94°C (3min) ；94°C (30s)，61°C (45s), 72 °C (45s)，共計 2 個循環(huán)-,1 TC (5min) ;72°C延伸 IOmin ;然后 4°C保存。2. PCR產(chǎn)物回收、轉(zhuǎn)化及測序使用E. Z. N. A GEL extraction kit試劑盒回收目標片斷，用Simple-T vecter試劑盒(TRANSGENE)連接后于16°C放置2h，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 a感受態(tài)細胞(從北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司購買)，通過籃白斑篩選獲得陽性單克隆，挑選10-12個陽性克隆繁殖后，送樣測序。3. T-DNA制備與NCBI網(wǎng)上公布的vgb序列的編碼區(qū)做比較，挑選沒有堿基差異的陽性單克隆菌液，抽取質(zhì)粒DNA，用Xbal和Sac I (Ferments)進行雙酶切，用E. Z. N. AGELextraction kit試劑盒回收酶切片段(命名為T-DNA)。雙酶切體系總體積為60 U L，Xbal和Sac I各3 U L，回收片段30 U L，TangoBuffer 6iiL,不足部分用ddH20補足。4. Vector制備繁殖菌液(P-BAR-F3，含在細菌中表達的NPT II表達元件和在植物中表達的Bar表達元件,見遺傳資源表),抽取質(zhì)粒DNA,用Xbal和Sac I (Ferments)進行雙酶切，用E.Z.N.A GEL extraction kit試劑盒回收酶切片段(命名為Vector)。雙酶切體系總體積為60 U L, Xbal和Sac I各3 U L,質(zhì)粒DNA20 U L, TangoBuffer 6iiL,不足部分用ddH20補足。5.表達載體制備連接步驟3得到的T-DNA和步驟4得到的Vector,轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 a感受態(tài)細胞(從北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司購買)，挑取單克隆，繁殖菌液，抽取質(zhì)粒DNA。連接體系總體積為IOii L，6ii LT-DNA，I ii LVector，0. LT4Ligase(Ferments), I u LT4Ligase Buffer (Ferments),不足部分用 ddH20 補足。6.農(nóng)桿菌菌液制備將Iug質(zhì)粒DNA (即步驟5得到的質(zhì)粒DNA)和IOOul農(nóng)桿菌LBA4404感受態(tài)細胞(從北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司購買)混合于I. 5mL無菌離心管中，混勾后迅速直于液氣中，然后將尚心管放入37 C水浴鍋中溫育5min,溫育結(jié)束后在無菌環(huán)境下往離心管中加入900 u L液體LB培養(yǎng)基，28或29或30°C 200rpm振蕩孵育2h，離心收集菌體，再加100 u L液體LB培養(yǎng)基混勻，均勻涂布于固體LB培養(yǎng)基(含50mg/mL卡那霉素)上，2或3天后挑取單克隆，繁殖菌液，即得到后續(xù)工作中所需要的包含NPT II表達元件、Bar表達元件和目的基因vgb的農(nóng)桿菌菌液。B、選育抗草胺磷耐濕甘藍型油菜恢復系以得到的包含NPT II表達元件、Bar表達元件和目的基因vgb的農(nóng)桿菌菌液為基礎配制浸染菌液，用農(nóng)桿菌介導法將Vgb轉(zhuǎn)化到R2 (見遺傳資源表)或R6 (見遺傳資源表)中得到 Ttl 代植株；室內(nèi)分子標記(vhb5’ 5’ CATCATCAAAGCCACTGTTCC3’ ；vhb3’ : 5’ GCAATCACGCCATAAGCCT3’ )鑒定或田間草胺磷鑒定得到陽性單株，自交得到T1代；室內(nèi)功能鑒定后得到具有耐濕功能的T1代單株，自交得到T2代；室內(nèi)分子標記鑒定或田間草胺磷鑒定獲得vgb位點純合的抗草胺磷耐濕甘藍型油菜恢復系。農(nóng)桿菌介導轉(zhuǎn)化過程選取籽粒飽滿的甘藍型油菜種子(R2或R6),消毒后[70%(酒精的體積和水的體積之比)酒精60s、0. 1% (氯化高汞的質(zhì)量和水的體積之比)升汞15min、無菌水洗3次]植入LO培養(yǎng)基上(1/2XMS，PH=5. 85)生長4或5天(25°C、光16h/暗8h)，切下長約0. 7_左右的莖段(即下胚軸)作為外植體。將外植體置于浸染菌液(將步驟A-6中得到農(nóng)桿菌菌液離心收集菌體，于1/2 XMS中稀釋至OD6qq=O. 08 0. 10，PH=5. 4)中，室溫(20 - 25°C，上下相同)浸染5或6或7或8或9或lOmin，其間輕輕搖動，然后在無菌吸水紙上吸干菌液，轉(zhuǎn)至 LI 培養(yǎng)基上(1XMS+Img/L2，4-D+O. 2mg/L 6-BA，PH=5. 85)，22°C暗培養(yǎng)2或3天，然后在L2培養(yǎng)基上(1XMS+4. 5mg/L 6_BA+5mg/L AgN03+500mg/L羧芐青霉素， PH=5. 85)延遲培養(yǎng)5或6或7天(25°C、光16h/暗8h)，再轉(zhuǎn)到L3培養(yǎng)基上(1XMS+4. 5mg/L 6-BA+5mg/LAgN03+500mg/L 羧芐青霉素 +10mg/L 草銨膦，PH=5. 85)培養(yǎng) 3 或 4 周(25°C、光16h/暗8h)，切下綠苗，植入L4培養(yǎng)基中(1XMS+0. 2mg/L NAA+300mg/L羧芐青霉素，PH=5. 85)培養(yǎng)2或3周(25°C、光16h/暗8h)，待形成完整植株時，煉苗后移栽至花盤中遮蔭保濕培養(yǎng)。C、選育抗草胺磷耐濕甘藍型油菜保持系在農(nóng)桿菌介導法轉(zhuǎn)化效率足夠及人手充足的情況下優(yōu)先采用途徑(a)，或在途徑Ca)無法實施的情況下采用途徑(b)(a)以得到的包含NPT II表達元件、Bar表達元件和基因vgb的農(nóng)桿菌菌液作為浸染菌液，用農(nóng)桿菌介導法(方法同上)將vgb轉(zhuǎn)化到甘藍型油菜6098B (見遺傳資源表)或8908B(見遺傳資源表)得到Ttl代植株；室內(nèi)分子標記鑒定或田間草胺磷鑒定得到陽性單株，自交得到T1代；室內(nèi)功能鑒定后得到具有耐濕功能的T1代單株，自交得到T2代；室內(nèi)分子標記鑒定或田間草胺磷鑒定獲得vgb位點純合的抗草胺磷耐濕甘藍型油菜保持系。(b)以步驟B中得到的具有耐濕功能的T1代恢復系單株為父本與6098B或8908B雜交得到F1代，F(xiàn)1代田間草胺磷篩選、考察中選單株表型、室內(nèi)分析中選單株遺傳背景后得到成功導入vgb的、具有部分保持系遺傳背景的甘藍型油菜，選出部分單株作為母本與非轉(zhuǎn)基因保持系雜交得到BC1R AC1代田間草胺磷篩選、考察中選單株表型、室內(nèi)分析中選單株遺傳背景后得到保留vgb的、具有部分保持系遺傳背景的甘藍型油菜，選出部分單株作為母本與非轉(zhuǎn)基因保持系雜交得到BC2代；BC2代田間草胺磷篩選、考察中選單株表型、室內(nèi)分析中選單株遺傳背景后得到保留vgb的、具有大部分保持系遺傳背景的甘藍型油菜，選出部分單株作為母本與非轉(zhuǎn)基因保持系雜交得到BC3代；BC3代田間草胺磷篩選、考察中選單株表型、室內(nèi)分析中選單株遺傳背景后得到具有絕大部分保持系遺傳背景的甘藍型油菜，選出部分優(yōu)良單株自交并與6098A或8908A雜交，觀察后代育性分離情況，結(jié)合室內(nèi)品質(zhì)分析結(jié)果選出vgb位點雜合的優(yōu)良T1代保持系單株；對T1代保持系單株自交得到的T2代保持系株系進行室內(nèi)分子標記鑒定或田間抗草胺磷鑒定得到vgb位點純合的抗草胺磷耐濕甘藍型油菜保持系。
D、選育抗草胺磷耐濕甘藍型油菜不育系 將步驟C中得到的vgb位點純合的抗草胺磷耐濕甘藍型油菜保持系與6098A或8908A雜交即得到vgb位點純合的抗草胺磷耐濕甘藍型油菜不育系。
權(quán)利要求
1.一種甘藍型油菜耐濕性改良的方法，其步驟是 A、含vgb的抗草胺磷表達載體的構(gòu)建 (O目的片段獲得以NCBI網(wǎng)站上公布的序列為模板設計引物，以質(zhì)粒DNA為底物進行PCR擴增； (2)PCR產(chǎn)物回收、轉(zhuǎn)化及測序回收PCR擴增片斷，將片段連入Simple-T vecter中，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α感受態(tài)細胞，通過籃白斑篩選獲得陽性單克隆，挑選陽性克隆，繁殖菌液,送樣測序； (3)T-DNA制備與NCBI網(wǎng)站上公布的vgb序列的編碼區(qū)做比較，挑選沒有堿基差異的陽性單克隆菌液，抽取質(zhì)粒DNA，雙酶切后回收酶切片段得到T-DNA ； (4)Vector制備繁殖菌液包含NPTII表達元件、Bar表達元件的大腸桿菌菌液，抽取質(zhì)粒DNA，雙酶切后回收酶切片段得到Vector ； (5)表達載體制備連接步驟(3)得到的T-DNA和步驟(4)得到的Vector,轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α感受態(tài)細胞，挑取單克隆，繁殖菌液，抽取質(zhì)粒DNA ； (6)農(nóng)桿菌菌液制備將步驟(5)得到的質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌LBA4404感受態(tài)細胞，挑取單克隆，繁殖菌液，即得到后續(xù)工作中所需要的包含NPT II表達元件、Bar表達元件和vgb的農(nóng)桿菌菌液； B、抗草胺磷耐濕甘藍型油菜恢復系的獲得 通過農(nóng)桿菌介導法將vgb轉(zhuǎn)化到R2或R6中得到Ttl代植株；室內(nèi)分子標vhb5’ /vhb3’ 5’GCAATCACGCCATAAGCCT3’鑒定或田間草胺磷鑒定得到陽性單株，自交得到T1代；室內(nèi)功能鑒定后得到T1代單株，自交得到T2代；室內(nèi)分子標記鑒定或田間草胺磷鑒定獲得vgb位點純合的抗草胺磷耐濕甘藍型油菜恢復系； C、抗草胺磷耐濕甘藍型油菜保持系的獲得 在農(nóng)桿菌介導法轉(zhuǎn)化效率足夠及人手充足的情況下采用途徑(a)，或在途徑(a)無法實施的情況下采用途徑(b): (a)通過農(nóng)桿菌介導法將vgb轉(zhuǎn)化到甘藍型油菜6098B或8908B得到Ttl代植株；室內(nèi)分子標記鑒定或田間草胺磷鑒定得到陽性單株，自交得到T1代；室內(nèi)功能鑒定后得到T1代單株，自交得到T2代；室內(nèi)分子標記鑒定或田間草胺磷鑒定獲得vgb位點純合的抗草胺磷耐濕甘藍型油菜保持系； (b)以步驟B中得到T1代恢復系單株為父本與6098B或8908B雜交得到F1代，再以6098B或8908B為輪回親本，回交至BC3代時得到保持系遺傳背景的甘藍型油菜，田間草胺磷篩選、考察中選單株表型、室內(nèi)分析中選單株遺傳背景后選出單株自交并與6098A或8908A雜交，觀察后代育性分離情況，結(jié)合室內(nèi)品質(zhì)分析結(jié)果選出vgb位點雜合的優(yōu)良T1代保持系單株；對自交得到的T2代保持系株系進行室內(nèi)分子標記鑒定或田間抗草胺磷鑒定得到vgb位點純合的抗草胺磷耐濕甘藍型油菜保持系； D、抗草胺磷耐濕甘藍型油菜不育系的獲得 將步驟C中得到的vgb位點純合的抗草胺磷耐濕甘藍型油菜保持系與6098A或8908A雜交得到vgb位點純合的抗草胺磷耐濕甘藍型油菜不育系。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種甘藍型油菜耐濕性改良的方法，其步驟A、構(gòu)建含vgb的抗草胺磷表達載體(1)目的片段獲得；(2)PCR產(chǎn)物回收、轉(zhuǎn)化及測序；(3)T-DNA制備；(4)Vector制備；(5)表達載體制備；(6)農(nóng)桿菌菌液制備；B、選育耐濕甘藍型油菜恢復系通過農(nóng)桿菌介導法將vgb轉(zhuǎn)到R2中得到T0代恢復系，連續(xù)自交后得到T2代恢復系；C、選育耐濕甘藍型油菜保持系(a)通過農(nóng)桿菌介導法將vgb轉(zhuǎn)到6098B中得到T0代保持系，再自交得到T2代保持系；(b)以得到的T1代恢復系單株為父本與6098B雜交，再以6098B為輪回親本連續(xù)回交得到BC3代，再自交得到T2代保持系；D、獲得耐濕甘藍型油菜不育系。方法易行，操作簡便，效果明顯，能夠降低成本并縮短育種進程。
文檔編號A01H1/02GK102676576SQ201210142130
公開日2012年9月19日 申請日期2012年5月9日 優(yōu)先權(quán)日2012年5月9日
發(fā)明者付麗, 劉佳, 徐育松, 李云昌, 李曉琴, 李英德, 梅德圣, 胡瓊, 陳玉峰 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學院油料作物研究所